专利名称：羰基压力改善剂和腹膜透析液的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗肾衰病人的腹膜透析液。
背景技术：
血液透析和腹膜透析这两类透析均用于治疗慢性肾衰病人。腹膜透析是一种使透析液在腹腔内滞留一段时间，从而促进体内废物穿过腹膜排泄到透析液中的方法。然后回收透析液。腹膜透析可进一步分为间断型腹膜透析(IPD)和连续便携型(ambulatory)腹膜透析(CAPD)。CAPD法增加了IPD法的优点，即通过延长灌注液在腹腔中的滞留时间而每天约4次换液。
腹膜透析具有方便和耗时少等优点。但已知长期透析可进行性降低脱水能力，还可导致腹部蛋白质变性和硬化，腹膜融合等异常。
腹膜透析液中的葡萄糖可能是原因之一。当前所用的多数类型的腹膜透析液均以葡萄糖为渗透压调节剂。葡萄糖遇热不稳定，其一部分在加热灭菌期间被降解。结果，能修饰蛋白质的强活性羰基化合物可能以降解产物的形式产生。这类降解产物可能也产生并积累于含有葡萄糖的腹膜透析液中，即使在灭菌后的储存期间也是如此。
通常，葡萄糖在近中性或碱性pH下易降解，因此选用酸性缓冲液(pH5.0-5.4)来维持常规腹膜透析液中葡萄糖的稳定性。然而，这类酸性缓冲液有着诸如抑制腹膜巨噬细胞之免疫防御机制、因细菌感染导致腹膜炎、以及对腹膜间皮细胞产生毒性等等危险。为了克服这些相互矛盾的问题，迫切需要防止因近中性腹膜透析液中葡萄糖的降解而产生羰基化合物，或消除这类化合物。
一方面，用高浓度葡萄糖配制成的腹膜透析液能修饰蛋白质，因此这类透析液不适用于腹膜。从这类观点出发，通过利用几乎不产生降解产物的葡萄糖聚合物开发了一些腹膜透析液(平成10年日本专利申请94598；Wilkie,M.E.等，Perit.Dial.Int.,17:S47-50(1997))。
出于同样的观点，有人提议用其它化合物取代葡萄糖作为腹膜透析液中所用的渗透压调节剂。这些包括环糊精(日本平成8年专利申请71146)、二糖(日本平成8年专利申请131541)、以及氨基酸(Faller,B.等，KidneyInt.,50(增刊56),S81-85(1996))。已有人公开了一种使用半胱氨酸作为添加剂以防止葡萄糖降解的腹膜透析液(日本平成5年专利申请105633)。
这些方法目的在于减少腹膜透析液中高浓度葡萄糖带来的不便。
已有报道说，慢性肾衰病人不管有没有高血糖症，其血液和组织中都会积累大量的强反应性羰基化合物和AGE(高级糖化终产物)(Miyata,T.等，Kidney Int.,51:1170-1181(1997)；Miyata,T.等，J.Am.Soc.Nephrol.,7:1198-1206(1996)；Miyata,T.等，Kidney Int.54:1290-1295(1998)；Miyata,T.等，J.Am.Soc.Nephrol.9:2349-2356(1998))。肾衰常伴有羰基化合物过多的情况(羰基压力)。这种羰基压力来自从糖类和脂类产生羰基化合物的非酶性生物化学反应，据信这些反应导致蛋白质的修饰增加(Miyata,T.等，Kidney Int.55:389-399(1999))。羰基压力不仅改变基质蛋白如胶原蛋白和粘连蛋白的结构，而且参与增强腹膜通透性和因羰基化合物对各种细胞的生理学活性而发生炎症。
在腹膜透析液中，血液中的废物穿过腹膜排泄至该腹膜透析液中。腹腔内高渗透压性腹膜透析液通过腹膜将肾衰病人血液中累积的强反应性羰基化合物收集在该渗透液中。因此，该腹膜透析液中的羰基化合物浓度升高，导致羰基压力状态。这被认为引起对腹腔内蛋白质的羰基修饰，其结果是腹膜的功能受损，引起进一步腹膜硬化。
对内皮和间皮的免疫组化检查证实，羰基压力来自于腹膜透析病人腹腔内出现的葡萄糖(Yamada,K.等，Clin.Nephrol.,42:354-361(1994)；Nakayama,M.等，KidneyInt.,51:182-186(1997)；Miyata,T.等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版；Combet,S.等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版；Inagi,R等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版)发明公开本发明的一个目的是提供用于减少腹膜透析期间羰基化合物所致损害的方法，尤其用于改善羰基压力状态的方法，并提供应用该方法所需的透析液和药学试剂。“羰基化合物”在本发明中指病人接受腹膜透析时产生的羰基化合物，所述腹膜透析液在制造或保存期间产生的羰基化合物，以及腹膜透析时腹腔内产生的羰基化合物。本发明旨在尽可能减小这些羰基化合物对接受透析的病人造成的损伤。
本发明人已发现，腹膜透析病人腹腔内出现的强反应性羰基化合物不仅仅是最初注入腹腔内的腹膜透析液中出现的那些。具体地，从腹膜透析病人体内收获的腹膜透析液中除葡萄糖以外的羰基化合物的量比透析前的量多5倍，因此，大多数羰基化合物被认为来自血液(
图1)。这表明，腹腔内腹膜透析液中出现的羰基化合物不仅包括加热灭菌过程中产生的羰基化合物和保存期间积累的羰基化合物，还包括来自血液的那些和在透析过程中产生并积累于腹腔内的那些，后两类是不能忽略的。对腹膜透析病人的腹膜组织进行免疫组化检查揭示了羰基化合物的存在(图2)。相应地，如果能除去腹膜透析期间血液转移至腹腔内的羰基化合物，就能有效缓解羰基压力。
本发明人考虑到，肾衰应经常伴有以下情况，其中体内蛋白质修饰得到加强，且当葡萄糖通过诸如腹膜透析等方法以高浓度连续注入腹腔中时，腹膜内蛋白质将由于腹腔内产生的羰基化合物在腹膜透析液中的累积而对非酶性修饰更敏感(图7)。
基于这类背景，本发明人发现，羰基化合物捕获剂可有效用于制备能减少腹膜透析液所产生的羰基化合物的透析液，并因此完成本发明。主要焦点在于血液中累积的羰基化合物，本发明人进一步发现，防止羰基压力所致蛋白质修饰及这类腹膜透析相关性综合征的药学制剂均十分有效，因此进一步完成本发明。
具体地，本发明涉及一种羰基压力改善剂，和基于这种改善剂的一种腹膜透析液，以及一种药剂。本发明更具体地涉及(1)一种用于改进腹膜透析期间腹膜内羰基压力状态的试剂，其以一种羰基化合物捕获剂作为一种活性成分；(2)(1)的试剂，其中所述羰基化合物捕获剂固定在不溶性载体上；(3)(1)的试剂，其中所述羰基化合物捕获剂与一种腹膜透析液混合；(4)(1)至(3)中任一种试剂，其中所述羰基化合物捕获剂选自氨基胍、吡哆胺、肼、含巯基化合物、以及它们的衍生物；(5)(1)至(3)中任一种试剂，其中所述羰基化合物捕获剂是一种抑制美拉德(Maillard)反应的试剂；(6)(1)的试剂，其中所述羰基化合物捕获剂是一种在腹膜透析液中不溶并能吸收羰基化合物的化合物；
(7)用于捕获腹膜透析液中羰基化合物的药筒，其中所述药筒装有(2)和/或(6)的羰基化合物捕获剂；(8)一种用于制备腹膜透析液的方法，所述腹膜透析液中羰基化合物含量已降低，所述方法包括使所述腹膜透析液通过药筒(7)；(9)一种用于制备腹膜透析液的方法，所述腹膜透析液中羰基化合物含量已降低，所述方法包括(a)使所述腹膜透析液与(2)和/或(6)的羰基化合物捕获剂接触，(b)使所述腹膜透析液与所述羰基化合物捕获剂分离；(10)一种含有羰基化合物捕获剂的腹膜透析液；(11)(10)的腹膜透析液，其中所述腹膜透析液还包含一种还原糖，并被放置在含有第一和第二室的容器内，使所述第一室容纳所述还原糖而所述第二室容纳所述羰基化合物捕获剂；和(12)(10)的腹膜透析液，其中所述羰基化合物捕获剂将被施用于腹膜内。
本发明还涉及羰基化合物捕获剂改善腹膜内羰基压力状态的用途。本发明也涉及羰基化合物捕获剂进行腹膜透析治疗的用途。此外，本发明涉及羰基化合物捕获剂产生改善羰基压力之试剂的用途。
在本发明中，待捕获的羰基化合物包括，如生产和保存腹膜透析液期间产生的羰基化合物。如上述，在含有高浓度葡萄糖作为渗透压调节剂的腹膜透析液中总是能产生羰基化合物。这类羰基化合物包括，如以下化合物(Richard,J.U.等，Fund.Appl.Toxic.,4:843-853(1984)):
