治疗肺病状的制作方法
【专利说明】治疗肺病状 夺叉引用
[0001] 本申请要求2013年1月15日提交的美国临时申请号61/752, 909的权益，该临时 申请为了所有目的通过引用以其整体并入本文。
【背景技术】
[0002] 肺疾病或病状涵盖一系列肺相关的疾病，包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD)， 其影响到全世界的数百万人。
[0003] 例如，全球有超过3亿人患有哮喘。据预测，在下一个十年，患病率将增加至约4 亿人。哮喘是一种根据复发性喘鸣和间歇性气流限制来确定的慢性气道病症。其特征在于 气道炎症、粘液分泌过多和气道高反应性（AHR)。研究表明，这些临床表现至少部分地是由 2型T辅助（Th2)细胞连同肥大细胞、B细胞和嗜酸性粒细胞以及许多炎性细胞因子和趋化 因子一起介导的炎症应答。
[0004] 目前，有三种抗炎剂用于控制哮喘，其包括吸入性类固醇、半胱氨酰-白三烯受体 拮抗剂和色甘酸。然而，半胱氨酰-白三烯受体拮抗剂和色甘酸的治疗效果是高度变化的， 并且可能仅限于患者的某些亚组。另外，5-10%的哮喘患者不能被目前的药物治疗很好地 控制，他们在加重期间需要口服类固醇。口服类固醇的使用通常与多种不良反应相关联，最 明显的是食欲增加、胃溃疡、睡眠困难（失眠）、情绪和行为改变、面部潮红（发红）以及由 水潴留增多引起的短期体重增加。如果长时间服用，类固醇的使用可导致青光眼、白内障、 高血压、心脏疾病、糖尿病、肥胖、胃酸反流/GERD、骨质疏松症、肌病、某些类型的感染的增 加和库欣综合征（cushing syndrome)。
[0005] coro是一种通常被认为包括慢性支气管炎和肺气肿之一种或两种的医学病状。慢 性支气管炎的特征在于并非由医学上定义的原因如微生物感染或癌引起的持久的（如一 年以上）排痰性咳嗽。肺气肿是位于终末细支气管远侧的气室的异常永久性非均匀扩大， 包括气室壁的破坏。COPD由有毒颗粒或气体（最常见地来自吸烟）引起，这触发肺中的异 常炎症应答。coro的自然进程的特征在于偶发的突然症状恶化，被称为急性加重，其中大多 数由感染或空气污染引起。
[0006] 目前对coro还没有治愈方法，已经证实能降低死亡率的仅有的措施是戒烟和补 氧。COPD用支气管扩张剂如(6-2激动剂和/或抗胆碱能药治疗。(6-2激动剂刺激P-2 受体，而抗胆碱能药阻断来自胆碱能神经的刺激，两者都是放松气道周围的平滑肌从而增 加气流的药物。虽然这些药剂可以在一定程度上改善某些症状，但是它们对于阻止coro的 进展无效。
[0007] 甲基黄嘌呤（黄嘌呤和生物碱的一类衍生物）已经常用作支气管扩张剂。甲基黄 嘌呤松弛平滑肌，刺激中枢神经系统，刺激心肌，并作用于肾脏以促进利尿。它们在促进支 气管平滑肌松弛中的效用对于哮喘的控制是有益的。
[0008] 甲基黄嘌呤茶碱是一种用于治疗呼吸道阻塞性疾病的已确定的药物。茶碱是几种 类型的磷酸二酯酶（降解CAMP的酶）的竞争性但非选择性抑制剂。浓度提高的cAMP可以 介导观察到的支气管扩张。所提出的茶碱的其他作用机制包括抑制细胞内钙的释放和支气 管收缩剂腺苷的竞争性拮抗作用。
[0009] 茶碱是一种相对低成本的治疗，并且可以在给予约12小时持续时间的持续释放 制剂中施用。然而，茶碱具有许多副作用。茶碱的胃肠不良反应包括恶心、呕吐、腹痛、绞痛 和腹泻。中枢神经系统不良反应包括失眠、头痛、头晕、紧张和癫痫发作，这些往往在儿童中 更严重。癫痫发作可能会作为茶碱毒性的初始体征而发生，而没有任何其他前述体征和症 状。已经报道了患者的优势手的震颤增加。心血管和肺的不良反应包括心动过速、心律不 齐和呼吸急促。由于这些毒性，茶碱通常用作二线或三线哮喘药物。
【发明内容】
[0010] 对于能够有效且安全地治疗肺病状的低成本疗法仍然存在相当大的需求。本发明 满足了这种需求，并且还提供了相关的优点。
[0011] 本申请提供了可用于治疗包括但不限于哮喘、慢性阻塞性肺疾病的肺病状的组合 物、方法和药剂盒。本发明组合物在降低炎症标志物的表达和/或分泌或者提高与在哮喘 或慢性阻塞性肺疾病的发作期间引发的炎症应答相关的抗炎症标志物的表达和/或分泌 方面特别有效。
