专利名称：Glp－1或类似物在中风治疗中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过控制高血糖来降低中风后死亡率和发病率的方法和组合物。该方法和组合物特别可用于非胰岛素依赖性糖尿病患者，他们面临新的中风危险，或者具有进行性或复发性中风。既治愈已有的高血糖，也预防新出现的高血糖。
背景技术：
明显的糖尿病患者或葡萄糖耐受性降低的患者的心血管疾病的发病率和死亡率高于没有这些病症的患者。糖尿病患者占因怀疑为心肌梗塞而收入冠状医疗单位的患者总数的24％，而他们仅占总人口的约5％(Fuller，1993)。患有心肌梗塞的糖尿病患者的入院死亡率是非糖尿病患者的两倍(Hamsten，1994，Malmberg and Ryden，1988)。糖尿病患者在急性发作后的恢复阶段的发病率和死亡率都高于其它阶段；这主要是由致命性再梗塞和充血性心力衰竭所引起的(Stone，1989，Karlson，1993，Barbash，1993)。尽管急性心肌梗塞后发病和死亡的发生率降低了，中风后糖尿病患者与非糖尿病患者之间的死亡率和发病率差异仍持续存在(Granger，1993，Grines，1993)。
糖尿病患者发生中风的危险已知也显著升高了。男性非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)患者和NIDDM女性发生中风的危险分别比相应的非糖尿病患者高约三倍和五倍(Lehto，1966)。在芬兰进行的另一项研究中，患有早期糖尿病的男性死于中风的危险升高了六倍，而发展为糖尿病的男性在随访过程中的相对危险为1.7。女性各自的相对危险为8.2和3.7(Tuomilehto，1996)。而且，另有研究证明，轻微的和未被确认的高血糖是急性中风的危险因素，与HbA1无关的血糖值升高患者的累积死亡率上升了，HbA1是反映长期血糖控制的数值(Gray，1987)。
其它研究也已证明了高血糖对中风后果的恶性影响(Cazzato，1991，Kiers，1992，deFalco，1993，Moulin，1997，Weir，1997)。中风过程中应激性激素反应强度显著促进高血糖的形成(O’Neill，1992)，但是高血糖本身可能主要通过长时间的酸中毒而对局部缺血的脑代谢产生不利影响(Levine，1988，Wass and Lanier，1996)。
动物研究有力地支持这样的观点，高血糖显著恶化中风过程中的脑损害，其原因是局部脑血流减少、明显的水肿和脑干压迫、梗塞面积增加、收缩期Ca2+水平增加、乳酸盐蓄积、血脑屏障瓦解和出血增加(Duckrow，1985，1987，de Courten-Myers，1988，Slivka，1991，Araki，1992，Wagner，1992，Dietrich，1993，Broderick，1995)。
需要使血糖正常化和调节加剧糖尿病患者中风损害的代谢级联的姑息措施。这可以采取适当输注胰岛素和葡萄糖，和急性期后通过皮下多次注射胰岛素来严格控制血糖。后者方案在用于急性心肌梗塞过程中的糖尿病患者治疗时，与除非认为必要而没有接受胰岛素治疗的糖尿病患者对照组相比，心肌梗塞后一年内的死亡率降低了30％(Malmberg，1995)。
不过，输注胰岛素产生低血糖的可能性，低血糖的定义是血糖低于0.3mM。低血糖增加心肌梗塞、室性心律失常的危险，是输注胰岛素的危险后果。人们研究了患有中风的糖尿病患者输注胰岛素的算法，以预防低血糖(Hendra，1992)。不过，按照这种算法，有21％的患者发展为低血糖。在另一项心肌梗塞后葡萄糖控制的研究中，在输注胰岛素和葡萄糖后，有18％的患者发展为低血糖(Malmberg，1994)。
输注胰岛素还需要频繁监测血糖水平，使低血糖的发生能够尽可能快地检测和矫正。在所述研究(Malmberg，1994)中接受胰岛素输注的患者中，至少每两小时测量一次血糖，并相应调整输注的速率。因此，胰岛素-葡萄糖输注疗法的安全性和功效取决于血糖数据的简易和快速获得。这样一种对监测血糖的强烈需要给保健专家带来沉重负担，增加了治疗的难度和成本。其结果是，集约医疗单位经常没有为优化糖尿病患者的血糖水平而分配资源，而这可以通过胰岛素的静脉内给药得以实现。鉴于胰岛素输注所固有的危险和负担，需要另一种在糖尿病患者急性中风过程中控制血糖的替代方法。
肠降血糖素中的胰高血糖素样肽1简称GLP-1，是从肠中胰高血糖素原加工得到的，它促进营养素诱发的胰岛素释放(Krcymann，1987)。GLP-1的各种截短形式已知可刺激胰岛素的分泌(促胰岛素作用)和cAMP的生成(例如参见Mojsov，1992)。已经建立起对外源性GLP-1、即GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)酸给药的促胰岛素反应的各种体外实验室实验与哺乳动物、尤其是人之间的关系(例如参见Nauck，1993 a and b，Gutniak，1992，and Thorens，1993)。GLP-1(7-36)酰胺在生理学浓度下，通过刺激胰岛素敏感性和促进葡萄糖诱发的胰岛素释放，对胰岛素依赖性糖尿病患者发挥显著的抗糖尿病发生作用(Gutniak，1992)。在对非胰岛素依赖性糖尿病患者给药时，GLP-1(7-36)酰胺刺激胰岛素的释放，降低胰高血糖素的分泌，抑制胃的排空，并促进葡萄糖的利用(Nauck，1993 a and b，Gutniak，1992)。
GLP-1型分子在糖尿病长期疗法中的用途已经受到阻碍，因为这种肽的血清半衰期相当短。例如，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅有3至5分钟。当皮下给药时，GLP-1(7-36)酰胺的半衰期约为50分钟。因此，这些GLP分子必须以连续输液方式给药，才能达到长期效果(Gutniak，1994)。
发明概述本发明提供用于降低中风后死亡率和发病率的方法和组合物。该方法包括将来自GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物及其药学上可接受的盐的化合物在必要时对患者给药，给药剂量有效地使血糖正常化。本发明提供糖尿病患者中风后的死亡率和发病率降低的有益效果，例如通过减小梗塞面积。本发明对非胰岛素依赖者的治疗与用胰岛素和葡萄糖输注的组合治疗相比，避免不便又昂贵的频繁的血糖监测以及血糖结果的解释和胰岛素给药速率的调整。该治疗也避免曾经伴随胰岛素输注而发生的低血糖危险。本发明中，有些GLP-1的半衰期较短，但因此对连续给药的需要并非是不利的，因为患者通常卧床在集约医疗单位中，流体可以连续地通过肠胃外方式给药。该治疗包括高血糖患者，与他们是否诊断为糖尿病无关。
附图的简要说明
图1显示连续输注GLP-1(7-36)酰胺对五名NIDDM患者夜间平均血糖浓度(mM)的作用(----■----)。该图也描绘连续输注胰岛素对相同五名NIDDM患者在不同夜间平均血糖浓度的作用(----○----)。
图2显示GLP-1(7-36)酰胺输注对五名NIDDM患者平均血糖浓度(mM)的作用(----■----)，输注是在白天进行的，从每餐开始持续三小时。该图也描绘胰岛素的皮下注射对相同五名NIDDM患者在另一天平均血糖浓度的作用(----○----)，注射时间为每餐之前。
发明的详细说明方法和组合物、特别是采用胰高血糖素样肽-1、其类似物或衍生物的药物(药物组合物或制剂)有效降低糖尿病患者、特别是非胰岛素依赖性糖尿病患者中风后的死亡率和发病率。可用于实施发明的GLP-1类似物和衍生物当对患者给药时，具有长于GLP-1的半衰期和影响死亡率和发病率的能力。
