S产生的硫化氢化合物的制作方法
【专利说明】能够刺激怀孕个体中H2s产生的硫化氢化合物
[0001] 本发明涉及治疗先兆子痫或胎儿生长受损的方法和监测这种治疗的方法，其中产 生或刺激硫化氢（H2S)，或提供硫化氢（H2S)。
[0002] 气体信号分子硫化氢（H2S)促进血管舒张1和刺激脉管系统中血管生成 2。H2S具 有抗炎特性3,并且对于致死性缺氧或再灌注损伤引起的细胞损伤具有细胞保护作用。4'5胱 硫醚γ-裂解酶（CSE)是负责H2S的内源性生成的主要酶。6长期给药CSE抑制剂DL-炔丙 基甘氨酸（PAG)导致大鼠血压升高和血管重塑7,并且降低了肺动脉高压大鼠的CSE和H2S 水平。sCSE基因缺陷小鼠会形成年龄依赖性高血压、严重的高同型半胱氨酸血症和内皮功 能障碍。9显然，H2S在健康和疾病中具有多重作用，1(]'n但其在妊娠高血压中的作用未明确。
[0003] 先兆子痫是一种高血压综合症，影响所有怀孕者的4-7%，并且是全世界母亲及胎 儿发病和死亡的主要因素。12它被分类为蛋白尿和非蛋白尿先兆子痫。13而患有蛋白尿先 兆子瘤的妇女表现出典型的症状如在怀孕20周后尚血压和蛋白尿，患有非蛋白尿先兆子 痫的妇女更可能患有高血压和肝病。相比于妊娠期高血压，这类女性更可能患有宫内发育 迟缓（IUGR)13。先兆子痫的确切病因不详，但与异常的胎盘形成14'15和血管生成因子失衡16'17关系密切。重要的是，可溶性Flt-l(sFlt-l)(血管内皮生长因子（VEGF)和胎盘生长因 子（P1GF)的内源抑制剂）以及可溶内皮糖蛋白（sEng)(转化生长因子β UTGF-β 1)共受 体内皮糖蛋白的裂解产物）的循环水平在先兆子痫的临床表现发作之前几周升高，18'19而 P1GF在随后产生症状的怀孕妇女的前三个月中减小。2°26与内皮功能障碍一起，这些已经 成为了严重先兆子痫的生物化学特征。少数研究已经调查了 CSE/H2S在怀孕中的作用。最 近，Patel等人证实胱硫醚β-合成酶和CSE存在于人类子宫内组织和胎盘内。27'28考虑到 胎盘是一种高血管活性器官，发明人认为CSE/H2S途径的失调可能会导致胎盘异常和先兆 子痫样状态。
[0004] 本发明人现已证实，与相同孕龄的对照组相比，伴有先兆子痫的怀孕者的母体血 浆H2S水平和胎盘中CSE表达减小。提供了先兆子痫中H2S循环减少的证据，其中伴随着负 责产生内源性H2S的关键酶胎盘CSE的下调。抑制来自妊娠期前三个月（8-12周）的体外 胎盘外植体CSE活性会导致胎盘生长因子（P1GF)产生的显著减少，并且体外滋养层浸润被 抑制。抑制怀孕小鼠的CSE会引起高血压，sFlt-Ι和sEng水平升高，并且由于抑制H2S产 生引起胎盘异常，而缓释的H2S生成化合物GYY4137恢复了受CSE抑制损害的胎儿生长并 且抑制循环sFlt-Ι和sEng水平的增加。这些发现表明CSE/H2S途径的功能障碍促成先兆 子痫的发病。
[0005] 本发明提供硫化氢（H2S)、H2S生成化合物或能够促进怀孕个体中H 2S产生的化合 物，其用于治疗先兆子痫（PE)或胎儿生长受限（FGR或子宫内胎儿生长受限）。
[0006] 本发明还提供了治疗先兆子痫（PE)或FGR的方法，其包括向怀孕个体给药药学有 效量的H2S、H2S生成化合物或能够诱导所述个体中H2S产生的化合物。
[0007] 已表明添加 H2S促进例如血管生成，从而导致恢复给胎儿供血。
[0008] 这还意味着，例如，也可以治疗早产。
[0009] 如上所述，先兆子痫是一种高血压综合症并且是胎儿发病的主要原因。此外，胎儿 可能会有由妊娠高血压引起的胎儿生长受损。这种"胎儿生长受损"会产生较低出生体重 的婴儿并且后期婴儿出现并发症的风险增加。
[0010] 所述个体通常是哺乳动物，尤其是人类。
[0011] 可以例如以气体或例如在载体溶剂中的溶液的形式给药H2s。
[0012] 天然存在的提供H2S的化合物是已知的。这些包括来自于大蒜的大蒜素，其分解 为二稀丙基二硫醚和二稀丙基三硫醚。莱菔硫烧（sulforaphane)由西兰花产生，芥酸精见 于芝麻菜（Eruca Sativa)中。这些可以口服提供，例如以片剂或胶囊的形式。