[0012] 在本发明的一个方面，本发明组合物包含亮氨酸和/或选自酮-异己酸（KIC)、 a-羟基-异己酸和羟甲基丁酸盐（HMB)的一种或多种亮氨酸代谢物；和甲基黄嘌呤，其中 该组合物包含至少约250mg亮氨酸和/或至少约IOOmg所述一种或多种亮氨酸代谢物。在 本发明的一个方面，本发明组合物包含亮氨酸和/或选自酮-异己酸（KIC)、a-羟基-异 己酸和羟甲基丁酸盐（HMB)的一种或多种亮氨酸代谢物；和甲基黄嘌呤，其中该组合物包 含至少约250mg亮氨酸和/或至少约10或50mg所述一种或多种亮氨酸代谢物。该组合物 可以进一步包含白藜芦醇。
[0013] 在一些实施方案中，该组合物包含至少约500mg亮氨酸。该组合物可以包含约 250-1500mg亮氨酸。该组合物可以包含至少约200mg亮氨酸代谢物。该组合物可以包含约 100-750mg亮氨酸代谢物。该组合物可以包含约10-750或50-750mg亮氨酸代谢物。
[0014] 在另一实施方案中，所述甲基黄嘌呤选自茶碱和可可碱。该甲基黄嘌呤可以以亚 治疗量存在。该组合物可以包含至少约5mg茶碱。该组合物可以包含约1-100或5-50mg 茶碱。该组合物可以包含亚治疗量的茶碱。
[0015] 在一个实施方案中，该组合物包含至少约35mg白藜芦醇。该组合物可以包含约 5-500或30-250mg白藜芦醇。
[0016] 在又一实施方案中，该组合物基本上不含非支链氨基酸。该组合物中的氨基酸可 以基本上不含非支链氨基酸。该组合物中的非支链氨基酸相对于总氨基酸的百分比可以小 于约 0. 1%、1%或 10%。
[0017] 在一些实施方案中，该组合物是单位剂量。该组合物可以配制用于口服给药、吸入 或静脉内递送。该组合物可以配制用于在至少约1、4、6、12、24、36或48小时的一段时间内 持续释放。持续释放制剂可以在至少约1、4、6、12、24、36或48小时的一段时间内维持该组 合物的一种或多种组分的所需循环水平。持续释放制剂可以经至少约4、6、12、24、36或48 小时的一段时间达到高于所需循环水平的循环水平。所需循环水平可以针对于该组合物的 任何组分。该组分可以是甲基黄嘌呤，如茶碱。在一些实施方案中，持续释放组合物使甲基 黄嘌呤的水平维持在大于约I y M持续指定的时间段。持续释放制剂可以在受试者中达到 大于约IyM的甲基黄嘌呤循环水平持续该时间段。持续释放制剂可以在受试者中达到约 1-10、1-20、1-30或1-40 y M的甲基黄嘌呤循环水平持续该时间段。
[0018] 在本发明的另一方面，本发明组合物包含（a)亮氨酸和/或选自酮-异己酸 (KIC)、a-羟基-异己酸和羟甲基丁酸盐（HMB)的一种或多种亮氨酸代谢物；和（b)甲基 黄嘌呤，其中（a)与（b)的质量比为至少约15、25、50、75或100,且其中该组合物包含至少 约5mg该甲基黄噪呤。该组合物可以进一步包含至少约IOmg白藜芦醇。在一些实施方案 中，该甲基黄嘌呤是茶碱或可可碱。该组合物可以配制为单位剂量。
[0019] 在本发明的一个方面，本发明组合物包含（a)亮氨酸和/或选自酮-异己酸 (KIC)、a-羟基-异己酸和羟甲基丁酸盐（HMB)的一种或多种亮氨酸代谢物；和（b)甲基 黄嘌呤，其中（a)与（b)的摩尔比为至少约400、500、750或1000,且其中该组合物包含至少 约0. 05、0. 1、0. 5、1或2y g该甲基黄嘌呤。该组合物可以包含至少约0. 05、0. 1、0. 5、1或 2mg该甲基黄嘌呤。该组合物可以进一步包含至少约15、30、50、100或500 1^亮氨酸。该 组合物可以进一步包含至少约5、10、15、30、50、100或500mg亮氨酸。该组合物可以进一步 包含至少约0. 01、0. 05、0. 1、0. 5或I y g白藜芦醇。该组合物可以进一步包含至少约0. 01、 0. 05、0. 1、0. 5或Img白藜芦醇。在一些实施方案中，该甲基黄嘌呤是茶碱或可可碱。该组 合物可以配制为用于吸入的单位剂量。该组合物可以包装在吸入器中。该吸入器可以包含 至少约20、50、200或1000单位剂量的该组合物。