·3-脱氧葡糖醛酮·5-羟甲基糠醛(后文缩写为“5-HMF”)·甲醛·乙醛·乙二醛·甲基乙二醛·乙酰丙酸·糠醛·阿拉伯糖在本发明中，羰基化合物捕获剂在透析的全程内使用，以除去下文所列羰基化合物(这些化合物是在肾衰病人血液中累积并在腹膜透析后转移至腹腔的)，以及除去腹膜透析液在生产和保存过程中产生的羰基化合物。
衍生自抗坏血酸的羰基化合物·脱氢抗坏血酸衍生自碳水化合物、脂、或氨基酸的羰基化合物·乙二醛·甲基乙二醛·3-脱氧葡糖醛酮·羟基壬烯醛·丙醛·丙烯醛本发明优选的羰基化合物捕获剂是能通过化学反应或吸收作用彻底抑制或降低所有这些羰基化合物的蛋白质修饰活性的一类；但所述羰基化合物捕获剂也包括仅对这些羰基化合物中主要成员有效的试剂。例如，据信甲基乙二醛在这些羰基化合物中具有相对较高的反应性(参见Thomalley,R.J.,Endocrinol.Metab.3(1996)149-166；Inagi,R等，J.Am.Soc.Nephrol.待出版；和实施例3)，并因此它在抑制甲基乙二醛的活性方面具有极大的病理生理学意义。结果，对甲基乙二醛有效的化合物可成为本发明的优选羰基化合物捕获剂。具体地，如实施例所示，诸如活性炭、胍、氨基胍、缩二胍、半胱氨酸、和清蛋白等化合物均为对甲基乙二醛特别有效的羰基化合物捕获剂。
尽管有人报道作为渗透压调节剂使用的某些碳水化合物比葡萄糖更稳定，但在加热灭菌和保存期间很难彻底抑制这些碳水化合物的羰基化合物产生。因此，所述羰基化合物捕获剂的使用对于用除葡萄糖以外的碳水化合物作为渗透压调节剂的情况具有意义。能在腹膜透析中作为渗透压调节剂使用的除葡萄糖以外的碳水化合物包括海藻糖(日本平成7年专利申请323084)、水解的淀粉(日本平成8年专利申请85701)、麦芽糖醇和乳糖醇(日本平成8年专利申请131541)、以及非还原寡糖和非还原多糖(日本平成10年专利申请94598)。
本发明的羰基化合物捕获剂包括能抑制或减少由羰基化合物经化学反应或吸收作用对透析病人所造成的损伤，且其本身对所述病人安全的化合物。这类化合物包括以下所列。本发明的羰基化合物捕获剂可单独使用或与两或更多种化合物联合使用。
·氨基胍(Foote，E.F.等，美国肾病杂志，25:420-425(1995))·±2-异亚丙基亚肼基-4-氧-噻唑啉-5-基-N-乙酰苯胺(OPB-9195；S.Nakamura,1997，糖尿病(Diabetes)46:895-899)所述羰基化合物捕获剂还包括以下具有羰基化合物捕获剂功能的化合物或其衍生物。“衍生物”指与母体化合物相比，在任何部位有一个原子或分子取代的化合物。
(1)胍衍生物如甲基胍(日本昭和62年专利申请142114；日本昭和62年专利申请249908；日本平成1年专利申请56614；日本平成1年专利申请83059；日本平成2年专利申请156；日本平成2年专利申请765；JP-A Hei2-42053；日本平成6年专利申请9380；已公开国际申请的日文译本5-505189)等。
(2)肼衍生物如磺酰肼等。
(3)含有2个氮原子的5元杂环化合物如吡唑啉酮(日本平成6年专利申请287179)，吡唑啉(日本平成10年专利申请167965)，吡唑(日本平成6年专利申请192089；日本平成6年专利申请298737；日本平成6年专利申请298738),imidazolysine(日本平成5年专利申请201993；日本平成6年专利申请135968；日本平成7年专利申请133264；日本平成10年专利申请182460)，已内酰脲(日本平成6年专利申请135968)等。
(4)含有3个氮原子的5元杂环化合物如三唑(日本平成6年专利申请192089)等。
(5)含有1个氮原子和1个硫原子的5元杂环化合物如噻唑啉(日本平成10年专利申请167965)，噻唑(日本平成4年专利申请9375；日本平成9年专利申请59258)，噻唑啉(日本平成5年专利申请201993；日本平成3年专利申请261772；日本平成7年专利申请133264；日本平成8年专利申请157473)，等。
(6)含有1个氮原子和1个氧原子的5元杂环化合物如噁唑(日本平成9年专利申请59258)，等。
(7)含氮原子的六元杂环化合物如吡啶(日本平成10年专利申请158244；日本平成10年专利申请170954)，嘧啶(已公开的国际申请7-500811的日文译本)，等。
(8)含氮原子的缩合杂环化合物如吲唑(日本平成6年专利申请287180)，苯并咪唑(日本平成6年专利申请305964)，喹啉(日本平成3年专利申请161441)等。
(9)含硫和含氮的缩合杂环化合物如苯并噻唑(日本平成6年专利申请305964)等。
(10)含硫的缩合杂环化合物如苯并噻吩(日本平成7年专利申请196498)等。
(11)含氧原子的缩合杂环化合物如苯并吡喃(日本平成3年专利申请204874；日本平成4年专利申请308586)等。
(12)产生氮原子的化合物如咔唑基(日本平成2年专利申请156；日本平成2年专利申请753)，肼基甲酸(日本平成2年专利申请167264)，肼(日本平成3年专利申请148220)等。
(13)醌如苯醌(日本平成9年专利申请315960)，氢醌(日本平成5年专利申请9114)等。
(14)脂肪族二羧酸(日本平成1年专利申请56614；日本平成5年专利申请310565)等。
(15)硅化物(日本昭和62年专利申请249709)。
(16)有机锗(organogermanes)(日本平成2年专利申请62885；日本平成5年专利申请255130；日本平成7年专利申请247296；日本平成8年专利申请59485)。
(17)类黄酮(日本平成3年专利申请240725；日本平成7年专利申请206838；日本平成9年专利申请241165；WO 94/04520)。
(18)烷基胺(日本平成6年专利申请206818；日本平成9年专利申请59233；日本平成9年专利申请40626；日本平成9年专利申请124471)。
(19)氨基酸(国际申请4-502611的日文公开译本；国际申请7-503713的日文公开译本)。
(20)芳香族化合物如壳二孢氯素(日本平成6年专利申请305959)，苯甲酸(WO 91/11997)，吡咯并二氮杂萘鎓(日本平成10年专利申请158265)，等。
(21)多肽(国际申请7-500580的日文公开译本)。
(22)维生素如维生素B6(即吡哆胺)(WO 97/09981)等。
(23)含巯基化合物如谷胱甘肽，半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸等。
(24)含巯基蛋白质如还原型清蛋白等。
(25)四环素(日本平成6年专利申请256280)。
(26)脱乙酰壳多糖(日本平成9年专利申请221427)。
(27)鞣质(日本平成9年专利申请40519)。
(28)含季铵离子的化合物。
(29)双缩胍试剂如苯乙双胍(phenformin)，丁二胍(buformin)，二甲双胍(metformin)，等。
(30)离子交换树脂(31)无机化合物如活性炭，硅胶，氧化铝，碳酸钙等。
以上化合物包括已知总称为美拉德反应抑制物的那些。美拉德反应是葡萄糖等还原糖与氨基酸或蛋白质之间的非酶性糖化反应。Maillard于1912年报道了这一反应，其焦点是氨基酸和还原糖在加热的情况下形成的混合物的棕色显色现象(Maillard,L.C.,Compt.Rend.Soc.Biol.,72:599(1912))。该美拉德反应涉及食物在加热和储存期间的棕色显色、芳香族成分的产生和口味的形成、以及蛋白质变性。因此，该反应主要在食品化学领域得以研究。
1968年，体外鉴定了一种血红蛋白的纤维级分，即糖化的血红蛋白(HbAlc)，其显示在糖尿病人体内水平增高(Rahbar.S.,Clin.Chim.Acta,22:296(1968))。这些发现更增加了对体内美拉德反应的重大意义的兴趣以及对该反应参与成人疾病如糖尿病综合症和动脉硬化以及老化的发生的兴趣。抑制体内美拉德反应的试剂得到广泛而深入的研究，结果发现上述化合物可以作为抑制美拉德反应的试剂。
已知这类美拉德反应抑制剂能改善腹膜透析病人的羰基压力状态，并抑制与腹膜透析相关的由羰基压力所引起的综合症，其方式是消除腹膜透析液和血液中的羰基化合物。
本发明的羰基化合物捕获剂包括大分子化合物如离子交换树脂，或无机化合物如活性炭，硅胶，氧化铝和碳酸钙，以及有机化合物如上述美拉德反应抑制剂。这些化合物是利用它们的羰基化合物吸收活性而捕获腹膜透析液中的不溶性羰基化合物。已知这些化合物可作为层析载体，但并不知它们可用于改善羰基压力状态。
