受体的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学技术领域，涉及尾静脉注射mmLDL上调小鼠肠系膜动脉α 1受体。
【背景技术】
[0002]弱氧化低密度脂蛋白(minimallymodified low density lipoprotein, mmLDL)是动脉粥样硬化、脑卒中、高血压等疾病发生发展的危险因子，其机制至今尚未研宄清楚。mmLDL是脂质部分被氧化的LDL，可以被LDL受体识别，也可以被进一步氧化成oxLDL。心脑血管疾病与血管收缩功能异常息息有关，交感神经系统对血管的活动有重要的调节作用。交感神经兴奋释放去甲肾上腺素，主要通过兴奋血管平滑肌Q1受体，引起血管收缩。受体是传递生物信息、介导生物效应关键因素。受体本身会因新陈代谢而动态变化，其数量、亲和力和效应会受生理、病理因素的影响而增多或减少。受体的调节是机体维持内环境稳定的重要因素。有文献报道，在高血压大鼠和高血压患者血管平滑肌a肾上腺素受体的反应性增强[1]，我们通过前期研宄已经发现尾静脉注射mmLDL能损伤血管内皮细胞超微结构，损伤血管内皮依赖性舒张[2]。目前，mmLDL对肠系膜动脉α受体的作用尚不清楚。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供尾静脉注射mmLDL上调小鼠肠系膜动脉α I受体。
[0004]进一步，所述mmLDL的制备方法为:所述mmLDL的制备方法为将弱氧化低密度脂蛋白置于含lymol/L FeS04磷酸盐缓冲液中，在4°C透析96h，再用0.25mM EDTA终止氧化反应，生成mmLDL。
【附图说明】
[0005]图1A尾静脉注射mmLDL时间依赖性提高去甲肾上腺素引起的收缩量效曲线，**Ρ〈0.01，*#Ρ〈0.001与生理盐水组比较；
[0006]图1B尾静脉注射mmLDL剂量依赖性提高去甲肾上腺素引起的收缩量效曲线，**Ρ〈0.01，*#Ρ〈0.001与生理盐水组比较；
[0007]图2Α哌唑嗪(10_η?I(T9M)引起mmLDL组去甲肾上腺素引起的收缩量效曲线左移不意图；
[0008]图2B哌唑嗪(10_n?10 _9M)引起生理盐水组去甲肾上腺素引起的收缩量效曲线左移不意图；
[0009]图3A育亨宾(10_7?I(T5M)引起mmLDL组去甲肾上腺素引起的收缩量效曲线左移示意图；
[0010]图3B育亨宾(10_7?I(T5M)引起生理盐水组去甲肾上腺素引起的收缩量效曲线左移不意图；
[0011]图4A mmLDL增加小鼠肠系膜动脉α工受体mRNA表达，内参β-actin(n = 6)，***Ρ〈0.0Ol 与 mmLDL 组比；
[0012]图4B臟0^增加小鼠肠系膜动脉€[1受体蛋白表达，内参64?0!1(11 = 4)，*扑〈0.01与mmLDL组比；
[0013]图5A mmLDL不影响小鼠肠系膜动脉α 2受体mRNA表达，内参β -actin (η = 6)；
[0014]图5B mmLDL不影响小鼠肠系膜动脉α 2受体蛋白表达，内参GAPDH(η = 4)。
【具体实施方式】
[0015]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0016]材料和方法
[0017]1.1主要试剂
[0018]LDL,去甲肾上腺素(Noradrenal ine, NA)，5-轻色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)，普萘洛尔(propranolol,Prop)，乙酰胆喊(acetylcholine, ACh)，呢挫嘆(Prazosin)及育亨宾(Yohimbine)均购于 Sigma 公司，试剂用超纯化水溶解，均用Krebs稀释，浓度以浴槽中最终药物的浓度表示。
[0019]α 丨受体抗体(Proteintech B1technology, Inc of USA)，α 2受体抗体(AmericanResearch Products, Inc.)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠二抗(PierceB1technology, Inc of USA)，GAPDH 单克隆抗体(Proteintech B1technology, IncofUSA) o新鲜动物组织和细胞总RNA抽提试剂盒(Shanghai Novland C0.，Ltd.)，通用逆转录工具包(Shanghai Novland C0., Ltd.)，SYBR Green 试剂盒(Shanghai NovlandC0., Ltd.) ο