[0020] 在本发明的又一方面，本发明组合物包含（a)亮氨酸；和（b)甲基黄嘌呤，其中 组分（a)和（b)以在受试者中有效达到约0. 3-2mM亮氨酸和约0. 5-10 y M甲基黄嘌呤的 循环水平的量存在。可以选择（a)和（b)的量以在受试者中诱导约0.7-2mM亮氨酸和约 0. 7-3 yM甲基黄嘌呤的循环水平。该受试者可以是人、驯养动物或家畜。
[0021] 在另一方面，本发明组合物包含（a)亮氨酸；和（b)甲基黄嘌呤，其中组分（a)和 (b)以通过降低肺内皮细胞中选自NFkB、嗜酸细胞活化趋化因子（eotaxin)、ILl-P和 IL6的一种或多种炎症标志物的表达水平或分泌或者提高肺内皮细胞中选自脂连蛋白受体 1和脂连蛋白受体2的一种或多种抗炎症标志物的表达水平或分泌而有效改善肺病状的量 存在。
[0022] 在又一方面，本发明组合物包含（a)亮氨酸；和（b)甲基黄嘌呤，其中组分（a)和 (b)以有效降低肺内皮细胞中选自NFkB、嗜酸细胞活化趋化因子、ILl-P和几6的一种或 多种炎症标志物的表达水平或分泌或者提高肺内皮细胞中选自脂连蛋白受体1和脂连蛋 白受体2的一种或多种抗炎症标志物的表达水平或分泌的量存在。（b)的量可以是亚治疗 量。或者，（b)的量可以低于达到约40 yM的循环水平所需的量。
[0023] 本发明还提供一种治疗需要治疗的受试者中的肺病状的方法，其包括向受试者施 用本发明组合物中的任一种的组合物。
[0024] 在另一方面，本发明提供一种降低选自NF K B、嗜酸细胞活化趋化因子、ILl-P和 IL6的炎症标志物的表达水平或分泌或者提高选自脂连蛋白受体1和脂连蛋白受体2的抗 炎症标志物的表达水平或分泌的方法，其包括使肺内皮细胞与本文所述的本发明组合物中 任一种的组合物接触，以实现所述炎症标志物或所述抗炎症标志物的表达水平或分泌的所 述降低或提高。该受试者可以是人、驯养动物或家畜。
[0025] 在又一方面，本发明提供了一种药剂盒，其包含本文所述的本发明组合物的单位 剂量的多日供应，以及指导经多日的时间段施用所述多日供应的说明书。 援引并入
[0026] 本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均在此通过引用并入本文，其程 度如同特别地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用而并入。
【附图说明】
[0027] 本发明的新特征在随附的权利要求中具体阐述。通过参考以下对在其中利用到本 发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图，将会获得对本发明的特征和优点 的更好的理解，在附图中：
[0028] 图1显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇对小鼠肺内皮细胞中的NF K B蛋白质表达的交 互影响。*P〈〇. 02相对于对照。
[0029] 图2显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇（200nM)条件化脂肪细胞培养基对小鼠肺内皮 细胞中的NF K B蛋白质表达的交互影响。
[0030] 图3显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇条件化脂肪细胞培养基对小鼠肺内皮细胞中 的磷酸-NF K B蛋白质表达的交互影响。
[0031] 图4显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇对来自小鼠肺内皮细胞的ILl-P的交互影响。 *p〈0. 001，相对于所有其他处理。使用TNFa作为阳性对照来刺激细胞因子的分泌；**表 示相对于所有其他处理显著增加（P〈〇. 01)。
[0032] 图5显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇对小鼠肺内皮细胞的嗜酸细胞活化趋化因子 分泌的交互影响。*P〈〇. 05,相对于所有其他处理。使用TNFa作为阳性对照来刺激细胞因 子的分泌。
[0033] 图6显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇条件化脂肪细胞培养基对小鼠肺内皮细胞的 嗜酸细胞活化趋化因子分泌的交互影响。