利用了活性炭的吸附性血液净化剂已用于药物中毒或肝性昏迷中纯化血液。它们还用于与血液透析有关的辅助治疗，以除去多器官衰竭中急性肾衰早期增加的各种内毒素、外毒素、和血管活性物质。然而目前尚未知吸附性血液净化剂可用于去除腹膜透析液中的羰基化合物或透析期间在腹腔内积累的羰基化合物。
日本昭和58年专利申请169458描述了一项发明，其涉及含有固体颗粒吸附剂的腹膜透析液以及用这种腹膜透析液进行腹膜透析的方法。根据该文献，加入所述固体颗粒吸附剂旨在消除肌酸酐和低分子量代谢物；但它并未描述该吸附剂可有效消除腹膜透析液中或透析期间腹腔内所积累的羰基化合物。此外该文献并未指出或暗示腹膜透析病人的羰基压力状态可通过腹膜透析方法改善。
可添加本发明的羰基化合物捕获剂的腹膜透析液组合物可以是任何常规透析液。腹膜透析液通常包含渗透压调节剂、缓冲剂、和无机盐。上述糖类作为渗透压调节剂使用。考虑到葡萄糖的稳定性，常使用具有酸性pH(pH5.0-5.4)的缓冲剂。当然，如果渗透压调节剂不是葡萄糖，则可适当选择更接近生理pH(pH7.0左右)的缓冲剂。或者，可设计一种产物形式，其中用于调节pH的缓冲剂单独包装，从而既可以使用葡萄糖又可以使用中性pH。在本发明中，加热灭菌过程和长期保存所产生的羰基化合物被消除，从而使产生中性pH的缓冲系统得到最佳利用。这类配方以前因葡萄糖的降解而很难实现。腹膜透析液通常包含无机盐如氯化钠、氯化钙、或氯化镁。这些盐使腹膜透析液更接近生理条件，预期可产生更高的生物相容性。
本发明的羰基化合物捕获剂可在配制时加入已知组份的腹膜透析液中，配好并密封的透析液可加热除菌。预期该试剂的加入足以抑制加热灭菌时由主要组分产生羰基化合物。或者，将腹膜透析液置于有第一和第二隔室的容器内；将还原糖置于第一隔室，将羰基化合物捕获剂置于第二隔室内，二者在使用前临时混合。在这种情况下，灭菌和保存期间产生的羰基化合物迅速与羰基化合物捕获剂混合。过量的羰基化合物捕获剂还可在腹腔施用后捕获血液衍生的羰基化合物。可向腹膜透析液中添加单一一种羰基化合物捕获剂或多种捕获剂的组合。
使腹膜透析液与固定有羰基化合物捕获剂的载体或与不溶于该腹膜透析液的羰基化合物捕获剂接触的方法很多。例如，将腹膜透析液装入容器内，所述容器已在其内部固定了羰基化合物捕获剂或含有固定于颗粒或纤维载体上的羰基化合物捕获剂，从而可捕获保存期间产生和积累的羰基化合物。在后一个系统中，不溶性载体可通过过滤与腹膜透析液分离。或者，可在一个柱中装填固定有羰基化合物捕获剂的载珠或纤维状载体，或装填不溶于腹膜透析液的羰基化合物捕获剂，从而制备一种羰基化合物捕获剂药筒。然后，使腹膜透析液与药筒中的载体接触，再使液体流入腹腔。优选药筒中预装填蒸馏水，以防止开始腹膜透析时的气泡。当羰基化合物捕获药筒在腹膜灌注时与腹膜透析液接触，尽管不能除去病人在透析时体液中产生的羰基化合物，但透析液中最初出现的羰基化合物可以消除。或者，当用一个小循环泵在封闭的环路中使腹膜透析液循环而实施腹膜透析处理时，有可能通过在上述环路中安装含有固定了羰基化合物捕获剂的载体的羰基化合物捕获药筒，而不仅除去透析液中最初出现的羰基化合物，还除去透析时腹腔中积累的那些。
对固定本发明羰基化合物捕获剂所用的载体无具体限制，只要该载体对人体无害，且作为直接接触复膜透析液的物质保证安全和稳定便可。所述载体包括，如合成的或天然的有机大分子化合物，和无机物质如玻璃珠、硅胶、氧化铝、和活性炭，以及包被有多糖或合成聚合物的这些物质。常规修饰、重新成型或变性可改善固定羰基化合物捕获剂的载体，或本身不溶于腹膜透析液的羰基化合物的渗透性、药物兼容性、保护力度、吸收能力、或羰基化合物特异性。
包含大分子的载体实例有聚甲基异丁烯酸酯聚合物，聚丙烯腈聚合物，聚砜聚合物，乙烯基聚合物，聚烯烃聚合物，氟聚合物，聚酯聚合物，聚酰胺聚合物，聚亚胺聚合物，聚氨基甲酸酯聚合物，聚丙烯酰基聚合物，聚苯乙烯聚合物，聚酮聚合物，硅聚合物，纤维素聚合物，脱乙酰壳多糖聚合物；尤其，多糖如琼脂糖，纤维素，壳多糖，脱乙酰壳多糖，Sepharose，葡聚糖，等及其衍生物，以及聚酯，聚乙烯氯化物，聚苯乙烯，聚砜，聚醚砜，聚丙烯，聚乙烯醇，聚芳醚砜，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚碳酸，乙酰化纤维素，聚丙烯腈，聚对苯二甲酸乙二酯，聚酰胺，聚硅氧烷树脂，荧光素，聚氨基甲酸酯，聚醚氨酯，和聚丙烯酰胺以及它们的衍生物。所述大分子物质可单独使用，也可使两种或更多种大分子物质组合使用。在后一种情况中，至少一种大分子物质上固定有羰基化合物捕获剂。所固定的羰基化合物捕获剂可单独使用或使两种或更多种化合物组合使用。上述聚合物物质可以是包含一种类型单体的聚合物，或是包含多种类型单体的共聚物。此外，所述物质可加入适当修饰剂进行处理，或可进行变性处理如放射交联或用过氧化物交联。
对载体的形状无限制。例如，载体可以是膜状，纤维状，粒状，中空纤维样，非编织纤维样，孔状，或蜂窝状。载体与腹膜透析液的接触面积可通过改变该载体的厚度，表面积，直径，长度，形状，和/或大小来控制。此外，所述羰基化合物捕获剂可固定在放置腹膜透析液的容器的内壁，和使腹膜透析液循环于其中的环路内。
可用已知方法将羰基化合物捕获剂固定在上述载体上，如物理吸附、特异性生物化学结合反应、离子结合、共价键结合、移植等。如有必要，可在载体和羰基化合物捕获剂之间插入间隔臂。当羰基化合物捕获剂显示毒性时，其释放量至关重要。因此，优选通过共价键结合使羰基化合物捕获剂固定在载体上，从而使释放量最小。载体上的功能基团可用于经共价键结合羰基化合物捕获剂。所述功能基团如，羟基、氨基、醛基、羧基、硫醇基、硅烷醇基、酰胺基、环氧基、琥珀酰亚胺基等；但不止这些。所述共价键如酯键、醚键、氨基键、酰胺键、硫键、亚氨键、二硫键等。
商业产品如带有磺酰肼基团的聚苯乙烯载体(PS-TsNHNH2,ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)可作为固定羰基化合物捕获剂的载体使用。
可根据所用羰基化合物捕获剂和载体的类型，选择适当的公知灭菌方法对固定了本发明羰基化合物捕获剂的载体灭菌。所述灭菌方法包括，如高压蒸汽灭菌、γ射线辐射灭菌、蒸汽灭菌等。装有不溶性羰基化合物捕获剂或装有固定化羰基化合物捕获剂之载体的药筒与含有腹膜透析液的容器相连，以便同时对药筒和容器实施灭菌。
当只有少量羰基化合物捕获剂与腹膜透析液接触时，可不充分地消除腹膜透析液中的羰基化合物。通常，难以预计腹膜透析时的羰基化合物量。因此，在不危及病人安全的情况下尽可能多地使用羰基化合物捕获剂，以便维持最大效应。可改变载体上所固定的羰基化合物捕获剂的量，或改变临用前才将羰基化合物捕获剂固定于其上的载体的量，从而控制羰基化合物捕获剂的用量。
羰基化合物捕获剂也可通过安装在腹膜透析环路中的适当混合连接器注入该环路。此时，灭菌和保存过程中产生的羰基化合物被限制在环路中。
此外，可将羰基化合物捕获剂直接施用于腹腔，并与腹膜透析液在腹腔中混合。此时，腹膜透析液和血液中产生的羰基化合物在腹腔中被灭活。
而且，在将腹膜透析液注入病人体内之前，或当该流体充满腹腔时，可通过静脉注射等方式将羰基化合物捕获剂施用于该腹膜透析病人，从而成功改善腹腔中的羰基压力状态。
本发明腹膜透析液的优选实施方案具体描述于下。
基本透析液的组成通常如下葡萄糖 1-5％w/v钠离子 100-150meq钾离子 0-0.05meq镁离子 0-2meq钙离子 0-4meq氯离子 80-150meq缓冲剂 10-50mM(有机酸如乳酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸、丙酮酸、和琥珀酸)这只是一个常用配方，可根据病人的症状选择更合适的组合物。
本发明的羰基化合物捕获剂以有效量加入上述基本配方中。例如，当使用氨基胍时，浓度为1mM或更高，优选10mM或更高，更优选10mM或更高但不超过100mM。如果羰基化合物捕获剂仅加入少量，它们可能被生产和保存期间产生的羰基化合物耗尽。结果，该捕获剂不能处理透析期间从病人血液和组织中转移至透析液的羰基化合物。尤其，难以预计从血液和组织中转移至透析液的羰基化合物的量。因此，在不危及病人安全的情况下尽可能多地使用羰基化合物捕获剂，以便维持最大效应。已知氨基胍对动物毒性很低。根据“化学物质的毒性作用”(1978)，皮下给药时氨基胍的半数致死剂量为大鼠1258mg/kg，或小鼠963mg/kg。该化合物可溶于水。OPB-9195也可类似地加入，至浓度为1mM或更高，优选10mM或更高，更优选10mM或更高但不超过100mM。
