五龙鹅的融合催乳素主动免疫提高产蛋率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及产蛋技术领域，具体涉及五龙鹅的融合催乳素主动免疫提高产蛋率的 方法。
【背景技术】
[0002] 五龙鹅是我国优良地方家禽品种，它的突出优点是体型小，产蛋多，屠宰率高，同 时五龙鹅还具有耐粗饲、觅食能力强、以草食为主、抗病能力强、放牧圈养都可以为季节性 产蛋，且就巢性极强，导致其产蛋量低下。因此，消除就巢性可能成为提高五龙鹅繁殖性能 的有效手段。
[0003] 禽类的就巢性与血浆PRL水平变化有关。血浆PRL浓度上升到一定的程度可引发 就巢，就巢开始后，就巢行为本身又促进PRL的分泌，高PRL水平进而继续维持就巢行为，产 蛋期火鸡注射PRL能使就巢行为立刻产生，强制终止火鸡就巢将导致血浆中PRL水平迅速 下降。在五龙鹅繁殖周期中PRL含量水平测定结果表明，就巢期的PRL，水平显著高于休产 期和产蛋期。对矮脚鸡PRL的主动免疫和对促PRL释放因子一VIP的被动免疫均可以降低 就巢发生率。这证明了 PRL在血浆中的浓度变化是禽类就巢发生和维持的重要因素。
[0004] 以五龙鹅为实验动物，通过实验室技术克隆PRL基因，可经原核诱导表达制备重 组催乳素，在产蛋后期采取主动免疫手段，并测定鹅血清中与就巢相关激素的浓度，同时观 察记录休产间隔、产蛋量。探讨降低鹅就巢率和提高产蛋率途径，为进一步提高鹅的繁殖性 能和产业化生产提供依据，同时对其它禽类遗传学、行为学和内分泌学等方面的研宄具有 重要的指导意义。
[0005] 现在已有重组催乳素表面抗原多五龙鹅就巢和产蛋的影响，鹅催乳素受体基因 PRLRSNPs检测及其与产蛋量的关系，调控四季鹅繁殖周期提高产蛋性能的影响等文章，五 龙鹅的融合催乳素蛋白主动免疫提高繁殖性能尚属空白。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术的缺点和不足，为提高五龙鹅的就巢性和产蛋 率，提供五龙鹅的融合催乳素主动免疫提高产蛋率的方法。
[0007] 五龙鹅的融合催乳素主动免疫提高产蛋率的方法，包括以下步骤： (1) cRNA第一链合成及扩增： 对采集的五龙鹅垂体使用TRIzol试剂提取总RNA，以总RNA为模板，用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 合成 cDNA，PCR 反应产物检测及电泳用 1% 琼脂 糖凝胶，电泳检测目的基因，切胶回收； (2) PRL原核表达载体的建立、筛选和鉴定： 向上清中添加硫酸铵至20 %饱和度，冰上搅拌至硫酸铵完全溶解静置过夜后， 8000rpm，冷冻15min离心15min，收集上清； (3) 向步骤2的上清中加入硫酸铵至50%饱和度，冰上搅拌至硫酸铵完全溶解静置过 夜后，8000rpm，冷冻15min离心15min，收集沉淀； (4) 重组PRL蛋白诱导表达及破碎： 过夜复苏保种菌，振荡培养至OD值约为0. 45-0. 55时1:1000比例加 I mmol · T1IPTG 诱导，取样处理并设置空白对照、以含空载体的BL21菌为阴性对照，以未转化BL21菌、未诱 导的BL21菌为空白对照，处理方式上同，加入1/4诱导菌液体积的超声裂解缓冲液，振荡混 匀，超声破碎； (5) 重组PRL蛋白纯化、回收： 用Ni-NTA柱纯化，透析袋透析，纯化得到的重组蛋白，超声破碎后弃去沉淀，用Lowry 法测重组PRL蛋白浓度，过Ni-NTA后，Lowry法测定蛋白浓度，计算Ni柱回收率； (6) 重组PRL蛋白注射针剂制备： 测定浓缩蛋白含量，稀释至I mg/ml、2 mg/ml、4mg/ml，与弗式不完全佐剂按体积 1:1混合，采用针管反复推注的方法，使蛋白与佐剂充分混合至白色无液滴状液体，制成 l_2ml\支的注射剂，采取即用即制原则，防止针剂长时间放置出现水油分离的现象； (7) 主动免疫及观察记录： 所有鹅在免疫前采前翅静脉采血，送测血清中催乳素水平。
