海葵粗提物的制备方法及其抗肿癌应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及海洋产品深加工领域，特别涉及一种海葵粗提物的制备方法及其抗肿癌应用。
【背景技术】
[0002]海葵(Sea Anemone)又名海菊花，是一种海洋腔肠动物，属腔肠动物门(Coelenterata)、珊瑚虫纲(Anthozoa)、海葵目(actiniaria)动物，是海洋中较原始的动物。海葵有6科37种，广泛分布在热带和温热带海域，主要固着在海中岩石上或泥沙中。海葵具有滋阴壮阳、收敛止泻、燥湿杀虫等功效。对海葵化学成分的研究开始于20世纪70年代，海葵的触手和身体中含有众多的刺细胞，其中有储存着毒液的细胞器一刺丝囊，当海葵遇到物理或化学刺激时，刺丝会刺入猎物身体并释放毒液而麻痹猎物，用于捕抓猎物或抵御敌害。但由于其含有多种生物活性物质，近年来倍受学者们的关注，主要集中在海葵神经毒素、海葵溶细胞素及海葵离子通道抑制剂等方面的研究。也有学者发现了海葵中具有抗肿瘤的活性物质，如海葵毒素对神经胶质瘤U251细胞具有凋亡诱导作用，通过增加Fas表达而诱导凋亡。海葵粗提物通过线粒体途径激活Caspases和降低线粒体膜电位而诱导A549细胞凋亡，海葵溶细胞毒素Gigantoxin-4具有杀伤乳腺癌MCF-7细胞和胰腺癌SW1991细胞的作用，比如StI，EqtII等对不同的肿瘤细胞都具有较强的抑制作用，因其具有广泛的生物学活性，成为海洋天然产物的研究热点之一。舟山黄海葵(AnthopLeuraxanthograrnmica)属于海葵科，侧花海葵属，其体内富含多种毒素分子，已得到了一种兴奋性多肽毒素和多种具有强杀虫活性及低哺乳动物活性的杀虫肽，是进行海洋生物药物开发的理想对象，但有关舟山黄海葵抗肿瘤作用的研究尚未见报导。
[0003]肺癌是严重威胁人类健康的一类疾病，在我国也有非常高的发病率，而寻找有效的抗癌药物与方法，彻底攻克癌症，是世界医学界重要的研究课题。目前临床现有的抗肺癌在发挥抗癌作用的同时，多有较大的毒副作用，因此研究和开发活性高、疗效确切、毒副作用低的药物成为抗肺癌药物研究的关键问题。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种海葵粗提物的制备方法。
[0005]本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种上述海葵粗提物的抗肿癌应用。
[0006]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该海葵粗提物的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
[0007]I)将饲养后的活海葵于纯水中清洗，去除其表面杂质，将洗净后的海葵放置于烧杯中加入纯水，海葵与纯水的料液比为1: 1.5?1:2于_60°C下进行2?3次冻融；
[0008]2)将步骤I)中的海葵于20°C?28°C下适当解冻后进行粗过滤；
[0009]3)取步骤2)中的滤液，于4°C?6°C、12000?14000r/min条件下离心10?15min，收集上清液得到海葵粗毒液；
[0010]4)将步骤3)中的海葵粗毒液用30%、60%、90%的丙酮进行分级沉淀，并将每一步所得的沉淀物于4°C?6°C、12000?14000r/min条件下离心15min，将最终所得沉淀收集后冷冻干燥后，即得海葵粗毒，于_20°C保存备用。
[0011]进一步地，所述的步骤I)中海葵与纯水的料液比为1: 1.5。
[0012]进一步地，所述的步骤4)中将丙酮于_20°C下进行预冷。