将本发明如上配制的腹膜透析液装于适当密闭容器内，并进行灭菌。有效的灭菌包括加热灭菌如高压蒸汽灭菌，和热水(hot water)灭菌。此时，重要的是使用高温下不释放毒性物质的容器，其强度足以在灭菌后承受运输损伤。这类容器的具体实例如聚乙烯氯化物、聚丙烯、聚乙烯、聚酯、或乙烯乙酸乙烯酯共聚物制成的韧性塑料袋。此外，为避免流体受空气影响而变质，装有腹膜透析液的容器可用高压载体(high gas barrier)包装材料包装。
可选用过滤除菌替代加热灭菌。例如，可用精确过滤装置加孔径大小0.2μm的滤膜使流体过滤而除菌。该方法不产生加热时才生成的羰基化合物。将通过滤器除菌的腹膜透析液装入容器如韧性塑料袋中再密封。由于从灭菌至运输的过程与现有透析液的制备无异，故本发明的腹膜透析液也可以用含有类似步骤的方法生产。
通过高压加热灭菌等加热方法灭菌时，只要所用羰基化合物捕获剂在加热等处理条件下足够稳定，便可在配制腹膜透析液但未加热灭菌之前加入该捕获剂。此方法可减少透析液在加热期间羰基化合物的产生和积累。当然，羰基化合物捕获剂还能减少保存和腹膜透析时的羰基化合物的产生和积累。
如果所用羰基化合物捕获剂在加热灭菌时不稳定，可用不需加热的方法使其灭菌。这类灭菌方法包括如过滤除菌。或者，可将羰基化合物捕获剂加至灭菌后的腹膜透析液中。对加试剂的时间无特别限制。例如，优选灭菌后加入羰基化合物捕获剂，因为此种情况下，该捕获剂不仅能抑制腹膜透析时产生羰基化合物，还可抑制腹膜透析液在透析前的保存期间产生和积累的羰基化合物。
或者，可在腹膜透析处理之前或之时临时加入羰基化合物捕获剂。例如，可在处理前将基本溶液和羰基化合物捕获剂分别包装在上述韧性塑料袋中，开始腹膜透析时在无菌条件下将二者混合。为达到此目的，最好使用日本专利申请昭和63年19149所述的韧性塑料袋(其包含两个可拆卸的隔室)。
或者，可在腹膜透析环路中安装一个混合连接器，而羰基化合物捕获可通过该连接器注入。
腹膜透析液的这类制备方法可用于制备热稳定性羰基化合物捕获剂以及热不稳定性羰基化合物捕获剂。
此外，当通过使腹膜透析液在带有小循环泵的闭合环路中循环而进行腹膜透析时，可在该环路的任何一处安装一个盛有羰基化合物捕获剂的过滤装置。
本发明的腹膜透析液可用于一种类似于用现有腹膜透析液进行的腹膜透析治疗。具体地，可将适当量的本发明腹膜透析液注入病人腹腔，使机体中存在的低分子量成分穿过腹膜转移至该腹膜透析液中。使腹膜透析液间断地循环，根据病人的症状可使治疗进一步持续。在此期间，羰基化合物以及其它物质如肌酸酐、无机盐、和氯离子，从血液和腹膜内侧转移至腹膜透析液中。同时，羰基化合物的毒性被羰基化合物捕获剂消除，从而使这些化合物无害。
附图简述图1显示出现在腹膜透析液和排出液中的羰基化合物的量。
图2显示羰基化蛋白质在腹膜透析病人的腹膜组织中的组织学定位照片(上图)和相应图例说明(下图)。在此图中，A表示结缔组织中的阳性区，此区中出现了间皮细胞但已被除去；B表示增厚的血管壁上的阳性区。
图3显示间皮细胞接触乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮时VEGF mRNA的表达。将大鼠间皮细胞与各种浓度(0,100,200，和400μM)的乙二醛(A)、3-脱氧葡糖醛酮(B)、或甲基乙二醛(C)一起温育，提取细胞的总RNA，对其进行逆转录。用PCR将VEGF和G3PDH cDNA分别扩增30和21个循环。试验均重复至三次以计算平均值。计算每一试验的VEGFmRNA比G3PDH mRNA的均值比例。三次试验的平均值±标准差(S.D.)如图所示。*P＜0.0005。
图4显示微脉管内皮细胞接触甲基乙二醛时的VEGF蛋白质的产生。在有各种浓度(0,200,和400μM)的甲基乙二醛存在下培养人内皮细胞，用ELISA定量释放至培养液上清中的VEGF蛋白。三次试验的代表性数据如所示。数据均表示为平均值±范围。*P＜0.05,**P＜0.01。
图5显示内皮细胞接触甲基乙二醛时VEGF mRNA的表达。在有各种浓度(0,100,200,和400μM)的甲基乙二醛存在下培养人内皮细胞。用PCR将VEGF和G3PDH cDNA分别扩增30和21个循环。试验均重复至三次以计算平均值。计算每一试验的VEGF mRNA比G3PDH mRNA的均值比例。三次试验的平均值±标准差如图所示。*P＜0.05,**P＜0.005,***P＜0.0001。
图6显示大鼠每天腹膜内给与甲基乙二醛，10天后其腹膜组织中的VEGF mRNA表达。表达于腹膜中的VEGF和G3PDH mRNA分别经RT-PCR扩增28和16个循环。试验均重复至三次以计算平均值。计算每一试验的VEGF mRNA比G3PDH mRNA的均值比例。三次试验的平均值±标准差如图所示。*P＜0.05。
图7显示腹膜透析病人腹腔中羰基压力的产生过程。
图8显示使腹膜透析的排出液保温后加入氨基胍对戊糖定(pentosidine)产生的影响。
图9显示使腹膜透析的排出液保温后加入氨基胍对蛋白质羰基的产生的影响。
图10显示加入氨基胍对三例腹膜透析病人(病人I，病人S，和病人K)的腹膜透析排出液中羰基化合物(CAPD)量的影响。
图11显示加入氨基胍对酸性pH范围的腹膜透析液中5-HMF的产生的影响。
图12显示加入氨基胍对中性pH范围的腹膜透析液中5-HMF的产生的影响。
图13显示加入氨基胍对酸性和中性pH范围的腹膜透析液中羰基化合物量的影响。
图14显示加入腹膜透析液中的羰基化合物捕获珠对戊糖定产生的抑制效应。
图15显示加入腹膜透析液中的羰基化合物捕获珠的羰基化合物消除效应。
图16显示加入二羰基化合物溶液中的活性炭的羰基化合物消除效应。
图17显示加入腹膜透析液中的活性炭的羰基化合物消除效应。
图18显示胍对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图19显示二甲双胍(一种二胍)对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图20显示丁二胍(一种二胍)对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图21显示苯乙双胍(一种二胍)对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图22显示氨基胍对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图23显示半胱氨酸(一种巯基化合物)对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图24显示N-乙酰半胱氨酸(一种巯基化合物)对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图25显示GSH(一种巯基化合物)对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图26显示清蛋白(一种巯基化合物)对乙二醛、甲基乙二醛、以及3-脱氧葡糖醛酮的捕获活性。
图27显示加入腹膜透析液中的巯基化合物对戊糖定产生的抑制效应。
实施本发明的最佳模式本发明参照以下实施例更具体地举例说明，但并非限制。
实施例1．测定腹膜透析液和腹膜透析液排出液中出现的羰基化合物的量为了证实腹腔中羰基压力的产生，按以下实验方法测定腹膜透析液排出液中出现的羰基化合物的量。
(ⅰ)羰基化合物的测定将腹膜透析液(Baxter Ltd；Dianeal PD-225)施用于腹膜透析病人，并使之充盈在腹腔中过夜，收集该病人的腹膜透析液排出液。取腹膜透析液和腹膜透析液排出液的等分试样(400μl)，分别与含有1.5mM 2,4-二硝基苯基肼(2,4-DNPH)(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.)的0.5N盐酸溶液400μl混合，室温搅拌30分钟使羰基化合物与2,4-DNPH反应。然后，向该混合物中加入1M丙酮的水溶液(40μl)，室温搅拌5分钟以除去过量2,4-DNPH。将该混合物用400μl正己烷洗三次。回收水相，在微滴板分光光度仪(NipponMolecular Devices Co.；SPECTRAmax250)上读取360nm处的吸收值。