[0020]1.2 仪器
[0021]DMT 620Μ 微小血管张力测定仪(Danish Myo Technology A/S，DMT，丹麦)、Powerlab 生物信号米集分析系统(ADInstruments Co, Australia)、Zeiss-2000 系列生物显微镜(德国蔡司光电仪器有限公司)、显微手术解剖工具(World Precis1nInstruments，WPI，美国)，电子天平(BP211D，Startorius 公司)、微量移液器(Dragonmed，芬兰)、HH-2型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)，LG冰箱、优普纯水机(成都优普纯水设备有限公司)，SW-CJ-2FD-超净无菌工作台(苏州安泰空气技术公司)，美国 B1-RAD 电泳仪，MX3000P 实时荧光定量 PCR 仪(Stratagene，U.S.)，Image GaugeVer.4.0 (Fuji Photo Film C0.，Ltd，日本)。
[0022]1.3实验动物与分组
[0023]8?11周龄SPF级的ICR小鼠，体重20?24g，雌雄各半，从西安交通大学医学院动物实验中心购买，动物使用许可证编号:SYXK(陕)2012-005。
[0024]实验组尾静脉注射mmLDL lmg/kg，第I次注射开始计时，每隔12h重复一次，在处死动物的时间点不给药(比如24h组给药时间为O、12h)，分别于24h、48h、72h、96h、120h将小鼠颈部脱臼处死，浓度累加法加入NA，观察mmLDL对血管a受体介导的收缩功能的影响。考察mmLDL对血管a受体作用的量效关系时，设立mmLDL (0.5、I及1.5mg/kg)组。实验设对照组，分别为尾静脉注射生理盐水(normal saline, NS)组和LDI^i [2]。
[0025]1.4血管收缩功能检测
[0026]小鼠脱臼处死，立即取出包含有肠系膜的组织，浸入预冷的Na+-Krebs液(含mM:NaHCO315, NaCl 119、MgCl2L 2、NaH2PO4L 2、无水 CaCl2L 5、KC14.6 和葡萄糖 5.5)中，显微镜下剥离血管周围组织，0.1% Triton x_100血管内灌注10s，去除血管内皮，再用缓冲液冲洗108，20“11的5-!11'预收缩，当乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)引起的舒张率〈10%，认为内皮已被去除。将处理好的血管切成I?2mm长的血管环，在显微镜下穿入两根直径为40 μπι大小的金属丝上，一根连接在可调负荷张力的微调装置上，另一根连接张力换能器，张力换能器与PowerLab系统相连，详细记录血管环的收缩曲线。将血管环放置于充满Na+-Krebs液的37°C恒温浴槽中，为使氧饱和，持续通入含(95% 02+5% CO2)的混合气体，pH保持在7.4左右[3_5] ο保持静息张力为1.5mN，每隔20min更换I次Krebs液，平衡1.5h。加 K+-Krebs 液(含 mM:NaHC0315、NaH2PO4L 2、CaCl2L 5、KCl 63.5、MgCl2L 2、NaCl 60、和葡萄糖5.5)以检测血管环的活性，Na+-Krebs液冲洗血管环三次，重复上述步骤。两次K+-Krebs液引起的收缩幅度均大于ImN并且两次收缩幅度差在10%以内，才可进行后续实验。用Prop(KT9M)于浴槽中孵育血管半小时阻断β受体，再浓度累加法加入NA(10_η?10_4Μ)，考察α受体功能。先分别用Prop与不同浓度a i受体拮抗剂哌唑嗪(10_n?I(T9M)或不同浓度α2受体拮抗剂育亨宾(10 _7?10_5M)孵育血管半小时，再浓度累加法加入NA，分别考察α 2受体在NA引起的收缩量效曲线的作用。
[0027]1.5 RT-PCR
[0028]总的RNA提取使用RNA抽提试剂盒，按照使用说明书提取。检测260nm、280nm吸光度考察总RNA浓度和纯度。按说明书逆转录成cDNA。RT-PCR在MX3000P实时荧光定量PCR仪中进行，使用基因扩增的SYBR Green试剂盒，以cDNA为模版。设立对照组，除不加cDNA外，余平行操作。引物根据基因数据库应用引物表达-2软件设计，
