NS 组 1.58±0.47mN，mmLDL 组 1.87±0.49mN，P>0.05)。用 20 μΜ 的 5-ΗΤ 预收缩血管环，再用1mM ACh舒张，舒张率低于预收缩值的5%，表明内皮去除完全。
[0042]2.3 mmLDL影响α受体介导收缩反应的时效和量效关系
[0043]考察mmLDL影响肠系膜动脉α受体介导收缩反应的时间-效应关系，实验组按lmg/kg的剂量尾静脉注射mmLDL。结果显示，与对照组相比，随着时间的延长mmLDL提高α受体介导收缩反应的作用逐渐增强，表明mmLDL提高血管α受体收缩反应的作用呈时间依赖性。在24h及48h，α受体介导收缩量效曲线变化不明显；72h时，α受体收缩效应出现上升，但差异性与NS组比无统计学意义；96h时，α受体介导的收缩曲线明显上升伴随明显左移；120h时，α受体收缩量效曲线与96h比较略有升高(图1A)。考察mmLDL (剂量分别为0.5、I及1.5mg/kg)96h后对肠系膜动脉α受体收缩量效曲线的剂量-效应关系，结果显示，实验组中尾静脉注射mmLDL对α受体收缩作用的影响随着剂量增大而加强，表明mmLDL对血管α受体收缩作用的影响呈剂量依赖性。与对照组相比，0.5mg/kg剂量组α受体介导的收缩量效曲线出现了升高(Ρ>0.05) ;lmg/kg剂量组出现显著性上升；1.5mg/kg剂量组较lmg/kg略有上升，差异无统计学意义(图1B)。故选择剂量为lmg/kg、时间点为96h来考察mmLDL对小鼠肠系膜动脉α受体收缩反应的影响，实验结果Emax值由NS组的(120.75±3.44) %上升为 mmLDL 组的(161.00±6.87) % (Ρ〈0.01)，pEC5。值由 NS 组的(5.65±0.05)上升为mmLDL组的(6.20±0.08) (P〈0.01)，表明量效曲线出现了显著增高伴明显左移。预实验结果还显示尾静脉注射lmg/kg LDL，96h时α受体介导的收缩量效曲线与NS组比基本上没有改变。
[0044]考察α受体亚型，使用选择性a i受体拮抗剂哌唑嗪(10 _n?10 _9M)使NA量效曲线平行右移，PA2值在mmLDL组(图2A)和NS组(图2B)分别为10.54 ± 0.77和9.85 ± 0.64。选择性α2受体拮抗剂育亨宾(10 _7?10_5Μ)使NA量效曲线平行右移，ρΑ2值在mmLDL组(图 3A)和 NS 组(图 3B)分别为 7.51 ±0.40 和 7.13±0.76。
[0045]2.4 mmLDL增加(^受体表达，不影响α 2受体表达
[0046]mmLDL引起α茂体表达增加。尾静脉注射mmLDL后，a i受体mRNA水平相对于NS组升高为(603±38) % (Ρ〈0.001)(图4Α) ; α丨受体蛋白水平由NS组的0.90±0.02升高为 1.31 ±0.03(Ρ〈0.01)(图 4Β)。
[0047]尾静脉注射mmLDL后，α 2受体表达几乎没有变化。α 2受体mRNA水平由NS组略降低为(89±3) % (Ρ>0.05)(图5A) ; α 2受体蛋白水平由NS组的0.76±0.04略升高为0.78±0.02 (Ρ>0.05)(图 5Β)。
[0048]结论:
[0049]mmLDL是心脑血管疾病的危险因子，心脑血管疾病的发生常常与血管的收缩、舒张功能失调有关。交感神经兴奋，末梢释放NA，NA激动血管平滑肌细胞膜上的ai受体，强烈收缩血管。血管平滑肌的收缩功能是影响血管阻力的重要因素，危险因子与机体相互作用，改变平滑肌的收缩功能，这种变化可能与疾病互为因果，成为疾病的基础。平滑肌的舒缩依赖平滑肌上的受体介导。受体蛋白因新陈代谢而动态变化，机体在生理、病理和药理因素影响下通过调节受体的数量、亲和力而影响效应。这种调节是机体维持内环境稳定的重要因素。但当量变引起质变时可能会诱发疾病。