中风中风或卒中或脑血管意外(CVA)是以非惊厥性和局灶性神经病学亏缺的突然发作为特征的脑血管疾病。在美国，中风每年导致约200000人死亡以及神经病学伤残。在西方国家，局部缺血-梗塞导致约85-90％的中风，而在其余患者人群发现有颅内出血。脑缺血是由持续几秒钟的血流减少所引起的。如果血流中断持续几分钟以上，那么发展为脑组织梗塞。脑缺血和梗塞的最常见原因是伴有血栓栓塞和心原性栓塞的动脉粥样硬化。局部缺血性中风在临床上是以其发生模式和随后的过程为特征的。关于这一点的证明是动脉粥样硬化老龄组个体轻偏瘫的急性发作。不过，任何脑机能障碍的症状都可能出现。颈动脉系统疾病的症状和征兆经常影响中脑动脉的分布，患者可能表现为对侧轻偏瘫、偏侧感觉亏缺和偏盲。当涉及优势大脑半球时，通常存在一定程度的失语。还可能涉及前(颈动脉)或后(椎底)循环，它或多或少地导致特殊的临床症状。
对高血糖的定义是血浆葡萄糖浓度为约200mg/dl(11.1mmol/l)或以上，或者禁食的血浆葡萄糖水平为约125mg/dl(7.0mmol或以上)。本发明在一方面预防高血糖或者降低它到正常值。
化合物GLP-1类似物、衍生物、变体、前体和同系物都适合于实施发明，只要包括降低中风后死亡率或发病率的活性片段即可。
“GLP-1”指GLP-1(7-37)。本领域在习惯上，将GLP-1(7-37)的氨基末端标记为7，将羧基末端标记为37。GLP-1(7-37)的氨基酸序列是本领域所熟知的，不过为了读者方便，也列在下面
NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-COOH“GLP-1类似物”的定义是与GLP-1相比经过修饰的分子，包括一个或多个氨基酸的取代、缺失、错位或增加。本领域已知的GLP-1类似物例如GLP-1(7-34)与GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)、Val8-GLP-1(7-37)、Gln9-GLP-1(7-37)、D-Gln9-GLP-1(7-37)、Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)和Lys18-GLP-1(7-37)。优选的GLP-1类似物是GLP-1(7-34)和GLP-1(7-35)，它们公开在美国专利No.5118666中，以及GLP-1(7-36)。这些化合物是具有促胰岛素性质的GLP-1的生物学加工形式。其它GLP-1类似物公开在美国专利No.5545618中。
“GLP-1衍生物”的定义是具有GLP-1或GLP-1类似物的氨基酸序列的分子，但是另外在其一个或多个氨基酸侧链基团、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸根上具有至少一个化学修饰。化学修饰包括添加化学部分、产生新的键和除去化学部分。氨基酸侧链基团上的修饰包括赖氨酸ε-氨基的酰化、精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷化、谷氨酸或天冬氨酸羧酸根的烷化和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰氨基。末端氨基的修饰包括脱氨基、N-低级烷基、N-二低级烷基和N-酰基修饰。末端羧基的修饰包括酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基是C1-C4烷基。此外，一个或多个侧链基团或端基可以被蛋白质化学领域的普通技术人员已知的保护基团保护起来。氨基酸的α-碳可以是一或二甲基化的。
本发明中，一组优选用在本发明中的GLP-1类似物和衍生物由美国专利No.5545618所要求保护的各种GLP-1分子组成。活性GLP-1肽的有效类似物7-34、7-35、7-36和7-37在7-10位发生氨基酸的取代，和/或在C-端被截短，和/或在基本的肽中含有各种其它氨基酸的取代。在7和8位具有D-氨基酸取代和/或在7位具有N-烷化或N-酰化氨基酸的类似物特别耐受体内降解。
显示胰岛素刺激性质增强的类似物具有天然GLP-1、7-34、7-35、7-36或7-37序列或其C-端酰胺，并具有至少一个选自下组的修饰(a)26和/或34位的中性氨基酸精氨酸或D型赖氨酸取代为赖氨酸，和/或36位的中性氨基酸赖氨酸或D型精氨酸取代为精氨酸；(b)31位的抗氧化氨基酸取代为色氨酸；(c)下列至少一个16位的Y取代为V；18位的K取代为S；21位的D取代为E；22位的S取代为G；23位的R取代为Q；24位的R取代为A；和26位的Q取代为K；(使用一个字母代表氨基酸)(d)包含下列至少一个的取代8位的另一个小分子中性氨基酸取代为A；9位的另一个酸性氨基酸或中性氨基酸取代为E；10位的另一个中性氨基酸取代为G；和15位的另一个酸性氨基酸取代为D；和(e)7位的另一个中性氨基酸或D型或N-酰化或烷化的组氨酸取代为组氨酸。
关于修饰(a)、(b)、(d)和(e)，取代的氨基酸可以是D型。7位被取代的氨基酸也可以是N-酰化或N-烷化的形式。
与GLP-1(7-37)相比显示血浆内抗降解作用增强的肽适合于本发明的实施。这些类似物中，任意上述GLP-1(7-34)或GLP-1(7-37)的截短形式或其C-端酰氨化形式受到下列修饰(a)7位的D-中性或D-酸性氨基酸取代为H，或(b)8位的D-氨基酸取代为A，或(c)二者皆是，或(d)7位的N-酰化或N-烷化形式的任意天然来源氨基酸取代为H。
因此，耐受降解的类似物包括(N-酰基(1-6C)AA)7GLP-1(7-37)和(N-烷基(1-6C)AA)7GLP-1(7-37)，其中当AA是赖氨酰残基时，一个或两个氮都可以是烷化或酰化的，AA表征与胰岛素刺激活性的保留一致的任意氨基酸。
关于7和8位的D-氨基酸取代，任意酸性或中性的D氨基酸残基都可以用在7位，任意D氨基酸残基都可以用在8位，并仍然与胰岛素刺激活性一致。7和8位之一或二者都可以被D-氨基酸取代；7-位D-氨基酸还可以是酰化或烷化的。这些修饰形式不仅适用于GLP-1(7-37)，而且适用于截短的类似物。
因此，在优选的类似物中，GLP-1的(7-34)、(7-35)或(7-37)形式是仅被这样修饰的，26和/或34位的中性氨基酸精氨酸或D型赖氨酸取代为赖氨酸，和/或36位的中性氨基酸赖氨酸或D型精氨酸取代为精氨酸。特别优选的是，在26和34位取代为赖氨酸的氨基酸选自由K+、G、S、A、L、I、Q、R、R+和M组成的组，在36位取代为精氨酸的氨基酸选自由K、K+、G、S、A、L、I、Q、M和R+组成的组(其中+表示D型)。
也是优选的类似物中，唯一的修饰是31位的抗氧化氨基酸取代为色氨酸。特别有利的取代选自由F、V、L、I、A和Y组成的组。
在特别优选的类似物中，22位的S取代为G，23和24位的R分别取代为Q和A，并且26位的Q取代为K，或者16位的Y取代为V，并且18位的K取代为S，或者这些取代加上21位的D取代为E。
在特别优选的类似物中，在8位取代为丙氨酸的小分子中性氨基酸选自由S、S+、GC、C+、Sar、A+、β-ala和Aib组成的组；和/或在9位取代为谷氨酸的酸性或中性氨基酸选自由E+、D、D+、Cya、T、T+、N、N+、Q、Q+、Cit、MSO和乙酰-K组成的组；和/或在10位取代为甘氨酸的另一个中性氨基酸选自由S、S+、Y、Y+、T、T+、N、N+、Q、Q+、Cit、MSO、乙酰-K、F和F+组成的组；和/或15位的D取代为E。