(ⅱ)制备标准曲线制备各种浓度的葡萄糖水溶液，用(ⅰ)所述方法测定葡萄糖衍生的羰基化合物量。葡萄糖浓度对羰基化合物浓度的标准曲线根据此实验制备。
(ⅲ)羰基化合物的定量腹膜透析液和腹膜透析液排出液各自的葡萄糖浓度用葡萄糖测试盒(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.；萄萄糖CII-Test Wako)测定。由葡萄糖衍生的羰基化合物量用标准曲线估计。流体中羰基化合物的量为样品溶液中羰基化合物的总量减去葡萄糖衍生的羰基化合物量的所得。
结果见图1。已在腹腔中充盈过夜的腹膜透析液排出液含有5倍于腹膜透析液在给药前的羰基化合物的量。这表明，羰基化合物从血液中转移至腹腔。
实施例2．腹膜透析病人腹膜中羰基修饰的蛋白质的组织学定位腹膜透析病人腹膜组织中羰基化合物的定位以丙二醛作指示剂用免疫染色进行研究。
腹膜透析病人(50岁男性，有5年腹膜透析史)的腹膜组织按Horie等(Horie,K.等，临床研究杂志，100,2995-3004(1997))的方法进行免疫染色。所用第一抗体为小鼠抗丙二醛单克隆抗体。结果显示，强阳性信号出现在已去除的间皮细胞下层的结缔组织中，以及增厚的脉管壁上(图2)。
丙二醛(MDA)为羰基化合物，其通过过氧化脂质的降解产生。因此，免疫染色用抗4-羟基-2-壬烯醛(其为过氧化脂质的降解产物，而非MDA的降解产物)、抗羧甲基赖氨酸和戊糖定(它们由糖类氧化产生)的抗体来进行。结果显示，阳性信号定位于图2所示的相同区域。这些说明，在腹膜透析病人的腹膜组织中，引起过氧化脂质的降解产物和糖类氧化产生的羰基化合物导致羰基压力增大，蛋白质在羰基压力的增强过程中得到修饰。
实施例3．腹膜细胞被甲基乙二醛损伤长期腹膜透析导致的超滤作用降低已被作为腹膜表面可用于扩散交换的区域存在的证据(Krediet RT,Kidney Int,55:341-356(1999)；Heimburger O等，Kidney Int,38:495-506(1990)；Imholz AL等，Kidney Int,43:1339-1346(1993)；Ho-dac-Pannekeet MM等，Perit Dial Int,17:144-150(1997))。即，腹膜透析液中的葡萄糖从腹腔扩散而出，从而减弱基于渗透压梯度的透析功能。腹膜内血管表面积的增加也可能造成这种情况。此外，血管内皮细胞生长因子(VEGF)也可能在该病理状况中起重要作用。VEGF可增加血管通透性(Senger DR等，科学219:983-985(1983)；Connolly DT等，生物化学杂志，264:20017-20024(1989))，刺激一氧化氮(NO)合成和血管舒张(Hood JD等，美国生理学杂志，274:H1054-1058(1998))，诱导炎性应答(Clauss M等，实验医学杂志，172:1535-1545(1990)；Melder RJ等，Nat Med,2:992-997(1996))。此外，VEGF是强效血管生成因子，可促进血管损伤的恢复(ThomasKA，生物化学杂志，271:603-606(1996)；Ferrara N等，内分泌综述(EndocrRev),18:4-25(1997)；Shoji M等，美国病理学杂志，152:399-411(1998))。结果，检查了透析液中所含葡萄糖降解产物对VEGF生成的影响。
<3-1>在有葡萄糖降解产物存在时培养的腹膜间皮细胞和血管内皮细胞中VEGF的表达腹膜来自6周龄雄性CD(SD)IGS大鼠(Charles-River,Kanagawa，日本)。按Hjelle等的方法(Hjelle JT等，Perit Dial Int,9:341-347(1989))分离间皮细胞，将其培养于含10％胎牛血清的Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)中。将传代至7-10代的间皮细胞，于CO2培养箱中，在各种浓度的葡萄糖降解产物(乙二醛，甲基乙二醛(Sigma,St.Louis,MO)，或3-脱氧葡糖醛酮(由Fuji Memorial研究所，Otsuka Pharmaceutical Co.,Kyoto，日本，友情提供))存在的情况下，培养3小时。用半定量的RT-PCR分析VEGF mRNA的表达。用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen，德国)分离间皮细胞的总RNA。用oligo(dT)12-18引物(Gibco BRL,Gaithersburg,MD)及200单位的不含Rnase H的逆转录酶(SuperscriptⅡ:Gibco BRL)对5μg上述RNA进行逆转录，如文献所述(Miyata T等，临床研究杂志，93:521-528(1994))实施PCR扩增。用于扩增大鼠VEGF的引物序列为5’-ACTGGACCCTGGCTTTACTGC-3’(SEQ ID NO:1)和5’-TTGGTGAGGTTTGATCCGCATG-3’(SEQ IDNO:2)。扩增产物长310bp。用于扩增大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)的引物为5’-CCTGCACCACCAACTGCTTAGCCC-3’(SEQ ID NO:3)和5’-GATGTCATCATATTTGGCAGGTT-3’(SEQID NO:4)，扩增得到322bp的片段。G3PDH作为内部RNA对照可比较不同标本之间的RNA水平。标本在DNA热循环仪(Perkin Elmer Cetus,Norwork,CT)中扩增，以测定循环(94℃0.5分钟、60℃1分钟、72℃1.5分钟)的适当次数。在初步实验中，对各种量的RNA实施16,18,21,25,28,31，和34次循环的逆转录和PCR扩增。这些实验显示，对VEGF mRNA扩增30个循环，对G3PDH mRNA扩增21个循环，PCR产物信号可与掺入的RNA相当。将PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳分离并用溴乙锭染色，经定量程序(NIH image)测定信号强度，从而定量该PCR产物。对葡萄糖降解产物的每一浓度进行实验。信使RNA的测定重复三次，每次实验的结果取平均值。对每一实验条件进行3-4次不同实验。结果取平均值并表示为平均值±标准差(S.D.)。用方差分析(ANOVA)评估统计学显著性。如果经过该分析显示出显著性差异，将甲基乙二醛的不同浓度的结果用Scheffe氏t检验进行比较。
在0-400μM的浓度范围内，乙二醛或3-脱氧葡糖醛酮均不能改变VEGF的表达(图3A和3B)。只有甲基乙二醛在400μM的浓度下可刺激VEGF mRNA表达(P＜0.0005)(图3C)。未经逆转录的RNA样品不产生PCR产物。所有细胞均保持活性。间皮细胞也在高浓度3-脱氧葡糖醛酮(0.625,2.5，和5mM)存在时进行培养，显示其活性降低(在有0.625,2.5，和5mM的3-脱氧葡糖醛酮存在时细胞活性分别为80,55,和8％)。由于活性降低，VEGF mRNA的表达无法检测。根据这些观察，仅有甲基乙二醛在后续实验中使用。
将间皮细胞在有各种浓度的甲基乙二醛存在时培养24小时，用ELISA分析释放至培养上清中的VEGF蛋白。人微血管内皮细胞购自Kurabo(Osaka，日本)并培养于VEGF已排除的EGM-2培养基(Takara,Tokyo，日本)中。以对大鼠腹膜间皮细胞相同的方法使这些细胞与甲基乙二醛一起温育。培养上清中的VEGF蛋白(重复三份)用试剂盒(Quantikine:R&DSystems,Minneapolis,USA)按说明书经酶联免疫吸附实验(ELISA)定量。实验重复三次。结果如上述进行统计学分析。
结果，培养基中加入甲基乙二醛导致VEGF以浓度依赖方式增长(图4)。缺乏甲基乙二醛时未检测到VEGF的释放。即，在蛋白质水平上，甲基乙二醛也是以浓度依赖的方式刺激VEGF的产生和释放。