[0050]我们在体外研宄中发现，mmLDL与大鼠冠状动脉共培养可以增加冠状动脉内皮素B (endothelin B receptor, ETb)受体、内皮素 A(endothelin A receptor, ETa)受体介导的收缩和内皮素受体mRNA水平、蛋白表达[8’9]，mmLDL与大鼠脑基底动脉培养，可以显著增加ETb受体介导的收缩反应，并上调ETb受体的mRNA水平和蛋白水平[1°]。我们在体研宄结果也显示，小鼠尾静脉注射mmLDL可以损伤肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能，并损伤内皮细胞的超微结构[2]。本实验结果发现小鼠尾静脉注射mmLDL可以增加肠系膜动脉主要由Q1受体介导的收缩功能，提尚α工受体mRNA水平及蛋白表达，对α 2受体表达基本没有影响。
[0051]试验中血管去除内皮可以排除血管内皮对实验结果的影响。使用β受体拮抗剂普萘洛尔孵育血管环，再浓度累加法加入NA，消除β受体对收缩曲线的干扰。在实验中发现尾静脉注射mmLDL可以时间依赖性和剂量依赖性的增加α受体收缩反应性。给予剂量为lmg/kg mmLDL，72h内α受体收缩反应性逐渐增强，但是与生理盐水组比没有显著性，96h后可以引起的NA收缩功能较生理盐水组明显增强，量效曲线明显左移，表明mmLDL增强NA引起血管的收缩功能。考察Ct1受体、α 2受体在NA引起收缩反应的作用时，分别在mmLDL组和生理盐水组加入a i受体拮抗剂哌唑嗪和α 2受体拮抗剂育亨宾。在mmLDL组和生理盐水组，α丨受体拮抗剂哌唑嗪的pA 2值分别为10.54±0.77和9.85±0.64，α 2受体拮抗剂育亨宾的口4值分别为7.51±0.40和7.13±0.76，与早期的文献报道一致[11]。mmLDL组我们观察到a i受体拮抗剂哌唑嗪在浓度为10 _nM时引起量效曲线的明显右移，而α 2受体拮抗剂育亨宾产生类似作用需要的浓度为10 _6Μ，表明mmLDL引起的NA收缩反应增强主要是由\受体介导，这与文献报道高血压患者与受体表达上调有关相一致[12]。在RT-PCR和Western-blot的实验结果中，我们发现mmLDL能显著增加的a i受体mRNA水平和蛋白表达，对α 2受体的蛋白表达没有明显影响，这与功能实验结果一致。mmLDL引起α 2受体mRNA水平略为降低，可能是由于mmLDL明显升高a i受体表达的一种反馈调节。结果显示mmLDL引起NA收缩量效曲线增强并伴随明显左移主要是由于增加了 a i受体在血管平滑肌的表达，增加了 \受体介导的收缩功能。
[0052]综上所述，尾静脉注射mmLDL增加肠系膜动脉a i受体的mRNA水平、蛋白表达，增加小鼠肠系膜动脉α受体的收缩反应主要由Ci1受体介导。mmLDL可以通过上调a i受体增加血管平滑肌的收缩功能。
[0053]参考文献
[0054][I]曹永孝，李洁，刘浩，等.高血压大鼠和高血压患者血管平滑肌α肾上腺素受体的反应性增强作用.药学学报，2006(10):ρ.973-977.
[0055][2]陈根，秦旭平，林杰，等.弱氧化低密度脂蛋白对小鼠肠系膜动脉内皮依赖性舒张功能的影响及机制.药学学报，2013(11):ρ.1657-1664.