也是优选的类似物中，只有7位改变了。在优选的取代中，在7位取代为组氨酸的氨基酸选自由H+、Y、Y+、F、F+、R、R+、Orn、Orn+、M、M+、N-甲酰-H、N-甲酰-H+、N-乙酰-H、N-乙酰-H+、N-异丙基-H、N-异丙基-H+、N-乙酰-K、N-乙酰-K+、P和P+组成的组。
除下列特殊的实施方式(类似物)之外，仅有两类上述修饰形式的组合也是优选的实施方式
(H+)7-GLP-1(7-37)；(Y)7-GLP-1(7-37)；(N-乙酰-H)7-GLP-1(7-37)；(N-异丙基-H)7-GLP-1(7-37)；(A+)8-GLP-1(7-37)；(E+)9-GLP-1(7-37)；(D)9-GLP-1(7-37)；(D+)9-GLP-1(7-37)；(F+)10-GLP-1(7-37)；(S)22(R)23(R)24(Q)26-GLP-1(7-37)；(S)8(Q)9(Y)16(K)18(D)21-GLP-1(7-37)。
优选的稳定性提高的类似物也仅有一个、或最多两个氨基酸修饰。
优选在7位的组氨酸取代包括D-型组氨酸的D-型酸性或中性氨基酸。优选为P+、D+、E+、N+、Q+、L+、V+、I+和H+。
7位组氨酸或代替者(D或L)也可以是N-烷化(1-6C)或N-酰化(1-6C)的。烷基是直链或支链(包括环状)烃基，具有所示C数。酰基是式RCO-酰基，其中R是烷基。优选的烷基是t-丙基、α-丙基和乙基；优选的酰基是乙酰基和丙酰基。优选可以烷化或酰化的残基包括D或L型的P、D、E、N、Q、V、L、I、K和H。
优选在8位取代为丙氨酸的是D-型P、V、L、I和A；也优选为D-型D、E、N、Q、K、T、S和H。
有些特殊的类似物既显示提高了的胰岛素释放刺激活性，也显示提高了的稳定性。
一组优选用在本发明中的GLP-1类似物和衍生物由下式分子组成R1-X-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Y-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Z-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R2及其药学上可接受的盐，其中R1选自由L-组氨酸、D-组氨酸、脱氨基-组氨酸、2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸组成的组；X选自由Ala、Gly、Val、Thr、Ile和α-甲基-Ala组成的组；Y选自由Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly组成的组；Z选自由Glu、Gln、Ala、Thr、Ser和Gly组成的组；R2选自由NH2和Gly-OH组成的组；其前提条件是该化合物的等电点范围从约6.0至约9.0，进一步的前提条件是若R1是His，X是Ala，Y是Glu，Z是Glu，则R2必须是NH2。
大量等电点在约6.0至约9.0范围内的GLP-1类似物和衍生物已被公开，例如包括GLP-1(7-36)NH2Gly8-GLP-1(7-36)NH2Gln9-GLP-1(7-37)D-Gln9-GLP-1(7-37)乙酰-Lys9-GLP-1(7-37)Thr9-GLP-1(7-37)D-Thr9-GLP-1(7-37)Asn9-GLP-1(7-37)D-Asn9-GLP-1(7-37)Ser22-Arg23-Arg24-Gln26-GLP-1(7-37)Thr16-Lys18-GLP-1(7-37)Lys18-GLP-1(7-37)Arg23-GLP-1(7-37)Arg24-GLP-1(7-37)另一组优选用在本发明的活性化合物公开在WO 91/11457(与U.S.5545618相关)中，包括GLP-1(7-34)、GLP-1(7-35)、GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)，或其酰胺形式，及其药学上可接受的盐，具有至少一个包括如下所示的修饰(a)26位和/或34位的甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸或D-赖氨酸取代为赖氨酸；或36位的甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸或D-精氨酸取代为精氨酸；(b)31位的抗氧化氨基酸取代为色氨酸；
(c)下列至少一个16位的酪氨酸取代为缬氨酸；18位的赖氨酸取代为丝氨酸；21位的天冬氨酸取代为谷氨酸；22位的丝氨酸取代为甘氨酸；23位的精氨酸取代为谷氨酰胺；24位的精氨酸取代为丙氨酸；和26位的谷氨酰胺取代为赖氨酸；和(d)下列至少一个8位的甘氨酸、丝氨酸或半胱氨酸取代为丙氨酸；9位的天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代为谷氨酸；10位的丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸取代为甘氨酸；15位的谷氨酸取代为天冬氨酸；和(e)7位的甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或苯丙氨酸、或D-型或N-酰化或烷化形式的组氨酸取代为组氨酸；其中，在(a)、(b)、(d)和(e)的取代中，取代的氨基酸可以可选地是D-型，在7位被取代的氨基酸可以可选地是N-酰化或N-烷化的形式。
因为二肽基-肽酶IV(DPP IV)可能负责所观察到的GLP-1给药后的快速体内失活(Mentlein等，1993)，被保护不受DPP IV活性影响的GLP-1类似物和衍生物的给药是优选的，Gly8-GLP-1(7-36)NH2、Val8-GLP-1(7-37)OH、α-甲基-Ala8-GLP-1(7-36)NH2、Gly8-Gln21-GLP-1(7-37)OH和Gly8-GLP-1(7-37)OH或其药学上可接受的盐的给药是更优选的。
美国专利No.5188666(‘666)所要求保护的分子在本发明中的用途也是优选的。这样一种分子包括具有下列氨基酸序列之一的肽NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-X其中X可以是Lys和Lys-Gly；或所述肽的衍生物，其中所述肽可以是所述肽的药学上可接受的酸加成盐；所述肽的药学上可接受的羧酸盐；所述肽的药学上可接受的低级烷基酯；或所述肽的药学上可接受的酰胺，选自由酰胺、低级烷基酰胺和低级二烷基酰胺组成的组。
‘666发明涉及肽片段，它是促胰岛素的，可从天然来源的氨基酸序列衍生。这些片段适合于本发明的实施。本发明包含选自下组的化合物(A)包含下列序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X其中X选自由(a)Lys、(b)Lys-Gly、(c)Lys-Gly-Arg组成的组；(B)该肽的衍生物；其中该化合物基本上不含天然污染物，具有超过GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)的促胰岛素活性。
本发明也包括选自下组的化合物(A)包含下列序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-X其中X选自由(a)Lys、(b)Lys-Gly、(c)Lys-Gly-Arg组成的组；(B)该肽的衍生物；其中该化合物基本上不含天然污染物，在至少10-10M的浓度下具有促胰岛素活性。
特别相关的是下式的肽(1)H2N-X-CO-R1其中R1是OH、OM或-NR2R3；M是药学上可接受的阳离子或低级支链或非支链烷基；R2和R3是相同或不同的，选自由氢和低级支链或非支链烷基组成的组；