然后评估有各种浓度(0-400μM)甲基乙二醛存在时培养的内皮细胞中VEGF mRNA的表达。实验如对大鼠间皮细胞所进行的一样。但用于扩增人VEGF的引物为5’-GGCAGAATCATCACGAAGTGGTG-3’(SEQ ID NO:5)和5’CTGTAGGAAGCTCATCTCTCC-3’(SEQ ID NO:6)。扩增的片段长271bp。同样的引物还用于扩增人和大鼠的G3PDH。分析显示，VEGF mRNA以浓度依赖的方式表达(图5)。
<3-2>腹膜内注射了甲基乙二醛的大鼠的腹膜组织中VEGF的表达为了进一步评估甲基乙二醛对腹膜中VEGF mRNA表达的体内生物学效应，大鼠腹腔连续10天接受各种量的甲基乙二醛。6周龄雄性CD(SD)IGS大鼠每天腹膜内注射50mg/kg含各种浓度甲基乙二醛的生理盐水，共10天。从腹腔壁上分离腹膜，检查其VEGF mRNA表达。如上述对大鼠间皮细胞的体外实验一样进行实验。但用ISOGEN(Nippon Gene,Tokyo，日本)提取腹膜组织的mRNA。此外，对VEGF mRNA经PCR扩增28个循环，对G3PDHmRNA经PCR扩增16个循环。
如图6所示，腹腔壁腹膜标本中的VEGF mRNA随甲基乙二醛浓度的增加而显著增加(P＜0.05)。在光学显微镜下，腹膜组织未受感染血管数、血管壁、间质、以及间皮细胞均维持正常。
<3-3>长期腹膜透析病人腹膜组织的VEGF和羧甲基赖氨酸(CML)的免疫染色用免疫组化技术检查9例腹膜透析病人腹膜组织中的VEGF和羧甲基赖氨酸的分布。羧甲基赖氨酸衍生自葡萄糖降解产物如乙二醛和3-脱氧葡糖醛酮(Miyata T等，KidneyInt,55:389-399(1999))。故用抗羧甲基赖氨酸的抗体作为葡萄糖降解产物修饰的蛋白质的标志物。
经同意，从9例非糖尿病腹膜透析病人在其重新插管期间分离腹膜组织(表1)。因导管破裂、插入位置不正确、和/或导管阻塞造成插管失败，故必需重新插管。无一例病人患有腹膜炎。经腹部手术从两例男性受试者(48岁和52岁，肾功能正常)获得正常腹膜组织。
将2μ厚的腹膜组织切片封固在包被有3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(Sigma)的载玻片上，脱蜡，于蒸馏水中再水化，与含链霉蛋白酶(0.5 mg/μl:Dako,Glostrup，丹麦)的缓冲液(0.05M Tris-HCl(pH7.2),0.1M NaCl)在室温下一起保温15分钟。载玻片用含0.5％土温20的PBS冲洗，于4％脱脂牛奶中封闭2小时，再与抗VEGF的兔IgG(Santa Cruz Biotechnology,SantaCruz,CA)或抗AGE的小鼠IgG(Ikeda K等，生物化学，35:8075-8083(1996))于4℃湿室中一起保温过夜，所述抗体的表位为羧甲基赖氨酸(Miyata T等，Kedney Int,51:1170-1181(1997))。切片冲洗后，与1∶100稀释的辣根过氧化酶偶联型山羊抗兔IgG或辣根过氧化酶偶联型山羊抗小鼠IgG(Dako)于室温保温2小时，然后用含0.003％H2O2的3,3｀-二氨基联苯胺检测。也用高碘酸-Schiff染色实施组织学分析。由两位观察者分别经免疫染色评估信号强度和分布。
结果见表1。该表中，“正常1”和“正常2”表示有正常肾功能的受试者的标本，“PD1”至“PD9”表示腹膜透析病人的标本。在长期腹膜透析病人(表1的PD6)的腹膜组织图片中，观察到多孔纤维，以及血管壁的增厚和透明变性。VEGF和羧甲基赖氨酸共定位于间皮细胞内和血管壁上。在间皮层中，VEGF的信号比羧甲基赖氨酸的信号弱。另8例病人的结果与此类似。在正常腹膜标本(表1的正常2)中，与腹膜透析标本形成对照，VEGF仅出现在血管壁上，间皮层中没有。羧甲基赖氨酸在间皮层中没有，在血管壁上信号很弱。另一正常对照标本的结果与此类似。用正常小鼠IgG进行免疫染色没有结果。因此，间皮层中的VEGF表达及其与羧甲基赖氨酸的共定位仅出现在腹膜透析病人中，这提示腹膜透析液中的葡萄糖降解产物确实促进了接受腹膜透析的尿毒症病人的VEGF生成。
表1．PD(腹膜透析)病人腹膜组织中CML和VEGF的免疫组化检测
-阴性，±弱，+阳性，++强阳性上述结果证实，腹膜透析病人由于腹膜透析液中存在葡萄糖降解产物等物质，所以都有羰基压力，此外，还首次证实甲基乙二醛促进腹膜细胞中的VEGF生成。这提示，腹膜透析液中所含葡萄糖降解产物导致的腹膜通透性的降低至少部分归因于对VEGF生成的促进以及伴随而来的对血管生成的刺激。
实施例4．加入腹膜透析病人的腹膜透析排出液中的羰基化合物捕获剂的作用
<4-1>
戊糖定为AGE结构，其在肾衰病人血液中比在健康人血液中多20倍(Miyata,T.等，美国肾病协会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.),7:1198-1206(1996))。发明人检测了37℃保温腹膜透析病人的排出液时，加入氨基胍如何使戊糖定和蛋白质上的羰基增加。
将放置过夜的腹膜透析病人的排出液离心，将所得上清过滤除菌(孔径大小0.45μm)。向其中加入氨基胍(Tokyo Kasei Kogyo Co.)至终浓度为0,1,10，或100mM。将混合物37℃保温。分析戊糖定时保温1-2周，分析蛋白质的羰基时保温2周。在用6N HCl于110℃水解蛋白质后用HPLC(SHIMADZU Co.；LC-10A)定量分析戊糖定(T.Miyata等，1996，美国肾病协会杂志，7:1198-1206；T.Miyata等，1996，美国国家科学院院刊，93:2353-2358)。通过将蛋白质与2,4-二硝基苯肼(2,4-DNPH；Wako PureChemical Industries,Ltd.)保温使羰基反应后，测定所产生的腙的光吸收值(Nippon Molecular Devices Co.；SPECTRAmax250)，而定量测定蛋白质的羰基(Levine,R.L.等，酶学方法，233,346-357(1994))。
根据上述实验结果，氨基胍显示能以浓度依赖的方式抑制戊糖定的产生(图8)。氨基胍对蛋白质羰基的产生显示类似的浓度依赖性抑制作用(图9)。
<4-2>
然后，根据以下实验方法检测氨基胍对已在腹膜透析病人体内过夜之体液中羰基化合物而非葡萄糖的量的影响。
(A)腹膜透析排出液的保温回收病人的腹膜透析排出液，用孔径0.45μm的滤膜过滤。向其中加入0,10,50，或250mM的氨基胍(Tokyo Kasei Kogyo Co.)以制备样品溶液。取一等份样品溶液(1ml)加入带有螺旋帽的塑料试管，37℃保温15小时。保温前将该样品溶液于-30℃保存。
(B)羰基化合物的定量(i)对样品溶液中存在的羰基化合物的分析取几份400μl等份的样品溶液，分别与400μl的含1.5mM2,4-DNPH(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)之0.5N盐酸溶液混合，然后，室温搅拌该混合物30分钟使羰基化合物与2,4-DNPH反应。随后向该混合物中加入1M丙酮水溶液(40μl)。将所得混合物室温搅拌5分钟，使过量的2,4-DNPH通过与丙酮反应而除去。将混合物水溶液用400μl正己烷洗三次。回收水相，在微滴板分光光度读取仪(Nippon Molecular Devices Co.；SPECTRAmax250)上检测其360nm的光吸收值。
(ⅱ)标准曲线的制定制备各种浓度的葡萄糖水溶液，用(ⅰ)所述方法测定葡萄糖所衍生的羰基化合物量；根据该实验制定葡萄糖浓度对羰基化合物浓度的标准曲线。
(ⅲ)羰基化合物的定量用葡萄糖分析试剂盒(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.；Glucose CII-Test Wako)测定各种葡萄糖浓度的样品。葡萄糖衍生的羰基化合物量用该标准曲线估计。样品中羰基化合物的量为样品溶液之羰基化合物总量减去葡萄糖衍生的羰基化合物量的所得。
结果见图10。随着氨基胍的浓度增加，未保温和保温(37℃15小时)样品中的羰基化合物而非葡萄糖的量降低。