[0034] 图7显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇对小鼠肺内皮细胞中的细胞IL6含量的交互影 响。*p〈0. 02,相对于对照。
[0035] 图8显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇对小鼠肺内皮细胞的IL 6分泌的交互影响。 *p〈0.0001，相对于所有其他处理。使用TNF a作为阳性对照来刺激细胞因子的分泌；**表 示相对于所有其他处理显著增加。
[0036] 图9显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇条件化脂肪细胞培养基对小鼠肺内皮细胞的 IL 6分泌的交互影响。
[0037] 图10显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇对小鼠肺内皮细胞中的脂连蛋白受体1蛋白 质表达的交互影响。
[0038] 图11显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇对小鼠肺内皮细胞中的脂连蛋白受体2蛋白 质表达的交互影响。
[0039] 图12显示茶碱与亮氨酸和白藜芦醇条件化脂肪细胞培养基对小鼠肺内皮细胞中 的脂连蛋白受体2蛋白质表达的交互影响。*p = 0. 018,相对于所有其他处理。
[0040] 图13显示可可碱与亮氨酸和白藜芦醇条件化脂肪细胞培养基对小鼠肺内皮细 胞中的脂连蛋白受体1蛋白质表达的交互影响。*P= 0. 03,相对于所有其他处理；= 0. 0005,相对于所有其他处理。
[0041] 图14显示可可碱与亮氨酸和白藜芦醇条件化脂肪细胞培养基对小鼠肺内皮细胞 中的脂连蛋白受体蛋白质表达的交互影响。*P = 0.0001，相对于所有其他处理。
【具体实施方式】
[0042] 本发明的几个方面参考用于说明的应用示例描述如下。应当理解，为了提供对本 发明的完整理解，阐述了很多具体的细节、关系和方法。然而，相关领域普通技术人员将会 容易认识到，可以不使用一种或多种所述具体细节或者可以用其他方法来实施本发明。除 非另有说明，否则本发明不限于所述的行为或事件的顺序，因为一些行为可能以不同的顺 序发生和/或与其他行为或事件同时发生。此外，并非需要所有描述的行为或事件来实施 根据本发明的方法。所公开的组合物中多种组分的浓度是示例性的，并不意味着被限制于 所提及的浓度本身。
[0043] 如本文使用的，术语"受试者"或"个体"包括哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例 包括人和小鼠，包括转基因和非转基因小鼠。本文描述的方法可用于人类治疗、临床前和兽 医应用。在一些实施方案中，受试者为哺乳动物，在一些实施方案中，受试者为人。其他哺乳 动物包括但不限于，猿、黑猩猩、猩猩、猴子；驯养动物（宠物），如狗、猫、豚鼠、仓鼠、小鼠、 大鼠、兔和雪貂；驯养家畜，如牛、水牛、野牛、马、驴、猪、绵羊和山羊；或通常在动物园中见 至I撤野生动物，例如熊、狮、虎、豹、象、河马、犀牛、长颈鹿、玲羊、树懒、瞪玲、斑马、角马、草 原犬鼠、无尾熊、袋鼠、熊猫、大熊猫、鬣狗、海豹、海狮和海象。
[0044] 术语"施用"和"给药"被定义为通过本领域已知的途径向受试者提供组合物，该途 径包括但不限于静脉内、动脉内、□服、经鼻、吸入、肠胃外、颊部、局部、经皮、直肠、肌肉内、 皮下、骨内、经粘膜或腹膜内给药途径。在本申请的某些实施方案中，施用组合物的口服途 径可能是优选的。
[0045] 如本文使用的，"药剂"或"生物活性剂"是指生物学、药学或化学化合物或其他部 分。非限制性的实例包括简单或复杂的有机或无机分子、肽、蛋白质、肽核酸（PNA)、寡核苷 酸（包括，例如，适体和多核苷酸）、抗体、抗体衍生物、抗体片段、维生素衍生物、碳水化合 物、毒素或化疗化合物。可以合成各种化合物，例如，小分子和低聚物（例如，寡肽和寡核苷 酸），以及基于多种核心结构的合成有机化合物。另外，多种天然来源也可以提