X是包含下列序列的肽His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-ArgNH2是X的氨基末端的胺基；CO是X的羧基末端的羰基；(2)其酸加成盐；和(3)其被保护或部分被保护的衍生物；其中所述化合物具有超过GLP-1(7-36)或GLP-1(7-37)的促胰岛素活性。
另一组优选用在本发明中的分子由美国专利No.5512549所要求保护的化合物组成，具有下列通式R1-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Xaa-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-R3|R2及其药学上可接受的盐，其中R1可以是4-咪唑丙酰、4-咪唑乙酰或4-咪唑-α，α-二甲基-乙酰；R2可以是C6-C10非支链酰基，或不存在；R3可以是Gly-OH或NH2；Xaa是Lys或Arg。
更优选用在本发明中的化合物是其中Xaa是Arg且R2是C6-C10非支链酰基的那些。
非常优选用在本发明中的化合物是其中Xaa是Arg、R2是C6-C10非支链酰基且R3是Gly-OH的那些。
更加非常优选用在本发明中的化合物是其中Xaa是Arg、R2是C6-C10非支链酰基、R3是Gly-OH且R1是4-咪唑丙酰的那些。
最优选用在本发明中的化合物是其中Xaa是Arg、R2是C8非支链酰基、R3是Gly-OH且R1是4-咪唑丙酰的那些。
美国专利No.5120712所要求保护的分子在本发明中的用途是非常优选的。这样一种分子包括具有下列氨基酸序列的肽NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH
和所述肽的衍生物，其中所述肽可以是所述肽的药学上可接受的酸加成盐；所述肽的药学上可接受的羧酸盐；所述肽的药学上可接受的低级烷基酯；或所述肽的药学上可接受的酰胺，其中该酰胺可以是酰胺、低级烷基酰胺或低级二烷基酰胺。
GLP-1(7-36)酰胺或其药学上可接受的盐在本发明中的用途是更加非常优选的。GLP-1(7-36)酰胺的氨基酸序列为NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-NH2Val8-GLP-1(7-37)OH或其药学上可接受的盐在本发明中的用途是更加非常优选的。Val8-GLP-1(7-37)OH的氨基酸序列为NH2-His7-Ala-Glu-Gly10-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp15-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu20-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala25-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala30-Trp-Leu-Val-Lys-Gly35-Arg-Gly37-OH化合物的制备本发明所用活性化合物、即GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物或包括当外周给药时有效降低中风后死亡率或发病率的活性片段的任何有关化合物的制备方法是熟知的，描述在美国专利Nos.5118666、5120712和5523549中。
本发明所用活性化合物的氨基酸部分或其前体是这样制备的1)固相合成化学；2)从天然来源纯化GLP分子；3)重组DNA技术；或4)这些方法的组合。
多肽的固相化学合成是本领域熟知的，可以在本领域的通行教材中找到，例如Dugas and Penney(1981)；Merrifield(1962)；Stewart and Young(1969，1984)。
例如，氨基酸部分可以通过固相方法学加以合成，并利用430A肽合成仪(PE-Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln CenterDrive，Foster City，CA 94404)和由PE-Applied Biosystems提供的合成循环。BOC-氨基酸和其它试剂在商业上可从PE-AppliedBiosystems和其它化学品供应商处获得。采用双偶联方案的连续BOC化学适用于C-端羧酰胺的制备，从对甲基二苯甲基胺树脂开始。关于C-端酸的制备，使用相应的PAM树脂。使用预先生成的羟基苯并三唑酯偶联Asn、Gln和Arg。可以使用下列侧链保护基团Arg甲苯磺酰基Asp环己基Glu环己基Ser苄基Thr苄基Tyr4-溴苄酯基BOC去保护可以用三氟乙酸的二氯甲烷溶液实现。合成完成后，肽可以去保护，用含有10％间甲酚的无水氟化氢(HF)从树脂裂解。侧链保护基团的裂解和肽从树脂的裂解在-5℃至5℃下进行，优选在冰上进行60分钟。除去HF后，肽/树脂用乙醚洗涤，肽用冰乙酸萃取，冷冻干燥。
可以采用重组DNA技术领域普通技术人员熟知的工艺，制备本发明所用活性化合物。事实上，因为收率高，重组DNA法可以是优选的。重组法生产的基本步骤是a)分离编码本发明GLP-1分子的天然DNA序列或构建合成或半合成的编码GLP-1分子序列的DNA，b)以适合于表达单独的蛋白质或融合蛋白的方式将编码序列放入表达载体，c)用表达载体转化适当的真核生物或原核生物的宿主细胞，d)在允许GLP-1分子表达的条件下培养转化后的宿主细胞，和e)回收和纯化重组方式生产的GLP-1分子。
如前所述，编码序列可以是完全合成的，也可以是对较大天然胰高血糖素-编码DNA进行修饰的结果。编码前胰高血糖素原的DNA序列是由Lund等(1982)提出的，可以用作本发明化合物的半合成生产原料，为达到所需结果而改变天然序列。
合成基因的体外或体内转录和转译导致GLP-1分子的产生，该基因可以用本领域熟知的工艺加以构建。由于遗传密码的天然简并性，技术人员将认识到，可以构建相当大的而又数量一定的DNA序列，所有它们都编码本发明的GLP-1分子。
合成基因构建体的方法学是本领域所熟知的(Brown等，1979)。利用遗传密码，从所需氨基酸序列设计DNA序列，这是普通生物学家易于确定的。一旦设计完成，序列本身可以利用常规的DNA合成仪器生成，例如380A或380B型DNA合成仪(PE-Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA 94404)。
为了表达本发明所用化合物的氨基酸部分，利用适当的限制性内切核酸酶，将工程合成的DNA序列插入很多适当的重组DNA表达载体中的任意一个(Maniatis等，1989)。将限制性内切核酸酶裂解部位加工成编码DNA的GLP-1分子的两个末端之一，以促进从本领域熟知的扩增和表达载体分离和向该载体整合。所采用的特定的内切核酸酶将受所采用的母体表达载体的限制性内切核酸酶裂解模式的支配。选择限制位点，以适当定向具有控制序列的编码序列，从而实现适当的目的蛋白质的框架内读码和表达。编码序列必须定位在具有启动子和表达载体的核糖体结合部位的适当阅读框架内，二者都在表达蛋白质的宿主细胞中有功能。
为了实现合成基因的高效转录，必须将其与启动子-操纵基因区有效连接。因此，将合成基因的启动子-操纵基因区设置为与合成基因的ATG起始密码子相同的序列方向。