[0008] 本发明的有益效果是可提高五龙鹅的就巢性和产蛋率，进而可提高五龙鹅的生产 性能和市场价值。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明： 一、实验方法： (I) CRNA第一链合成及扩增： 就地随机取两只五龙鹅，颈部放血处理后取垂体，存于液氮中-80°C保存备用。对采集 的五龙鶴垂体使用TRIzol试剂提取总RNA。以总RNA为模板，用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix合成cDNA。PCR反应产物检测及电泳用1%琼脂糖凝胶，电泳检 测目的基因，切胶回收。
[0010] (2) PRL原核表达载体的建立、筛选和鉴定： 将得到的PCR产物双酶切得到pET32a ( + )片段，4°C保存备用。纯化的PCR产物用T4 连接酶得到连接产物pET32a-PRL，转化感受态细胞并连接pET32a质粒，双酶切鉴定正确后 测序。
[0011] (3)重组PRL蛋白诱导表达及破碎： 过夜复苏保种菌，振荡培养至OD值约为0. 45-0. 55时1:1000比例加 I mmol · T1IPTG 诱导，取样处理并设置空白对照、以含空载体的BL21菌为阴性对照，以未转化BL21菌、未诱 导的BL21菌为空白对照，处理方式上同。加入1/4诱导菌液体积的超声裂解缓冲液，振荡 混匀，超声破碎。
[0012] (4)重组PRL蛋白的SDS-PAGE检测及浓度测定： 制作蛋白胶，加入样品10 μ 1至上样孔中，上样顺序：诱导4h，诱导3h，诱导2h，诱导 lh，M，未诱导菌，未转化菌，空载体菌。浓缩胶电压80V，分离胶电压160V。用染色液染色 30min，脱色液过夜脱色，凝胶照相。Lowry法测定蛋白浓度。
[0013] (5)重组PRL蛋白纯化、回收： 用Ni-NTA柱纯化，透析袋透析，纯化得到的重组蛋白。超声破碎后弃去沉淀，用Lowry 法测重组PRL蛋白浓度，过Ni-NTA后，Lowry法测定蛋白浓度，计算Ni柱回收率；。
[0014] (6)重组PRL蛋白注射针剂制备： 测定浓缩蛋白含量，稀释至I mg/ml、2 mg/ml、4mg/ml，与弗式不完全佐剂按体积 1:1混合，采用针管反复推注的方法，使蛋白与佐剂充分混合至白色无液滴状液体，制成 l_2ml\支的注射剂，采取即用即制原则，防止针剂长时间放置出现水油分离的现象。
[0015] (7)主动免疫及观察记录： 所有鹅在免疫前采前翅静脉采血，送测血清中催乳素水平。
[0016] 二、试验免疫方法： 阴性对照组：颈部皮下注射生理盐水； 阳性对照组：每只鹅口服溴隐亭药片1片； 试验组I :颈部皮下多点注射重组催乳素 PRL Img; 试验组II :颈部皮下多点注射中剂量重组催乳素 PRL 2mg; 试验组III :颈部皮下多点注射高剂量重组催乳素 PRL 4mg ; 重组PRL蛋白首次免疫后10天，五龙鹅采翅静脉血送测，然后加强免疫一次，免疫剂量 同首次，二次免疫后10天，对五龙鹅采翅静脉血送测。
[0017] 观察记录每只鹅，记录每天的就巢行为和产蛋情况，统计各组鹅的就巢数、醒抱数 和产蛋量。A表示就巢鹅，B表示醒抱但未产蛋的鹅，C表示产蛋鹅，每天定点观察鹅群产蛋 及就巢情况。实验采用T检验方法对试验鹅群就巢相关性状和产蛋量进行分析。
[0018] 三、结果： 1、垂体中提取RNA，经引物扩增获得特异性条带，条带大小约600bp，与目的片段大小 一致，测序鉴定后证实为PRL基因片段。
