一种藤梨根提取物及其在制备治疗胆管癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于含有来自藻类、苔藓、真菌或植物或其派生物，例如传统草药的未确定结构的药物制剂技术领域，具体涉及双子叶植物纲的藤梨根；本发明是利用特殊工艺得到的藤梨根提取物，并在制备治疗胆管癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]胆管癌是起源于胆管上皮细胞的恶性肿瘤，近年来，其发病率在全球范围内呈上升趋势。目前胆管癌的主要治疗手段是早期发现，进行手术切除。然而由于其恶性程度高，发病隐匿，大多数患者在确诊时已处于晚期，不适合手术切除。同时该胆管癌对目前现有的放、化疗方法均不敏感，且预后极差，未手术患者的中位生存期不到I年。因此，迫切需要找到对胆管癌更为有效的药物。
[0003]中药是中华民族数千年来与疾病做斗争过程中形成和积累的宝贵资源，目前世界各国对中药抗肿瘤的机制进行了广泛的研宄，从中草药得到提取物或者单体并开展肿瘤治疗的应用越来越多，并开始得到国内外的承认和重视。中药抗肿瘤机制有多方面，如抑制肿瘤血管形成、促进细胞凋亡、诱导细胞分化、调节机体免疫功能等。藤梨根为猕猴桃科植物猕猴桃植物的根，具有清热解毒、消肿疥、祛风湿的功效，是临床上常用于治疗肝炎、水肿、风湿性关节炎、胃癌和乳腺癌等疾病的中草药，尤其对消化道肿瘤疗效较佳。近年来体内外实验研宄发现，藤梨根制剂对多种肿瘤(如胃癌、结肠癌、食管癌、肺癌肿瘤细胞)表现出较好的抑制作用，可通过多种途径发挥抗肿瘤作用，其药理研宄和临床验证受到广泛关注；而有关藤梨根提取物(Radix Actinidia Extractive，RAE)对胆管癌的作用研宄尚未见报道。
[0004]现有的提取工艺一般是采用水或有机溶剂进行浸提，然后通过乙酸乙酯和正丁醇萃取，再利用石油醚-丙酮，氯仿-甲醇或者聚酰胺进行洗脱，最后得到藤梨根提取物。这样的提取工艺的缺点是工艺繁杂，极易导致提取物中活性成分丢失或者失活而大大降低药效，不适合工业化生产。
【发明内容】
[0005]本发明就是针对上述问题，弥补现有技术的不足，提供一种藤梨根提取物及其在制备治疗胆管癌药物中的应用。该藤梨根提取物对人胆管癌细胞活性，生长具有显著地抑制作用；能够强烈诱导胆管癌细胞凋亡；能够显著抑制胆管癌裸鼠移植肿瘤生长，显示出良好的抗胆管癌活性。
[0006]为实现本发明的上述目的，本发明采用如下技术方案，即本发明提供的藤梨根提取物是通过下述方法制备得到的。
[0007]步骤1、取藤梨根片状药材，采用蒸馏水快速漂洗；然后采用70%酒精快速漂洗，风冷吹干蒸馏水和酒精。
[0008]步骤2、采用高速粉碎机间歇式粉碎至特细颗粒，得藤梨根药材干粉；所述间歇式粉碎为离心lmin，停歇3-5min，使得粉碎机转头恢复至室温，方可再次启动进行粉碎；所述高速粉碎机的转数为20000rpm-30000rpm，所述特细颗粒的粒度为300-500目。
[0009]步骤3、精确称取藤梨根药材干粉，用95%乙醇室温浸泡24h，过滤，得藤梨根药渣。
[0010]步骤4、所述藤梨根药渣采用75%乙醇室温浸泡24h，过滤，弃掉药渣，得藤梨根浸出液；所述藤梨根浸出液4°C保存。
[0011]步骤5、所述藤梨根浸出液采用水浴减压蒸馏浓缩，得浓缩浸出液。
[0012]步骤6、所述浓缩浸出液4°C静置一周，待静置的浓缩浸出液自然分层后，吸取上层黑褐色液体。
[0013]步骤7、所述黑褐色液体进行高速离心，去除不溶解的沉淀物。
[0014]步骤8、采用移液器吸取上清液。
[0015]步骤9、采用针头注射器使上清液通过0.22 μ m滤膜，然后分装到无菌EP管中，放入冰箱4°C保存，备用。
[0016]步骤10、使用前恢复到室温，即得藤梨根提取物。
[0017]本发明还提供所述藤梨根提取物在制备治疗胆管癌药物中的应用。
[0018]与现有技术相比本发明的有益效果。