各种可用于转化原核生物和真核生物细胞的表达载体都是本领域所熟知的(Promega Catalogue，1992，Stratagene Catalogue，1992)。而且，美国专利No.4710473描述了可用于高水平在大肠埃希氏杆菌内表达外源基因的环状DNA质粒转化载体。这些质粒可用作重组DNA程序中的转化载体，并且(a)赋予质粒在宿主细胞内自主复制的能力；(b)赋予自主质粒复制与温度的关系，在该温度下宿主细胞培养物得以维持；(c)稳定宿主细胞种群内质粒的维持；(d)指导合成表示宿主细胞种群内质粒维持的蛋白质产物；(e)提供系列单一限制性内切核酸酶识别位点给质粒；和(f)终止mRNA转录。
这些环状DNA质粒作为重组DNA程序中的载体，可用于保证高水平的外源基因表达。
在构建用于本发明所用化合物的氨基酸部分的表达载体之后，下一步是将该载体放入适合的细胞内，从而构建可用于表达多肽的重组宿主细胞。用重组DNA载体转化细胞的工艺是本领域所熟知的，可以在通行的参考文献中找到，例如Maniatis等，出处同上。宿主细胞既可以从真核生物细胞、也可以从原核生物细胞加以构建。
原核生物宿主细胞一般产生更高比率的蛋白质，也更容易培养。在高水平细菌表达系统内被表达的蛋白质特征性地聚集成颗粒或内含体，其中含有高水平的超表达的蛋白质。通常必须采用本领域熟知的工艺，对这种蛋白质聚集物加以回收、溶解、变性和重折叠。(Kreuger等，1990；美国专利No.4923967)。
GLP-1类似物和衍生物的制备为生产所需的GLP-1类似物或GLP-1衍生物或其活性片段而对前体GLP-1或GLP-1氨基酸序列所作的改变是通过熟知方法进行的化学修饰、酶修饰或化学与酶修饰的组合。经典的溶液相法和半合成法的工艺也可以用于制备本发明所用GLP-1分子。制备本发明GLP-1分子的方法是肽化学领域普通技术人员所熟知的。
向Lys34的ε-氨基加入酰基，这可以采用各种本领域已知方法的任意一种来实现(《生物轭合物化学》1990，Hashimoto等，1989)。
例如，使用50％乙腈的硼酸盐缓冲溶液，可以向赖氨酰-s-胺加入辛酸的N-羟基-琥珀酰亚胺酯。肽可以在加入咪唑基之前或之后被酰化。此外，如果肽是用重组法制备的，那么在酶裂解之前的酰化也是可能的。而且，按照WO 96/29342的教导，GLP-1衍生物中的赖氨酸可以被酰化。
大量GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)分子的被保护、未保护与部分被保护的、天然与非天然的功能类似物和衍生物的存在和制备已被描述过(美国专利Nos.5120712；5545618和5118666；Orskov等，1989；WO 91/11457)。
可选地，GLP-1衍生物的氨基酸残基的氨基和羧基末端可以被保护，或者可选地，仅有一个端基被保护。这类保护基团的生成和除去反应描述在本领域技术人员已知的著作中，例如包括《有机化学中的保护基团》1973，Green，1981和Schroder and Lubke，1965。代表性氨基-保护基团例如包括甲酰基、乙酰基、异丙基、丁氧基羰基、芴基甲氧基羰基、苄酯基等。代表性羧基-保护基团例如包括苄基酯、甲基酯、乙基酯、叔丁基酯、对硝基苯基酯等。
本发明所用羧基末端为低级烷基酯的GLP-1衍生物是这样制备的，在催化性酸的存在下，例如盐酸，使所需(C1-C4)烷醇与所需多肽反应。该烷基酯生成的适当条件包括反应温度为约50℃，反应时间为约1小时至3小时。类似地，可以生成Asp和/或Glu残基的烷基酯衍生物。
本发明所用化合物的羧酰胺衍生物例如按照Stewart等(1984)所述加以制备。
GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的药学上可接受的盐形式可以用在本发明中。常用于生成酸加成盐的酸是无机酸，例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等，和有机酸，例如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。这类盐的例子包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏鳞酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、丁炔-1，4-二酸盐、己炔-1，6-二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸盐、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟乙酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、萘-1-磺酸盐、萘-2-磺酸盐、扁桃酸盐等。优选的酸加成盐是与无机酸生成的那些，例如盐酸和氢溴酸。
碱加成盐包括从无机碱衍生的那些，例如铵或碱金属或碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等。这类可用于制备本发明盐的碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。盐形式是特别优选的。
本发明所用GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物可以与一种或多种赋形剂制成制剂，再用在本发明中。例如，本发明所用活性化合物通过熟知方法可以与二价金属阳离子配位化合。这类金属阳离子例如包括Zn++、Mn++、Fe++、Co++、Cd++、Ni++等。
本发明组合物可选地，本发明所用活性化合物可以与药学上可接受的缓冲剂结合，其pH调节在提供可接受的稳定性的值，其pH是肠胃外给药可接受的。
可选地，可以加入一种或多种药学上可接受的抗微生物剂。间甲酚和苯酚是优选的药学上可接受的抗微生物剂。可以加入一种或多种药学上可接受的盐，以调节离子强度或紧张性。可以加入一种或多种赋形剂，以进一步调节制剂的等渗性。甘油是调节等渗性的赋形剂例子。
GLP-1受体和由与GLP-1受体结合的配体引发的信号转导级联描述在WO 96/25487；Thorens等，1993和Widmann等，1994中。GLP-1受体是具有七个跨膜域的膜蛋白，与杂三聚G-蛋白偶联，后者连结与细胞内第二信使的产生结合的配体对该受体的活化作用，细胞内第二信使尤其是环腺苷一磷酸(cAMP)。cAMP依次活化特异性蛋白激酶，即cAMP-依赖性蛋白激酶(蛋白激酶A，PKA)。该酶磷酸化某些基因启动子区内的大量关键响应元件。在胰腺β-细胞和其它神经内分泌细胞中，受控制的分泌途径的有些特异性蛋白的磷酸化作用通过刺激分泌性颗粒的胞吐作用而刺激肽的分泌。
有多种化合物已知刺激内源性GLP-1的分泌。例如，使STC-1细胞与某些促分泌剂接触，例如腺苷酸环化酶活化剂毛喉素或蛋白激酶-C-刺激剂12-O-十四烷酰phobol-13-乙酸酯(TPA)，导致GLP-1的释放显著增加(Abella等，1994)。STC-1细胞系来源于携带胰岛素促进性致癌基因的转基因小鼠肠肿瘤，STC-1细胞已知含有胰高血糖素原的mRNA转录物，由此产生GLP-1。其它化合物，例如促生长素抑制素、抑胃多肽、葡萄糖依赖性促胰岛素肽、铃蟾肽、降钙素基因相关性肽、胃泌素释放肽、胆碱等激动剂、β-肾上腺素能激动剂、异丙肾上腺素和蕈毒碱胆碱能激动剂氨基甲酰甲基胆碱，已知类似地导致内源性GLP-1的释放(Plarsancie等，1994，Orskov等，1986，Brubaker，1991，Buchon等，1987)。