[0029]α 丨受体前引物:5’-ATCCTCTCGGTGGCCTGTCATC-3’ ；
[0030]后引物:5’-AGATGGCAGAGAAGGGCAGCAC-3’ (115bp)。
[0031]α 2受体前引物:5’-AGGTGACACTGACGCTGGTTTG-3’ ；
[0032]后引物:5’-AAGAGGTTTTGGGGAGCTTTGAG-3’(121bp)。管家基因(ke印inggene)β -actin mRNA,在细胞内连续恒定表达，作为mRNA定量的参照。β -actin前引物:5’ -AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3’ ；后引物:5’ -GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’ (119bp)。反应体系为25 μ L，开始在95°C反应3min，94°C反应12s，62°C反应40s，完成40个PCR循环。反应结束后采用分离曲线分析法以确定PCR反应产物的特异性。mRNA定量分析采用PCR循环阈值(Ct)比较法，以β-actin的Ct值为内对照，计算a i受体、α 2受体mRNA相对表达量。
[0033]1.6 Western Blotting
[0034]每个样本由3根小鼠肠系膜动脉组成，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞提取变性缓冲液RIPA裂解液，匀浆。使用BCA蛋白分析试剂盒蛋白定量。提取的蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳进行分离并转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶(T-TBS缓冲液配置)封闭。一抗Cll受体抗体(I: 1000稀释)，α 2受体抗体(I: 1000稀释)和GAPDH抗体(1: 1000稀释)，稀释液为含2 %牛血清白蛋白的PBS ;二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG (1:5000 稀释)。图像经 Image Gauge Ver.4.0 (Fuji Photo Film C0.，Ltd，日本)，对光密度进行分析，并且均采用自身灰度值校正，以目的基因的条带灰度与管家基因的灰度比值表示蛋白的表达水平。
[0035]1.7统计分析
[0036]数据以“均值土标准误”表达，血管环的收缩反应以相对于63.5mM钾引起收缩的百分数表达，反应特征表述为Eniax (最大收缩百分率)和PEC5tl (产生一半最大收缩时所需要受体激动剂浓度的负对数)。采用Arunlakshana和Schild(1959)描述的方法[6]计算措抗剂pAj；t。统计分析及作图使用Prism 5.0软件及spssl8.0。Students’ t检验用来比较两组间的数据，单因素双向方差分析(ANOVA)或双因素ANOVA和Dunnett’ s后检验(GraphPadPrism)用来比较两组以上的数据。统计分析及作图使用Prism 5.0软件。当P〈0.05被认为有统计学差异。
[0037]2 结果
[0038]2.1 mmT.PT,的制备
[0039]将LDL (0.2mg/ml)置于不含 EDTA，含 Iymo 1/L FeS04 憐酸盐缓冲液(phosphatebuffered saline，PBS)中，在4 °C透析96h，再用0.25mM EDTA终止氧化反应，生成mmLDL[7]o将mmLDL浓缩成lmg/mL。mmLDL的氧化程度采用硫代巴比妥酸反应物质法(th1barbituric acid-reactive substances，TBARS)进行检测，结果显不丙二酸样结构浓度为10.47±1.13 ymol/g LDL。同时0.8%琼脂糖胶电泳结果显示，mmLDL的电泳迀移率是LDL的1.69倍。制备好的mmLDL存放于4°C，避光，两周内用完。
[0040]2.2血管环对K+的收缩反应及去除动脉内皮
[0041]使用mmLDL尾静脉注射，血管环对63.5mM K+的收缩值在各组间的差异没有统计学意义(如: