自然解冻，待全部溶解后，再置于冰柜中冷冻，如此冻融步骤循环3次；
[0034]2)将步骤I)中纱布包裹全部融化的海葵于25°C下适当解冻后进行粗过滤，弃去海葵体中的杂质；
[0035]3)取其滤液，滤液在5°C、13000r/min条件下离心12min，收集上清液得到海葵粗毒液；
[0036]4)将步骤3)中的海葵粗毒液分别加入_20°C预冷过的30%、60%、90%的丙酮分级沉淀，迅速用玻璃棒搅拌使迅速沉积，每一步所得的沉淀物在5°C、13000r/min离心15min。将最终所得沉淀收集后冷冻干燥即是所得海葵粗毒，于_20°C保存备用。
[0037]实施例4细胞培养
[0038]人肺腺癌SPC-Al细胞培养于含链霉素、青霉素和10%胎牛血清的1640营养液中，在37°C、含5% 0)2的培养箱中培养，待长满80%以上时用含0.25%的胰蛋白酶进行消化传代，取处于对数生长期的细胞进行实验。
[0039]实施例5细胞增殖抑制实验(MTT法)
[0040]取SPC-Al细胞制成单细胞悬液，进行计数并稀释成I X 1VmL浓度接种至96孔板，每孔200 yL。常规条件下培养24h后弃去培养液，设置空白组、对照组及药物组。空白组不加细胞，只是1640营养液，对照组细胞中给予1640营养液，药物组在1640营养液中加入质量梯度为0.625、1.25、2.5mg/mL的海葵粗毒，每组设3个复孔，分别培养24h、48h、72h后，弃培养液。每孔加入含有10% MTT的200 μ L PBS缓冲液，继续培养4h。实验结束，弃液体，每孔加入150 μ L的DMS0，充分振荡lOmin。于酶标仪490nm处测其吸光度A值，计算细胞增殖抑制指数(IR)，以上实验重复3次。IR(%)=[(对照组A值-药物组A值)/(对照组A值-空白组A值)]X 100%。并计算IC5。时的药物浓度。从MTT实验结果如图1和图2所示，在一定的作用范围内，随着海葵粗提物浓度的增加和作用时间的延长，抑制率逐渐增高，具有明显的剂量和时间依赖性。当海葵粗提物浓度2.5mg/mL，作用时间为72h时，增殖抑制率为82.12%。作用24h、48h和72h的IC5。分别为2.52mg/mL、2.05mg/mL和
1.89mg/mL0
[0041]为了观察培养的活细胞，倒置显微镜下的观察结果见图3-A，对照组SPC-Al细胞生长良好，形态饱满，呈上皮样生长，边界清楚。如图3-B、3-C，用药后，细胞体积缩小，细胞收缩变圆，形态不规则，细胞贴壁能力下降，部分细胞漂浮于培养液中。如图3-D，当药物浓度为2.5mg/mL时，细胞失去了正常形态，部分细胞破裂，培养液中可见明显的细胞碎片及颗粒物，部分细胞坏死。
[0042]实施例6HE染色观察细胞形态
[0043]将处理过的盖玻片放入六孔板内，接种浓度为I X 1VmL的SPC-Al细胞悬液，培养24h后去培养液，设立对照组及药物组，海葵粗毒的质量浓度为0.625、1.25,2.5mg/mL，培养48h在倒置显微镜下观察形态并拍照。后去培养液，以PBS洗，95%乙醇固定20min，PBS洗，苏木素染色5min，自来水浸洗使细胞核蓝化，伊红复染0.5min，乙醇(50%、75%、95%,100%)梯度脱水，二甲苯透明2次，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。从HE染色结果如图4-A所示，对照组SPC-Al细胞大小均匀，核仁数目多。随着药物浓度的增大，细胞形态出现不规则。当药物浓度为0.625mg/mL时，胞质出现空泡，核仁数目减少，如图4-B所示；当药物浓度为1.25mg/mL时，细胞体积明显缩小，出现胞芽，核固缩，部分细胞核消失，如图4-C所示；当药物浓度为2.5mg/mL时，细胞形态各异，大部分细胞核溶解，消失，存在的细胞核也进一步固缩，出现凋亡的形态学变化，如图4-D所示。说明海葵粗毒能抑制SPC-Al细胞的生长，并诱导凋亡，而肺癌细胞的凋亡是抗癌肺癌药物的重要评价指标。