[0056][3]Cao YX, He LC, Xu CB, et al.Enhanced transcript1n ofcontractile5-hydroxytryptamine 2Areceptors via extracellular signal-regulated kinasel/2after organ culture ofrat mesenteric artery[J].Basic&clinical pharmacology&toxicology.2005，96 (4): 282-8.
[0057][4]Cao L，Zhang Y，Cao YXj et al.Cigarette smoke upregulates rat coronaryartery endothelin receptors in vivo[J].PloS one.2012,7 (3):e33008.
[0058][5]Cao L，Cao YXj Xu CBj et al.Altered endothelin receptor express1n andaffinity in spontaneously hypertensive rat cerebral and coronary arteries [J].PloS one.2013，8(9): e73761.
[0059][6] Arunlakshanaj 0.and H.0.Schi Id, Some quantitative uses of drugantagonists.Br J Pharmacol Chemotherj 1959.14(I):p.48-58.
[0060][7]Itabej Hj et al.Minimally modifiedLDL is an oxidizedLDL enrichedwithoxidized phosphatidylcholines.J B1chemj2003.134(3):p.459-65.
[0061][8]Li J，Cao L，Xu CBj et al.Minimally modified LDL upregulates endothelintypeA receptors in rat coronary arterial smooth muscle cells[J].Mediators ofinflammat1n.2013，2013:656570.
[0062][9] Li J，Cao YX，Liu Y，et al.Minimal Iy modified LDL upregulatesendothelin type B receptors in rat basilar artery[J].Microvascularresearch.2012，83 (2): 178-84.
[0063][10]Jie Lj Yong-Xiao C，Zu-Yi Y，et al.Minimally modified LDL upregulatesendothelin type B receptors in rat coronary artery via ERK1/2MAPK and NF-kappaBpathways[J].B1chimica et b1physica acta.2012, 1821 (4):582-9.
[0064][ 11 ] Li J，Cao YXj Liu H，et al.Enhanced G-protein coup ledreceptors—mediated contract1n and reduced endothelium-dependent relaxat1n inhypertens1n[J].Eur J Pharmacol.2007，557(2-3):186-94
[0065][12]林杰，李洁，曹永孝，等.高血压机体外周动脉G-蛋白偶联受体对缩血管物质的反应.中华高血压杂志，2007(07):p.587-594。
【主权项】
1.尾静脉注射mmLDL上调小鼠肠系膜动脉ai受体。2.按照权利要求1所述尾静脉注射mmLDL上调小鼠肠系膜动脉ai受体，其特征在于:所述mmLDL的制备方法为将弱氧化低密度脂蛋白置于含I ymol/L FeS04磷酸盐缓冲液中，在4°C透析96h，再用0.25mM EDTA终止氧化反应，生成mmLDL。
【专利摘要】本发明公开了尾静脉注射mmLDL上调小鼠肠系膜动脉α1受体。小鼠尾静脉注射mmLDL，通过微血管肌张力描记仪观察NA引起的小鼠肠系膜动脉收缩量效曲线变化，检测α1受体及α2受体表达。结果显示mmLDL引起NA收缩量效曲线明显增强，表现为Emax值由生理盐水组的(120.75±3.44)％上升为(161.00±6.87)％(P<0.01)，pEC50值由NS组的(5.65±0.05)上升为(6.20±0.08)(P<0.01)。α1受体拮抗剂哌唑嗪引起量效曲线的明显右移，mmLDL引起α1受体mRNA水平、蛋白表达显著增加，对α2受体表达基本没有影响。
【IPC分类】A61K38/17, A61P9/12, A61P9/00
【公开号】CN104888190
【申请号】CN201510092459
【发明人】李洁, 林杰, 江高峰, 郭立军, 黄晓亮, 王俊杰, 徐世袭
【申请人】郴州市第一人民医院, 李洁
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年3月2日