组合物的给药给药可以由普通医师通过任意已知有效的途径进行，除非直接进入中枢神经系统的肠胃外给药是特别由本发明所教导的或要求保护的途径。外周肠胃外给药是优选的。肠胃外给药在医学文献中一般被理解为将剂型通过无菌注射器或一些其他机械装置(例如输液泵)注射进入身体。出于本发明的目的，外周肠胃外途径包括静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药途径。本发明所用化合物的静脉内、肌内和皮下给药途径是更优选的。本发明所用化合物的静脉内和皮下给药途径是更加非常优选的。关于肠胃外给药，本发明所用活性化合物优选与适当pH的蒸馏水混合。
在本发明中用于降低死亡率和发病率的某些化合物也可以进行口服、直肠、经鼻或下呼吸道途径给药，它们都是非肠胃外途径。所述非肠胃外途径中，下呼吸道途径优选用于本发明所用肽的给药。各种用于通过下呼吸道给药的肽化合物制剂公开在美国专利Nos.5284656和5364838中。WO 96/19197公报公开了适合于促进本发明所用化合物的下呼吸道吸收的各种肽的气雾剂。口服给药途径是本发明所用化合物所优选的。
可以采用另外的制药方法来控制作用的持续时间。利用配位化合或吸附本发明所用活性化合物的聚合物可以实现控释制剂。延长持续时间可以通过选择适当的大分子，例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、亚乙基乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素或硫酸鱼精蛋白，还可以通过选择大分子的浓度，以及结合方法，目的是延长释放。另一种延长控释制剂作用持续时间的可能方法是将本发明所用活性化合物结合在聚合材料粒子内，例如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或亚乙基乙酸乙烯酯共聚物。或者，不将化合物结合在这些聚合粒子内，而使本发明所用化合物包埋在微胶囊内，其制备方法例如凝聚工艺或界面聚合，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊，或者包埋在胶体药物释放系统内，例如脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳粒子和纳胶囊，或者包埋在巨乳状液内。这样的教导是本领域技术人员已知的，例如公开在《Remington’s药物科学》1980中。
剂量对特定患者有效降低由中风引起的死亡率和发病率的GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物、或活性片段的剂量将取决于多种因素，其中包括患者的性别、体重和年龄、中风的严重性、中风的子类型、给药途径和生物利用度、所给药的化合物在体内的存留状态、制剂和功效。若给药是间歇性的，每次给药剂量应当还要考虑两剂之间的间隔和所给药的化合物的生物利用度。若给药是连续性的，适合的给药速率在0.25与6pmol/kg/min之间，优选从约0.5至约1.2pmol/kg/min。普通医师在其技能范围内可用滴定法测量含有GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物、或其活性片段的组合物的给药剂量和速率，以达到所需的临床效果，即通过控制葡萄糖降低中风后的死亡率和发病率。在实施方式中，使血浆葡萄糖浓度降至约7mmol/l以下是急性中风后的治疗目标。
“药学上可接受的”指适合对人给药的，也就是说，不含毒性成分、所不需要的污染物等，也不干扰活性化合物的活性。
大量等电点在4.8至7.5范围内的GLP-1类似物和衍生物已被公开，例如包括GLP-(7-36)NH2Gly8-GLP-1(7-36)NH2Gln9-GLP-1(7-37)中风的诊断“中风”的诊断涉及医学判断。治疗也是本发明的主题，一般在中风的急性阶段给予治疗。
需要本发明所用化合物的患者处于中风的急性阶段，也不能自主调节血糖。患者不能自主调节血糖的条件是该患者(1)按照国家糖尿病数据组的定义(《糖尿病》1979)，以前被诊断为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)或非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)；(2)即使以前没有被诊断为糖尿病，血糖水平也超过11mmol/升；或(3)葡萄糖耐受性异常。
GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物有效使患者血糖水平正常化的剂量将取决于多种因素，其中非限制性地包括患者的性别、体重和年龄、无力调节血糖的严重性、无力调节血糖的原因、是否同时将葡萄糖或另一种碳水化合物来源给药、给药途径和生物利用度、体内的存留状态、制剂和功效。若给药是连续性的，适合的给药速率在0.25与6pmol/kg体重/min之间，优选从约0.5至约1.2pmol/kg/min。若给药是间歇性的，每次给药剂量应当考虑两剂之间的间隔、GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的生物利用度、和实现正常血糖所需的浓度。普通医师在其技能范围内可用滴定法测量GLP-1、GLP-1类似物或GLP-1衍生物的给药剂量和速率，以达到所需的临床效果。
实施例参照具体实施例，本发明将更加易于理解，提供实施例是为了阐述本发明的实施方式。
实施例1皮下输注GLP-1(7-30)对NIDDM患者血糖的作用在夜间通过皮下输注十小时将GLP-1(7-36)酰胺对五名非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)患者给药，给药速率为1.2pmol/kg/hr。作为对照，在不输注GLP-1(7-36)酰胺的一天，将胰岛素输注给相同五名患者。胰岛素输注速率每隔两小时进行调节，以达到最佳对照效果，和避免低血糖。表1和图1数据证明，皮下输注GLP-1(7-36)酰胺几乎使所有患者的血糖正常化，而不诱发低血糖。GLP-1(7-36)酰胺代谢控制好于用胰岛素所达到的效果，在2300、000和100，GLP-1(7-36)酰胺治疗的平均血糖水平低于对照，具有统计学显著的差异。
表1在夜间用GLP-1(7-36)酰胺连续输注十小时的五名NIDDM患者的平均血糖水平。在另一天用相同患者进行的对照研究中，将胰岛素通过连续输注方式给药。
实施例2在进餐过程中皮下输注GLP-1(7-36)对NIDDM患者血糖水平的作用在试验当日的早餐、午餐和晚餐过程中向五名NIDDM患者输注GLP-1(7-36)酰胺三小时。输注时间为730-1030(早餐)、1030-130(午餐)和430-730(晚餐)，如图2所示。在另一天对相同五名NIDDM患者进行的对照实验中，在每餐开始前不久皮下注射胰岛素，如图2所示。在输注GLP-1时，用胰岛素注射所观察到的膳食后葡萄糖游移消失了，正常血糖水平得以维持。每次GLP-1(7-36)酰胺输注终止后血糖水平立即显著升高。没有观察到GLP-1(7-36)酰胺的事与愿违的副作用。这些数据说明，GLP-1(7-36)酰胺输注比胰岛素注射更有效地控制膳食后葡萄糖水平，并且只要继续GLP-1(7-36)酰胺的输注，该控制作用是有效的。
表2用GLP-1(7-36)酰胺输注三小时的五名NIDDM患者的平均血糖水平，输注开始于每餐开始的时候。在另一天对相同患者所进行的对照研究中，在每餐前不久通过皮下注射将胰岛素给药。每餐开始于730、1030和1630。
引用文献Abello，Jr.等，《内分泌学》(Endocrinol.)1342011-2017a(1994).