[0013]虽然文献报道海葵溶细胞毒素具有杀伤乳腺癌MCF-7细胞和胰腺癌SW1991细胞的作用，如stl，EqtII等对不同的肿瘤细胞都具有较强的抑制作用，但由于肺癌与乳腺癌和胰腺癌为不同类型肿瘤，具有不同的适应症，因此，不能推之海葵粗毒也具有抑制肺癌的功效。
[0014]因此，本发明还提供一种利用海葵粗提物的制备方法制备的海葵粗毒在制备抗肺癌药物中的应用。
[0015]与现有技术相比，本发明具有如下优点:通过海葵进行反复冻融、丙酮分级沉淀的方法提取得到海葵毒素粗提物，同时采用冷冻干燥技术，能较好的保留海葵原有的生物活性，并经过MTT法检测显示，海葵毒素粗提物具有强烈的体外抗肿瘤活性，可用于制备治疗肿瘤药物。
【附图说明】
[0016]图1海葵粗毒的浓度对SPC-Al细胞抑制率的影响；
[0017]图2海葵粗毒的作用时间对细胞增殖的影响；
[0018]图3海葵粗毒抑制肺癌SPC-Al细胞生长的显微观察图，其中，A图为对照，B图中海葵毒素的浓度为0.625mg/mL, C图中海葵毒素的浓度为1.25mg/mL, D图中海葵毒素的浓度为 2.5mg/mL ；
[0019]图4海葵粗毒抑制肺癌SPC-Al细胞生长的HE染色图，其中，A图为对照，B图中海葵毒素的浓度为0.625mg/mL, C图中海葵毒素的浓度为1.25mg/mL, D图中海葵毒素的浓度为 2.5mg/mL ；
[0020]图5海葵粗毒抑制肺癌SPC-Al细胞生长的Α0/ΕΒ荧光染色图，其中，A图为对照，B图中海葵毒素的浓度为0.625mg/mL，C图中海葵毒素的浓度为1.25mg/mL，D图中海葵毒素的浓度为2.5mg/mL。
【具体实施方式】
[0021]以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0022]实施例1海葵粗提物的制备
[0023]I)将饲养后的活海葵于纯水中清洗，去除其表面杂质，将洗净后的海葵放置于烧杯，按物料比1: 1.5加入一定量的纯水，并置于_60°C超低温中冷冻过夜，次日取出20°C下自然解冻，待全部溶解后，再置于冰柜中冷冻，如此冻融步骤循环3次；
[0024]2)将步骤I)中纱布包裹全部融化的海葵于20°C下适当解冻后进行粗过滤，弃去海葵体中的杂质；
[0025]3)取其滤液，滤液在4°C、12000r/min条件下离心lOmin，收集上清液得到海葵粗毒液；
[0026]4)将步骤3)中的海葵粗毒液分别加入_20°C预冷过的30%、60%、90%的丙酮分级沉淀，迅速用玻璃棒搅拌使迅速沉积，每一步所得的沉淀物在4°C、12000r/min离心15min。将最终所得沉淀收集后冷冻干燥即是所得海葵粗毒，于_20°C保存备用。
[0027]实施例2海葵粗提物的制备
[0028]I)将饲养后的活海葵于纯水中清洗，去除其表面杂质，将洗净后的海葵放置于烧杯，按物料比1:2加入一定量的纯水，并置于_60°C超低温中冷冻过夜，次日取出22°C下自然解冻，待全部溶解后，再置于冰柜中冷冻，如此冻融步骤循环2次；
[0029]2)将步骤I)中纱布包裹全部融化的海葵于28°C下适当解冻后进行粗过滤，弃去海葵体中的杂质；
[0030]3)取其滤液，滤液在6°C、14000r/min条件下离心15min，收集上清液得到海葵粗毒液；
[0031]4)将步骤3)中的海葵粗毒液分别加入_20°C预冷过的30%、60%、90%的丙酮分级沉淀，迅速用玻璃棒搅拌使迅速沉积，每一步所得的沉淀物在6°C、14000r/min离心15min。将最终所得沉淀收集后冷冻干燥即是所得海葵粗毒，于_20°C保存备用。
[0032]实施例3海葵粗提物的制备
[0033]I)将饲养后的活海葵于纯水中清洗，去除其表面杂质，将洗净后的海葵放置于烧杯，按物料比1: 1.8加入一定量的纯水，并置于_60°C超低温中冷冻过夜，次日取出20°C下