长链非编码rna在发育性髋关节发育不良疾病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是长链非编码RNA H19 (LncRNA H19)在发育性髋关节发育不良(DDH)疾病中的应用。
【背景技术】
[0002]长链非编码RNA(long non-coding RNA，IncRNA)定义为一类长度大于200nt，不编码蛋白质的RNA转录产物，起初被认为是基因组转录的“噪音”，仅仅是RNA聚合酶II转录副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，IncRNA参与了 X染色体沉默，基因组印记以及染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输，蛋白质翻译后的修饰以及遗传学的表观调控等多种重要的调控过程。这些作用表明其与疾病的病理生理改变有着紧密联系，尤其是肿瘤。在哺乳动物基因组序列中4% -9%的序列产生的转录本是IncRNA(相应的蛋白编码RNA的比例是1% )。人IncRNA H19位于人染色体11ρ15.5，全长2.3kb，是最先被报道的IncRNA基因之一。同时该基因是最早发现的印记基因之一，系父系基因印记，母系基因表达。因进化上高度保守，胚胎发育期高表达，婴儿出生后在大多数组织表达下调，仅在骨骼肌和心肌中有少量表达。近来研究表明H19与肿瘤具有密切关联，并且在不同的肿瘤中作用不一致，有的表现为促进肿瘤发展，有的则表现为抑癌基因功能。有关IncRNA与肿瘤发生的研究报道逐年增多，但尚没有针对IncRNA在发育性髋关节发育不良(DDH)疾病中调控机制的研究。
[0003]发育性髋关节发育不良是指在生长发育过程中股骨头、髋白在大小、形状、方向及组织学上的异常，或两者皆而有之。髋白发育不良是以发育不成熟、变浅的髋白为特征，它可以导致股骨头半脱位或完全脱位。从畸形学观点出发，髋关节发育不良指的是更严重的、固定的脱位，即发生于出生前，通常是在那些有遗传或神经肌肉疾病的患儿。其发生率的可变性是取决于许多因素。数据表明大约出生后儿童1/1000存在髋关节脱位，10/1000可能为髋关节半脱位。影响因素包括臀先露、女性、阳性家族史、第一胎和妊娠合并羊水过少。而宫内胎位、性别、种族和阳性家族史是最为重要的风险因素。阳性家族史在DDH患儿中的比例为12% -33%。DDH风险对于一个儿童而言，当存在一个受影响的兄弟姊妹时占6% ;当存在一方父母患病时占12% ;如果同时具有上述两种因素时则占到36%。治疗上，如果DDH不及时进行保守治疗或手术干预，可能会引起残留畸形、早期关节退变、痛性关节炎的发生，从而对生长发育过程中的儿童造成生理和心理上的不良影响。然而目前仍未能对其整个发病过程做全面的阐述。在这种背景下，加之DDH患儿有80%是女性，这与IncRNA H19基因特性一一父系基因印记，母系基因表达相一致。因此，我们选择IncRNA H19作为靶基因，并且对其在DDH中的作用机制进行研究，希望通过该研究发现它们之间的相关性，并为DDH的诊断、治疗提供新思路。
[0004]中国专利文献CN103623429A公开了 LncRNA H19在制备调控甲氨蝶呤肿瘤治疗耐药性的药物中的应用。中国专利文献CN101273130公开了包含能够联合其他抗癌疗法下调HlQmRNA的物质的制品以及通过进行所述制品的给药而治疗癌症的方法。但是关于长链非编码RNA H19 (LncRNA H19)在发育性髋关节发育不良(DDH)疾病中的应用目前还未见报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供长链非编码RNA H19 (LncRNA H19)的一种新用途。
[0006]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:长链非编码RNA H19在制备治疗发育性髋关节发育不良的药物中的应用。
[0007]—种延缓发育性髋关节发育不良进展为骨性关节炎的药物，所述的药物能够过表达长链非编码RNA H19。
[0008]过表达长链非编码RNA H19的质粒作为延缓发育性髋关节发育不良进展为骨性关节炎的药物的应用。
[0009]所述的过表达长链非编码RNA H19的质粒通过慢病毒介导的方法转染质粒制得。
[0010]长链非编码RNA H19作为诊断发育性髋关节发育不良的标记物的应用。
[0011]长链非编码RNA H19作为区分发育性髋关节发育不良患者软骨组织和股骨颈骨折患者软骨组织的标记物的应用。