Araki，N.，等，《脑血流与代谢杂志》(Journal of CerebralBlood Flow and Metabolism)12469-476(1992).
Barbash，G.I.，等，《美国心脏病学会志》(J.Am.Coll.Cardiol.)22707-713(1993)《生物轭合物化学》(Bioconjugate Chem.)“蛋白质的化学修饰历史与应用”pp.1-212(1990).
Broderick，J.P.，等，《中风》(Stroke)26484-487(1995).
Brown，et al.(1979)《酶学方法》(Methods in Enzymology)，Academic Press，N.Y.，Vol.68，pp.109-151.
Brubaker，P.L.，《内分泌学》1283175-03182(1991).
Buchan，A.M.J.，等，《胃肠病学》(Gastroenterol.)93791-800(1987).
Cazzato，G.，等，《意大利神经病科学杂志》(Italian Journalof Neurological Sciences)12283-288(1991).
deCourteh-Myers，G.，等，《中风》19623-630(1988).
deFalco，F.A.，等，Schweizer Archiv Fur Neurologie undPsychatrie 144233-239(1993).
国家糖尿病数据组(National Diabetes Data Group)，《糖尿病》(Diabetes)281039-1057(1979).
Dietrich，W.D.，等，《中风》24111-116(1993).
Duckrow，R.B.，等，《神经病学记事》(Annals of Neurology)17262-272(1985).
Duckrow，R.B.，等，《中风》1852-58(1987).
Dugas，H.and Penney，C.，《生物有机化学》(BioorganicChemistry)，Springer-Verlag，New York(1981)，pp.54-92.
Fuller，J.H.，《糖尿病代谢》(Diabet.Metab.)1996-99(1993).
Granger，C.B.，等，《美国心脏病学会志》21(4)920-925(1993).
Gray，C.S.，等，《糖尿病医学》(Diabetic Medicine)4237-240(1987)Green，T.H.，《有机合成中的保护基团》(Protective Groupsin Organic Synthesis)，Wiley，New York(1981).
Grines，C.，等，《新英格兰医学杂志》(N.Engl.J.Med.)328673-679(1993).
Gutniak，M.，等，《糖尿病护理》(Diabetes Care)171039-1044(1994).
Gutniak，M.，等，《新英格兰医学杂志》326(20)1316-1322(1992).
Hamsten，A.，等，《国际医学杂志》(J.Int.Med.)7361-3(1994)236 Suppl.
Hashimoto等，《药物研究》(Pharmaceutical Res.)6(2)171-176(1989).
Hendra，T.J.，等，《糖尿病研究与临床实践》(Diabetes Res.Clin.Pract.)16213-220(1992).
Karlson，B.W.，等，《糖尿病医学》10(5)449-454(1993).
Kiers，L.，等，《神经病学、神经外科学与精神病学杂志》(Journal of Neurology，Neurosurgery，Psychiatry)55263-270(1992).
Krcymann，B.，等，《柳叶刀》(Lancet)21300-1303(1987).
Kreuger，et al.(1990)《蛋白质折叠效应》(Protein Folding)，Gierasch and King，eds.pp.136-142American Association for the Advancement of SciencePublication No.89-18S，Washington，D.C.
Lehto，S.，等，《中风》2763-8(1966).
Levine，S.R.，《神经病学记事》23416-418(1988).
Lund，等，《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)79345-349(1982).
Malmberg，K.and Ryden，L.，《欧洲心脏杂志》(Eur.Heart J.)9256-264(1988).
Malmberg，K.，等，《美国心脏病学会志》2657-65(1995).
Malmberg，K.A.，等，《糖尿病护理》171007-1014(1994).
Maniatis等，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningALaboratory Manual)，Cold Springs Harbor Laboratory Press，N.Y.，Vol.1-3(1989).
Mentlein，R.，等，《欧洲生物化学杂志》(Eur.J.Biochem.)214829-835(1993).
Merrifield，J.M.，《化学会志》(Chem.Soc.)852149(1962).
Mojsov，S.，《国际肽与蛋白质研究杂志》(Int.J.PeptideProtein Research)40333-343(1992).
Moulin，T.，等，《欧洲神经病学》European Neurology 3810-27(1997).
Nauck，M.A.，等，Diabetologia 36741-744.
Nauck，M.A.，等，《临床研究杂志》J.Clin.Invest.91301-307(1993).
O’Neill，P.A.，等，《中风》22842-847(1992).
Orskov，C.，等，《内分泌学》1191467-1475(1986).
Orskov，C.，等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)264(22)12826-12829(1989).
Plaisancie，P.，等，《内分泌学》1352348-2403(1994).
《有机合成中的保护基团》，Plenum Press，London and NewYork(1973).
《Remington药物科学》(1980).
Schrder and Lübke，《肽》(The Peptides)，Vol.1，AcademicPress，London and New York(1965).
Silvka，A.P.，《脑研究》(Brain Research)56266-70(1991).
Stewart and Young，《固相肽合成》(Solid Phase PeptideSynthesis)，Freeman，San Francisco(1969)，pp.24-66.
Stewart，J.M.，等，《固相肽合成》，Pierce Chemical CompanyPress(1984).
Stone，P.，等，《美国心脏病学会志》1449-57(1989).
《Promega生物学研究产品目录》(The Promega BiologicalResearch Products Catalogue)(1992)(Promega Corp.，2800Woods Hollow Road，Madison，WI 53711-5399).