[0019]本发明提供的藤梨根提取物，通过超细粉碎、低温乙醇提取、减压蒸馏的乙醇提取方法制备而成，以人胆管癌细胞株QBC939和HCCC9810细胞作为研宄对象，采用MTS法、流式细胞术、形态学观察，免疫印迹，及裸鼠移植瘤生长抑制实验等方法，从体内外两条途径观察RAE对人胆管癌细胞的生长抑制作用和凋亡诱导作用，结果表明:(I) RAE能够显著抑制QBC939和HCCC9810两种胆管癌细胞的活性和生长，其细胞生长抑制率呈浓度依赖性；(2) RAE可以强烈诱导两种胆管癌细胞凋亡，有效激活细胞内的凋亡蛋白激酶，如Caspase3，Caspase 8和PARP ; (3) RAE能够显著抑制胆管癌抑制瘤在动物体内生长。综上所述，本发明制备的藤梨根提取物能够在体内、外显著抑制胆管癌细胞生长，并诱导其细胞凋亡，为治疗胆管癌临床药物的开发提供了新的方向。
【附图说明】
[0020]图1为本发明藤梨根提取物制备方法的流程图。
[0021]图2为MTS实验证实RAE对QBC939胆管癌细胞活性具有明显的抑制作用，且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性示意图。
[0022]图3为MTS实验证实RAE对HCCC9810胆管癌细胞活性具有明显的抑制作用，且这种抑制作用呈浓度梯度依赖性示意图。
[0023]图4为RAE对QBC939胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的可见光显微镜细胞形态学变化图。
[0024]图5为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的可见光显微镜细胞形态学变化图。
[0025]图6为RAE对QBC939胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的荧光显微镜细胞核染色图。
[0026]图7为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈凋亡诱导作用的荧光显微镜细胞核染色图。
[0027]图8为RAE对QBC939胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的流式细胞仪定量检测图。
[0028]图9为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的流式细胞仪定量检测图。
[0029]图10为RAE对QBC939胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的三次实验统计结果图。
[0030]图11为RAE对HCCC9810胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的三次实验统计结果图。
[0031]图12为RAE对胆管癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用的蛋白酶切割图。
[0032]图13为RAE对胆管癌细胞裸鼠移植肿瘤具有明显的生长抑制作用的大鼠模型对照图。
[0033]图14为RAE对胆管癌细胞裸鼠移植肿瘤具有明显的生长抑制作用的移植肿瘤大小对照图。
[0034]图15为RAE对胆管癌细胞裸鼠移植肿瘤具有明显的生长抑制作用的肿瘤质量平均值对照图。
【具体实施方式】
[0035]请参阅图1，本实施例提供的藤梨根提取物是通过下述方法制备得到的。
[0036]步骤1、取藤梨根片状药材，采用蒸馏水快速漂洗，去除药材表面灰尘和其他附着物；然后采用70%酒精快速漂洗，去除药材表面附着细菌及其他有害生物；风冷吹干蒸馏水和酒精。
[0037]步骤2、采用25000rpm高速粉碎机粉碎至300目颗粒，得藤梨根药材干粉；所述粉碎为间歇式粉碎，即离心lmin，停歇3min，以避免温度高于50°C ;使得粉碎机转头恢复至室温(25 °C左右)，方可再次启动进行粉碎。
[0038]步骤3、精确称取500.0Og藤梨根药材干粉，用2L 95%乙醇室温浸泡24h，过滤，得藤梨根药渣。
[0039]步骤4、所述藤梨根药渣采用75%乙醇室温浸泡24h，过滤，弃掉药渣，得藤梨根浸出液；所述藤梨根浸出液4°C保存。
[0040]步骤5、所述藤梨根浸出液采用50°C水浴减压蒸馏，浓缩至50ml，得浓缩浸出液。
[0041]步骤6、所述浓缩浸出液4°C静置一周，待静置的浓缩浸出液自然分层后，吸取上层黑褐色液体。
[0042]步骤7、所述黑褐色液体进行12000rpm高速离心30min，去除不溶解的沉淀物。
[0043]步骤8、采用移液器吸取上清液。