这些结果显示，将羰基化合物捕获剂加入腹膜透析液或施用于病人可有效抑制注入腹腔之腹膜透析液中羰基化合物的产生和/或积累。因此，衍生于腹膜透析液或血液的羰基化合物均从腹腔中减少，从而改善了腹膜透析病人的羰基压力。
实施例5．在腹膜透析液的加热灭菌过程中加入羰基化合物捕获剂的作用腹膜透析液含有高浓度葡萄糖作为渗透压调节剂(1.35-4.0w/v％)。葡萄糖不能加热，在加热灭菌或保存期间被降解。已报道葡萄糖的降解产物包括5-羟甲基糠醛(5-HMF)，乙酰丙酸，以及乙醛(Richard,J.U.等，Fund.Appl.Toxic.,4:843-853(1984),Nilsson,C.B.等，Perit.Dial.Int.,13:208-213(1993))。本发明人通过监控5-HMF和羰基化合物含量，检测了氨基胍对腹膜透析液加热灭菌期间羰基化合物之产生的抑制作用。由于葡萄糖的降解程度受溶液pH的影响，故制备了酸性pH(pH5.3)和中性pH(pH7.0)的两种腹膜透析液来进行该实验。灭菌温度为121℃。
<5-1>
5-HMF用高压液相层析(SHIMADZU Co.；LC-10A)进行分析(Nillson,C.B.等，Perit,Dial.Int.,13:208-213(1993))。
结果显示，氨基胍在酸性pH(图11)和中性pH(图12)条件下以浓度依赖的方式有效抑制5-HMF的生成。
<5-2>
用实施例1所述方法，通过测定腹膜透析液与2,4-DNPH反应后的光吸收值，而测定腹膜透析液中的羰基化合物(Levine,R.L.等，酶学方法，233:346-357(1994))。灭菌温度121℃。
结果显示，氨基胍以浓度依赖方式有效抑制羰基化合物的生成(图13)。
这些发现清楚表明，在腹膜透析液中加入抑制羰基化合物生成的试剂可极有效抑制腹膜透析液中羰基化合物的产生和/或积累。
实施例6．羰基化合物捕获珠加入腹膜透析液后对戊糖定生成的影响羰基化合物捕获珠含有磺酰肼偶联型聚苯乙烯树脂(PS-TsNHNH2；ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)，测定其消除腹膜透析液中羰基化合物的效应。将腹膜透析液，和含有羰基化合物捕获珠的透析液于37℃保温，以评估抑制戊糖定生成的效应。向含有羰基化合物捕获珠的试管中加入二甲亚砜(100μl)，使所述珠溶胀。然后向试管中加入800μl腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)和200μl 150mg/ml牛血清清蛋白的水溶液。试管于37℃保温1周。然后，用膜孔径0.22μm的离心过滤管(Millipore Co.；UFC30GV00)除去所述珠。然后向已除去珠的溶液(50μl)中加入50μl 10％三氯乙酸。将该混合物离心以沉淀蛋白质。将蛋白质沉淀用300μl 5％三氯乙酸洗涤，然后干燥。接着，向该蛋白质沉淀中加入100μl 6N HCl，使溶解的蛋白质于110℃加热16小时。用HPLC定量所得样品的戊糖定(T.Miyata等，1996，美国肾病协会杂志，7:1198-1206；T.Miyata等，1996，美国国家科学院院刊，93:2353-2358)。
通过37℃保温后产生的戊糖定量见图14所示。其表明，加入羰基化合物捕获珠可极有效地抑制戊糖定产生。
实施例7．腹膜透析液中加入羰基化合物捕获珠的羰基化合物消除效应检测羰基化合物捕获珠消除腹膜透析液中羰基化合物的效应。向含有羰基化合物捕获珠(PS-TsNHNH2；ARGONAUT TECHNOLOGIES CO.)的试管中加入二甲亚砜(100μl)，以使珠溶胀。再加入900μl腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)。用旋转器室温搅拌该混合物16小时。然后将含有羰基化合物捕获珠的悬浮液用膜孔径0.22μm的离心过滤管(Millipore Co.；UFC30GV00)过滤，经以下方法测定滤液中羰基化合物的量。
<羰基化合物的定量>
(1)样品溶液的分析将样品溶液(200μl)与200μl的含2,4-DNPH(0.025％)之0.5N盐酸溶液混合，30℃保温30分钟。随后向该混合物中加入1M丙酮水溶液(20μl)。将所得混合物30℃保温10分钟。将混合物水溶液用200μl正己烷洗三次，在水相加入200μl辛醇以抽提腙。回收辛醇层，在微滴板分光光度读取仪(Nippon Molecular Devices Co.；SPECTRAmax250)上检测360nm的光吸收值。
(2)标准曲线的制定制备各种浓度的葡萄糖水溶液，用(1)所述方法测定葡萄糖所衍生的羰基化合物量；根据该实验制定葡萄糖浓度对羰基化合物浓度的标准曲线。
(3)羰基化合物的定量用葡萄糖分析试剂盒(Wako Pure ChemicalIndustries,Ltd.；Glucose CII-Test Wako)测定各种葡萄糖浓度的样品。葡萄糖衍生的羰基化合物量用该标准曲线估计。样品溶液中羰基化合物的量为样品溶液之羰基化合物总量减去葡萄糖衍生的羰基化合物量。
结果见图15。在腹膜透析液中加入羰基化合物捕获珠(2mg)，室温搅拌该悬浮液16小时。该处理可减少55％的羰基化合物。当加入透析液的羰基化合物捕获珠为10mg时，羰基化合物的量进一步减少。
这些结果清楚表明，带有固定化羰基化合物捕获剂的载体可用于抑制腹膜透析液中羰基化合物的产生和/或积累。
实施例8．活性炭对二羰基化合物溶液中羰基化合物的捕获活性用活性炭作为羰基化合物捕获剂，评估其消除二羰基化合物溶液中羰基化合物的效应。将一种二羰基化合物(100μM)溶于磷酸盐缓冲液(简称“PBS”)，制备出二羰基化合物溶液。将该溶液(900μl)加入含25μg或50μg活性炭(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的试管中。所用二羰基化合物为乙二醛、甲基乙二醛、以及3-葡糖醛酮。将试管置于旋转器上，室温搅拌19小时。然后，将试管中的溶液用膜孔径0.22μm的离心过滤管(Millipore Co.；UFC30GV00)过滤。每种二羰基化合物的浓度用高压液相层析根据常用方法测定。
结果见图16。将25μg活性炭加入900μl二羰基化合物溶液时，活性炭所捕获的乙二醛(GO)为71％、甲基乙二醛(MGO)为94％、3-葡糖醛酮(3DG)为93％。加入50μg活性炭时，活性炭所捕获的乙二醛为85％、甲基乙二醛和3-葡糖醛酮均为98％。故，证实所检测的每种二羰基化合物的大多数均被活性炭捕获。
实施例9．活性炭对腹膜透析液中羰基化合物的捕获活性用活性炭作为羰基化合物捕获剂，评估其消除腹膜透析液中羰基化合物的效应。将一等份(900μl)腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)加入含25μg或50μg活性炭(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的试管中。将试管置于旋转器上，室温搅拌19小时。然后，将试管中的溶液用膜孔径0.22μm的离心过滤管(Millipore Co.；UFC30GV00)过滤。乙二醛、甲基乙二醛、以及3-葡糖醛酮的浓度用高压液相层析根据常用方法测定。
结果见图17。将25μg活性炭加入900μl腹膜透析液时，活性炭所捕获的乙二醛(GO)为56％、甲基乙二醛(MGO)为71％、3-葡糖醛酮(3DG)为62％，均为与不含活性炭的透析液比较。加入50μg活性炭时，活性炭所捕获的乙二醛为64％、甲基乙二醛为78％、3-葡糖醛酮为77％。故，证实所检测的每种二羰基化合物均被活性炭捕获。
实施例10．胍、氨基胍、和双胍试剂捕获乙二醛、甲基乙二醛、以及3-葡糖醛酮的活性将乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮(各1mM)的混合物(50μl)再与0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)400μl，以及胍、氨基胍、或一种双胍试剂(各50μl；30mM)混合。将所得混合液37℃保温。所用双胍试剂为二甲双胍、丁二胍、和苯乙双胍。保温后，用邻苯二胺将乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮转化为喹喔啉衍生物，并用高压液相层析测定各自的浓度。