[0012]一种区分发育性髋关节发育不良患者软骨组织和股骨颈骨折患者软骨组织的方法，所述的方法为:通过逆转录试剂盒逆转录为cDNA，进行real time PCR扩增，分析长链非编码RNA H19的表达。
[0013]本发明优点在于:
[0014]1、本发明对7例DDH软骨组织和6例股骨颈骨折软骨组织研究发现，长链非编码RNAH19在DDH中表达较股骨颈骨折中明显降低，H19可能与DDH的发生发展有关系。
[0015]2、本发明研究发现敲减H19会加速DDH进展为骨性关节炎。
[0016]3、本发明研究发现转染慢病毒LV-H19可促进H19的表达，过表达H19能延缓DDH进展为骨性关节炎。
【附图说明】
[0017]附图1是LncRNA H19在DDH软骨组织中的表达差异，其中，con是股骨颈骨折患者。
[0018]附图2是FISH检测LncRNA H19分布情况。
[0019]附图3 是 siRNA 敲减 H19。
[0020]附图4是转染慢病毒LV-H19，其中pUbi是慢病毒的作用元件。
[0021]附图5是敲减H19的促炎作用。
[0022]附图6是过表达H19的抑制炎症作用。
[0023]注:图中*ρ〈0.05，**ρ〈0.0I，_ρ〈0.001。
【具体实施方式】
[0024]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0025]实施例1
[0026]一:材料、方法:
[0027]1.1 材料
[0028]1.1.1收集2015年4月至2015年8月在上海交通大学附属新华医院就诊的DDH患者的髋关节软骨组织标本7例，股骨颈骨折患者6例，其中男8例，女5例，年龄31-76岁，平均51.1±14.4岁。本研究经医院医学伦理学委员会批准且患者知情同意。
[0029]1.1.2SD大鼠由上海斯莱克实验动物有限公司提供，雌雄不限，体重在200g± 15g0
[0030]1.1.3主要材料与试剂DMEM/F12培养基、胎牛血清FBS和青霉素链霉素双抗溶液(hy Clone,美国)；EDTA-胰蛋白酶(Gibco,美国)；DMSO (Sigma,美国)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce，美国)；NF_ κ B抗体试剂盒和MAPK抗体试剂盒(Cell SignalingTechnology,美国)。
[0031]1.1.4大鼠原代软骨细胞:取5只SD大鼠用断颈法处死，将大鼠浸入75%乙醇消毒约lOmin，无菌条件下用灭菌的手术刀片取膝关节胫骨平台和髋关节软骨，放在盛有PBS缓冲液的培养皿中洗2?3次。用刀片尽量将软骨切成ImmX ImmX Imm的小块，切碎后将小软骨快收集到50ml离心管中，加入5ml 0.25%的胰酶，在37°C条件下消化30min，5ml PBS缓冲液洗2次。加1ml 0.2%的II型胶原酶，在37°C条件下消化4_5h，悬浊液用70 μ m孔径滤筛网过滤去除软骨组织，过滤后的液体2000rpm离心lOmin，去除消化液后用PBS缓冲液漂洗，加8ml含10%胎牛血清，I %双抗的DMEM/F12培养基，混匀成细胞悬液后均匀地接种于30_培养皿。
[0032]1.2细胞实验
[0033]1.2.1细胞培养DDH患者髋关节、大鼠原代软骨细胞，均用含10%胎牛血清、I %双抗的DMEM/F12培养基进行培养。3-4d细胞长到90%左右融合时PBS缓冲液清洗，用胰酶消化，离心收集细胞，细胞计数仪计数后细胞按I X 16/孔接种于6孔板。
[0034]1.2.2L-1 β和TNF- α刺激软骨细胞接种于6孔板的软骨细胞，用含I %双抗、含血清的DMEM/F12培养基培养ld，大致长到100%融合，IL-1 β和TNF-α联合刺激(1ng/mL IL-1 β和50ng/mL TNF-α )，在相应时间点收集各组细胞并提取RNA。
[0035]1.2.3Real-Time PCR吸取去除6孔培养板中的培养基，每孔加Iml Trizol，按照Invitrogen公司Trizol产品说明书提取总RNA。NanoDrop 2000测定RNA纯度和浓度，取lug RNA，加DEPC水至总体积12.5uL，充分混匀之后，加Iul oligo-d T(100ymol/L)，5X反转录缓冲液4uL，d NTP(10mmol/L) 2uL,200U反转录酶0.5uL，总体积20uL，置于PCR仪运行42°C Ih, 70°C 10min，4°C保存。反转录cDNA用灭菌超纯水稀释10倍，进行Real