[0044]实施例7A0/EB荧光染色观察细胞形态
[0045]细胞接种与实验分组同实施例4。24h后，取出盖玻片，PBS洗2_3次，进行Α0/ΕΒ染色。Α0/ΕΒ的配制方法如下:取Α0、ΕΒ各lmg，分别溶解于1mL PH 7.2的PBS缓冲液中，混合摇匀，现配现用并避光。观察前于载玻片上滴加40 μ L PBS和1yL Α0/ΕΒ混合液，小心擦净盖玻片上残留的PBS，将有细胞的一面朝下，于荧光显微镜下观察并拍照。Α0/ΕΒ荧光染色结果如图5-Α所示，对照组细胞大小均匀，胞核呈现出均匀的绿色荧光。用药后细胞均不同程度出现形态变化。0.625mg/mL组呈现出黄绿色荧光，如图5-B所示。1.25mg/mL组异常细胞明显增多，核呈现较强的黄绿色荧光或黄色荧光，如图5-C所示；2.5mg/mL组细胞体积明显缩小，部分细胞核消失，部分细胞核偏向细胞一侧，核固缩呈“月芽”形，出现凋亡小体，核被染成桔红色荧光，如图5-D所示。同样地，经Α0/ΕΒ荧光染色观察加药后的细胞形态变化。加药后的SPC-Al细胞出现细胞体积缩小，细胞周围出现“胞芽”现象即凋亡小体，细胞质内出现空泡，核仁数目减少，细胞核固缩或细胞核溶解消失，这些形态学的变化，说明海葵粗毒能抑制SPC-Al细胞的生长。
【主权项】
1.一种海葵粗提物的制备方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将饲养后的活海葵于纯水中清洗，去除其表面杂质，将洗净后的海葵放置于烧杯中加入纯水，海葵与纯水的料液比为1: 1.5?1:2于-60°c下进行2?3次冻融； 2)将步骤I)中的海葵于20°C?28°C下适当解冻后进行粗过滤； 3)取步骤2)中的滤液，于4°C?6°C、12000?14000r/min条件下离心10?15min，收集上清液得到海葵粗毒液； 4)将步骤3)中的海葵粗毒液用30%、60%、90%的丙酮进行分级沉淀，并将每一步所得的沉淀物于4°C?6°C、12000?14000r/min条件下离心15min，将最终所得沉淀收集后冷冻干燥后，即得海葵粗毒，于_20°C保存备用。2.根据权利要求1所述的海葵粗提物的制备方法，其特征在于所述的步骤I)中海葵与纯水的料液比为1:1.5。3.根据权利要求1所述的海葵粗提物的制备方法，其特征在于所述的步骤4)中将丙酮于-20°C下进行预冷。4.根据权利要求1?3任意一项权利要求所述的海葵粗提物的制备方法制备的海葵粗毒在制备抗肺癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种海葵粗提物的制备方法，其包括以下步骤：1)将饲养后的活海葵于纯水中清洗，将洗净后的海葵放置于烧杯中加入纯水，海葵与纯水的料液比为1:1.5～1:2于-60℃下进行2～3次冻融；2)将步骤1)中的海葵于20℃～28℃下适当解冻后进行粗过滤；3)取步骤2)中的滤液，于4℃～6℃、12000～14000r/min条件下离心10～15min，收集上清液得到海葵粗毒液；4)将步骤3)中的海葵粗毒液用丙酮进行分级沉淀，并将每一步所得的沉淀物离心15min，将最终所得沉淀收集后冷冻干燥后，即得海葵粗毒；本发明还提供一种海葵粗毒在制备抗肺癌药物中的应用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K35/614
【公开号】CN105030838
【申请号】CN201510292554
【发明人】杨最素, 张亚茹, 丁国芳, 黄芳芳, 赵玉勤, 余方苗
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年5月31日