《Stratagene克隆系统目录》(The Stratagene CloningSystems Catalogue)(1992)(Stratagene Corp.，11011 NorthTorrey Pines Road，La Jolla，CA 92037).
Thorens，B.，等，《糖尿病》421219-1225(1993).
Tuomilehto，J.，等，《中风》27210-215(1996).
Wagner，K.R.，等，《脑血流与代谢杂志》12213-22(1992).
Wass，C.T.，and Lanier，W.L.，《梅奥临床医学》(Mayo ClinicProceedings)71801-812(1996).
Weir，C.J.，等，BMJ 314(7090)1303-6(1997).
Widmann，C.，等，《分子药理学》(Mol.Pharmacol.)451029-1035(1994).
美国专利Nos.4710473；4923967；5118666；5188666；5120712；5284656；5364838；5545618；5512549；5523549.
外国专利Nos.WO 91/11457；WO 96/29342；WO 96/25487；WO96/19197.
序列表<110> Eli Lilly and Company<120> GLP-1或类似物在中风治疗中的用途<130> X-11158<140> PCT/US99/22026<141> 1999-09-22<150> US 60/101719<151> 1998-09-24<160> 35<170> PatentIn version 3.0<210> 1<211> 31<212> PRT<213> 人<400> 1His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 2<211> 28<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 2His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys20 25<210> 3<211> 29<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 3His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly20 25<210> 4<211> 30<212> PRT<213> 人<400> 4His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210> 5<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 5His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 6<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 6His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 7<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Gln<400> 7His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 8<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 8His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Thr Ser Lys Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 9<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 9His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 10<211> 28<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，ArgD-Arg和Met<220><221> 变体<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<400> 10His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa20 25<210> 11<211> 29<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<220><221> 变体<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<400> 11His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly20 25<210> 12<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Arg，D-Arg和Met<220><221> 变体<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，ArgD-Arg和Met<220><221> 变体<222> (30)..(30)<223> 30位的Xaa是Lys，D-Lys，Gly，Ser，Ala，Leu，Ile，Gln，Met和D-Arg<400> 12His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa Gly Xaa Gly20 25 30<210> 13<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (10)..(10)<223> 10位的Xaa是Tyr或Val<220><221> 变体<222> (12)..(12)<223> 12位的Xaa是Lys或Ser<220><221> 变体<222> (15)..(15)<223> 15位的Xaa是Asp或Glu<220><221> 变体<222> (16)..(16)<223> 16位的Xaa是Ser或Gly<220><221> 变体<222> (17)..(17)<223> 17位的Xaa是Arg或Gln<220><221> 变体<222> (18)..(18)<223> 18位的Xaa是Arg或Ala<220><221> 变体<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是Gln或Lys<400> 13His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Tyr Leu Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 14<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 14Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 15<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是N-乙基-His<400> 15Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 16<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是N-异丙基-His<400> 16Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 17<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (2)..(2)<223> 2位的Xaa是D-Ala<400> 17His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 18<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Glu<400> 18His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 19<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 19His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu PheIle Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 20<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Asp<400> 20His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 21<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (4)..(4)<223> 4位的Xaa是D-Phe<400> 21His Ala Glu Xaa Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 22<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 22His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Ser1 5 10 15Arg Arg Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 23<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 23His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 24<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是His、D-组氨酸、脱氨基组氨酸、2-氨基组氨酸，β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸<220><221> 变体<222> (2)..(2)<223> 2位的Xaa是Ala，Gly，Val，Thr，Ile，和2-甲基-Ala<220><221> 变体<222> (15)..(15)<223> 15位的Xaa是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，和Gly<220><221> 变体<222> (21)..(21)<223> 21位的Xaa是Glu，Gln，Ala，Thr，Ser，和Gly<220><221> 变体<222> (31)..(31)<223> 31位的Xaa是Gly-OH或不存在<400> 24Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Xaa Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Xaa Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30<210> 25<211> 30<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 25His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg20 25 30<210> 26<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是乙基-Lys<400> 26His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 27<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 27His Ala Thr Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 28<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Thr<400> 28His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 29<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 29His Ala Asn Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 30<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (3)..(3)<223> 3位的Xaa是D-Asn<400> 30His Ala Xaa Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 31<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 31His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Arg Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 32<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<400> 32His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Arg Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly20 25 30<210> 33<211> 28<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是Lys和Lys-Gly<400> 33His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa20 25<210> 34<211> 28<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><22l> 变体<222> (28)..(28)<223> 28位的Xaa是Lys，Lys-Gly，Lys-Gly-Arg<400> 34His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Xaa20 25<210> 35<211> 31<212> PRT<213> 人工的<220><223> 合成构建体<220><221> 变体<222> (1)..(1)<223> 1位的Xaa是4-咪唑丙酰、4-咪唑乙酰、4-咪唑-α或α-二甲基-乙酰<220><221> 变体<222> (20)..(20)<223> 20位的Xaa是Lys或Arg<220><221> 变体<222> (31)..(31)<223> 31位的Xaa是Gly或不存在<400> 35Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Xaa20 25 30
权利要求
1.降低中风后死亡率和发病率的方法，包括在必要时将选自GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物及其药学上可接受的盐的化合物对患者给药，给药剂量有效使血糖正常化。
2.权利要求1的方法，其中该化合物是静脉内给药的。
3.权利要求1的方法，其中该化合物是皮下给药的。
4.权利要求2或3的方法，其中该给药是连续性的。
5.权利要求4的方法，其中该化合物的给药速率在0.25与6pmol/kg/min之间。
6.权利要求5的方法，其中该化合物的给药速率在0.5与2.4pmol/kg/min之间。
7.权利要求5的方法，其中所述的速率在约0.5与约1.2pmol/kg/min之间。
8.权利要求2的方法，其中该静脉内给药是间歇性的。
9.权利要求2的方法，其中该化合物是静脉内给药的，也通过另一种肠胃外途径给药。
10.权利要求9的方法，其中该其他肠胃外途径是皮下途径。
11.权利要求1的方法，其中所给药的该化合物是GLP-1(7-36)酰胺或其药学上可接受的盐。
12.降低中风后死亡率和发病率的方法，包括将这样的化合物给药，该化合物通过与GLP-1、GLP-1类似物和GLP-1衍生物在发挥它们的促胰岛素活性时与之发生相互作用的相同受体发生相互作用，而发挥促胰岛素活性。
13.降低中风后死亡率和发病率的方法，包括将这样的化合物给药，该化合物通过与GLP-1、GLP-1类似物和GLP-1衍生物与之发生相互作用以增强胰岛素敏感性的相同受体发生相互作用，而增强胰岛素敏感性。
全文摘要
本发明提供降低与中风有关的死亡率和发病率的方法。将GLP－1、GLP－1类似物或GLP－1衍生物以有效使血糖正常化的剂量给药。
文档编号A61P3/00GK1322137SQ99811307
公开日2001年11月14日 申请日期1999年9月22日 优先权日1998年9月24日
发明者S·埃芬迪克 申请人:伊莱利利公司