结果见图18(胍)、图19(二甲双胍)、图20(丁二胍)、图21(苯乙双胍)、和图22(氨基胍)。胍、氨基胍、以及所有双胍试剂均显示能显著降低甲基乙二醛(具体而言)的浓度。此外，氨基胍极显著降低甲基乙二醛的浓度，并明显降低3-葡糖醛酮的浓度(其不因其它双胍试剂而明显降低)。
实施例11．含巯基试剂捕获乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮的活性将乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮(各1mM)的混合溶液(50μl)再与0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)400μl，以及巯基化合物溶液(50μl；30mM)混合。将所得混合液37℃保温。所用巯基化合物为半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、和GSH。保温后，用邻苯二胺将乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮转化为喹喔啉衍生物，并用高压液相层析测定各自的浓度。
结果见图23(半胱氨酸)、图24(N-乙酰半胱氨酸)、和图25(GSH)。发现所有巯基化合物均显示能显著降低乙二醛和甲基乙二醛的浓度。
实施例12．清蛋白捕获乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮的活性将乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮(各1mM)的混合溶液(50μl)再与0.1 M磷酸盐缓冲液(pH7.4)400μl，以及100mg/ml牛血清清蛋白溶液50μl混合。将所得混合液37℃保温。保温后，用邻苯二胺将乙二醛、甲基乙二醛、和3-葡糖醛酮转化为喹喔啉衍生物，并用高压液相层析测定各自的浓度。
结果见图26。发现牛血清清蛋白能显著降低乙二醛和甲基乙二醛的浓度。
实施例13．巯基化合物加入腹膜透析液并于37℃保温后对戊糖定生成的抑制效应将一等份(490μl)腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)与70μl含巯基化合物的0.1 M磷酸盐缓冲液(pH7.4)以及140μl含30mg/ml牛血清清蛋白之腹膜透析液(Baxter Ltd.；Dianeal PD-4,1.5)混合。将所得混合液37℃保温1周。所用巯基化合物为半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、和GSH。还用到氨基胍。保温后，向该溶液(50μl)中加入50μl 10％三氯乙酸。离心该混合物以沉淀蛋白质。沉淀的蛋白质用300μl 5％三氯乙酸洗涤，然后干燥。接着，向蛋白质沉淀中加入100μl 6NHCl，将溶解的蛋白质110℃加热16小时。用高压液相层析定量所得样品的戊糖定(T.Miyata等，1996，美国肾病协会杂志，7:1198-1206；T.Miyata等，1996，美国国家科学院院刊，93:2353-2358)。
结果见图27。表明加入含巯基化合物可极有效地抑制戊糖定产生。
工业实用性本发明可轻易消除腹膜透析期间由羰基化合物导致的长期折磨病人的毒性损害。当使用传统腹膜透析液时，由于透析期间从机体其它部位转移至腹腔的羰基化合物，以及由于透析液制备过程中产生的羰基化合物，导致病人被透析的腹膜长期处于羰基压力之下。相比之下，本发明可有效消除腹膜透析液中产生的羰基化合物，并因此可有效改善透析病人的羰基压力。此外，转移至腹腔的羰基化合物还可通过注入羰基化合物捕获剂或使透析液通过羰基化合物捕获药筒进行循环而有效灭活或消除。因此，本发明提供一种预防由腹膜透析所致损害，包括与腹膜透析相关的羰基化合物所致损害的很有效的方法。
此外，本发明能除去加热或长期保存期间因葡萄糖的降解所产生的羰基化合物，从而成功提供了一种中性pH的腹膜透析液，其在目前的制药学上因葡萄糖的降解而难以制备。因此，本发明能提供更符合生理学的腹膜透析治疗。
本发明的腹膜透析液实际可用简单的方法制备，如与羰基化合物捕获剂接触或直接施用。此外，本发明腹膜透析液的生产不需要任何专用设备。因此本发明的羰基化合物捕获剂、用其制备的腹膜透析液、以及其生产方法为腹膜透析治疗带来一个全新的治疗概念。
序列表<110>KUROKAWA,KiyoshiMIYATA,Toshio<120>羰基压力改善剂和腹膜透析液<130>KRK002DP1PCT<140><141><150>JP 1998-237108<151>1998-08-24<150>JP 1999-155393<151>1999-06-02<160>6<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>1actggaccct ggctttactg c 21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>2ttggtgaggt ttgatccgca tg 22<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>3cctgcaccac caactgctta gccc 24<210>4<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>4gatgtcatca tatttggcag gtt23<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>5ggcagaatca tcacgaagtg gtg23<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述人工合成的引物序列<400>6ctgtaggaag ctcatctctc c 2权利要求
1．一种用于改善腹膜透析期间腹膜内的羰基压力状态的试剂，其包含一种羰基化合物捕获剂作为活性成分。
2．权利要求1的试剂，其中羰基化合物捕获剂固定在不溶性载体上。
3．权利要求1的试剂，其中羰基化合物捕获剂与腹膜透析液混合。
4．权利要求1-3中任一项的试剂，其中羰基化合物捕获剂选自氨基胍、吡哆胺、肼、双胍化合物、含巯基化合物、以及它们的衍生物。
5．权利要求1-3中任一项的试剂，其中羰基化合物捕获剂为抑制美拉德反应的试剂。
6．权利要求1的试剂，其中羰基化合物捕获剂为不溶于腹膜透析液但能吸收羰基化合物的化合物。
7．一种用于捕获腹膜透析液中羰基化合物的药筒，其中该药筒中装有权利要求2和/或权利要求6的羰基化合物捕获剂。
8．一种用于制备羰基化合物含量降低的腹膜透析液的方法，该方法包括使所述腹膜透析液通过权利要求7的药筒。
9．一种用于制备羰基化合物含量降低的腹膜透析液的方法，该方法包括(a)使所述腹膜透析液与权利要求2和/或权利要求6的羰基化合物捕获剂接触，和(b)使所述腹膜透析液与所述羰基化合物捕获剂分离。
10．一种含有羰基化合物捕获剂的腹膜透析液。
11．权利要求10的腹膜透析液，其中该腹膜透析液还含有一种还原糖，并被置于含有第一室和第二室的一个容器内，使第一室容纳所述还原糖，第二室容纳所述羰基化合物捕获剂。
12．权利要求10的腹膜透析液，其中所述羰基化合物捕获剂于腹腔内施用。
全文摘要
本发明将缓解腹腔内羰基压力的药物应用于腹膜透析,所述药物以羰基化合物捕获剂作为活性成分。腹膜透析期间形成并累积的羰基化合物由诸如氨基胍之类的羰基化合物捕获剂灭活或消除。腹膜透析液的灭菌和保存期间形成的羰基化合物通过事先与所述捕获剂接触而被消除。此外,在腹膜透析液中添加所述捕获剂或通过应用药筒使所述捕获剂循环以捕获羰基化合物,有可能消除病人血液中产生并在透析过程中流入腹腔中的羰基化合物。从而可抑制腹腔中的蛋白质修饰和缓解因腹膜透析造成的腹膜损伤。
文档编号A61M1/28GK1324248SQ99812545
公开日2001年11月28日 申请日期1999年8月23日 优先权日1998年8月24日
发明者宫田敏男 申请人:黑川清, 宫田敏男