[0019] 2、扩增获得的PRL基因片段两端分别设计有Ecor I、Hind III内切酶位点，经双酶 切后与载体pET32a连接。连接结果进行双酶切鉴定，初步表明载体构建成功。构建成功的 载体经测序鉴定，证明插入序列正确，获得pET32a ( + ) -PRL原核表达质粒。
[0020] 3、表达产物以可溶性蛋白为主，重组菌体蛋白在约44KD处出现目的蛋白 带。分别取lh、2h、3h、4h，不同时间重组蛋白表达量占菌体总蛋白的含量分别为： 13. 6%(±0. 946%)、24. 0%(±2. 50%)、35. 2%(± L 88%)、35. 6%(±3. 33%)，重组 PRL 蛋白表达 量随时间的延长呈平稳增长，诱导表达3小时，其表达量与时间比最为理想，重组PRL融合 蛋白获得了较为高效可溶性表达。
【主权项】
1.五龙鹅的融合催乳素主动免疫提高产蛋率的方法，包括以下步骤： (1) CRNA第一链合成及扩增： 对采集的五龙鹅垂体使用TRIzol试剂提取总RNA，以总RNA为模板，用Easy Script First-Strand cDNA Synthesis Super Mix 合成 cDNA，PCR 反应产物检测及电泳用 1% 琼脂 糖凝胶，电泳检测目的基因，切胶回收； (2) PRL原核表达载体的建立、筛选和鉴定： 向上清中添加硫酸铵至20 %饱和度，冰上搅拌至硫酸铵完全溶解静置过夜后， 8000rpm，冷冻15min离心15min，收集上清； (3) 向步骤2的上清中加入硫酸铵至50%饱和度，冰上搅拌至硫酸铵完全溶解静置过 夜后，8000rpm，冷冻15min离心15min，收集沉淀； (4) 重组PRL蛋白诱导表达及破碎： 过夜复苏保种菌，振荡培养至OD值约为0. 45-0. 55时1:1000比例加 I mmol · T1IPTG 诱导，取样处理并设置空白对照、以含空载体的BL21菌为阴性对照，以未转化BL21菌、未诱 导的BL21菌为空白对照，处理方式上同，加入1/4诱导菌液体积的超声裂解缓冲液，振荡混 匀，超声破碎； (5) 重组PRL蛋白纯化、回收： 用Ni-NTA柱纯化，透析袋透析，纯化得到的重组蛋白，超声破碎后弃去沉淀，用Lowry 法测重组PRL蛋白浓度，过Ni-NTA后，Lowry法测定蛋白浓度，计算Ni柱回收率； (6) 重组PRL蛋白注射针剂制备： 测定浓缩蛋白含量，稀释至I mg/ml、2 mg/ml、4mg/ml，与弗式不完全佐剂按体积 1:1混合，采用针管反复推注的方法，使蛋白与佐剂充分混合至白色无液滴状液体，制成 l_2ml\支的注射剂，采取即用即制原则，防止针剂长时间放置出现水油分离的现象； (7) 主动免疫及观察记录： 所有鹅在免疫前采前翅静脉采血，送测血清中催乳素水平。
【专利摘要】本发明公开了五龙鹅的融合催乳素主动免疫提高产蛋率的方法，包括以下步骤：（1）cRNA第一链合成及扩增；（2）PRL原核表达载体的建立、筛选和鉴定；(3)重组PRL蛋白诱导表达及破碎；（4）重组PRL蛋白的SDS-PAGE检测及浓度测定；(5)重组PRL蛋白纯化、回收；(6)重组PRL蛋白注射针剂制备；(7)主动免疫及观察记录。本发明可提高五龙鹅的就巢性和产蛋率，进而可提高五龙鹅的生产性能和市场价值。
【IPC分类】C07K1-34, C07K1-36, C07K1-22, C12N15-16, C07K14-575, A61K39-00, C12N15-70
【公开号】CN104645323
【申请号】CN201510106534
【发明人】李明义, 刘阳, 李晓林, 李彦凤, 赵航
【申请人】山东信得科技股份有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月12日