[0013] 许多合成的H2S化合物是已知的。这些包括来自Cayman Chemical的GYY4137 (吗 啉-4-鑰4-甲氧基苯基（吗啉代）二硫代磷酸酯）。其先前已经用于大鼠研究中，通过腹 膜内注射（ip)或静脉注射（iv)研究H2S的活性。Lawesson试剂是另一种H2S供体。
[0014] SG1002(Sulfa GENIX Inc)也是一种H2S生成化合物并且可以被使用。还可参见 US 8361514B。
[0015] 茴三硫也是一种常用的H2S供体。缓冲液中的硫化钠（作为IK-1001由Ikaria 生产）已被用于再灌注/损伤临床试验。其它H2S生成化合物公开于Bannenberg G. L.和 Viera HLA(Expert Opin. Ther. Patents(2009) 19(5)663-682)。
[0016] 其它的化合物公开于Predmore B. L.等人的文章 （Antioxidants and Redox Signal ling (2012) 17 (1) 119-140)，包括化合物ADT-OH、TBZ和4-羟基苯基异硫氰酸酯。
[0017] 所述化合物可以是 ACS-14、AC583、ACS 84、ACS 85、ACS 86(Lee M，J. Biol Chem(2010) 285,17318-17328)、DATS (二烯丙基三硫醚）、S-双氯芬酸、硫烷硫（sulfane sulphur)、硫代半胱氨酸、GSH 氢过硫化物（GSH hydropersulphide)、GYY4137、SG1002、提 供 H2S 的西地那非衍生物（ACS6_Sparatore A 等人，Expert Rev，Clin. Pharmacol (2011)4， 109-121)、ADT-OH、TBZ和4-羟基苯基异硫氰酸酯、硫代甘氨酸、1-硫代赖氨酸、1-硫代缬 氨酸（Ι-thiovaline)或它们的盐。
[0018] 有关的其他化合物包括H2S-拉坦前列素、H2S-西地那非、H2S-沙坦类 (H2S-Sartans)、或H2S-L-多巴和它们中任何一个的衍生物
[0019] 或者，可以例如通过诱导CSE产生或诱导在体内产生H2S的其它酶，在体内诱导H 2S 的产生。例如，已经发现诸如辛伐他汀或普伐他汀的他汀类可以上调CSE的产生。
[0020] 所述化合物可以通过包括ip、iv、口服、子宫内（例如阴道栓剂）或肌内在内的任 何合适的方式引入。它们可以与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起给药。典型 的剂量可以是 10mm〇l/kg 至 0. 01mol/kg，通常是 10mmol/kg 至 0. lmmol/kg。
[0021] 监测先兆子痫或胎儿生长受损的治疗的方法，所述方法包括在用H2S或上述化合 物治疗之前测定个体血液、血清或血浆样本中的H2S量，以及将其与治疗后所取样品中的量 比较。早产的治疗可以类似地监测。
[0022] 这就允许体内的H2S量是可支配的，以确保可以提供最佳的H2S水平。检测的H 2S 量可以通过本领域公知的技术检测，例如下面描述的测定方法。
[0023] 所述个体可以已用上述的化合物或者其他不相关的抗先兆子痫或抗胎儿生长受 损的化合物治疗。
[0024] 现在将参考下面的附图仅以举例的方式来描述本发明：
[0025] 图1.先兆子痫中CSE表达和H2S水平。
[0026] 图2. CSE抑制对血管生成因子从人头三个月的胎盘中释放的影响。
[0027] 图3. CSE调节内皮细胞中sFlt-Ι和sEng的释放。
[0028] 图4. H2S修复先兆子痫血清诱导的体外血管形成抑制。
[0029] 图5.在怀孕小鼠中，抑制CSE减少内源性循环H2S，促进高血压和异常的胎盘血管 生成。
[0030] 图6.在怀孕小鼠中，H2S生成化合物GYY4137恢复胎儿生长，抑制由CSE抑制诱导 的 sFlt-1 和 sEng。
[0031 ] 图7. CSE抑制对滋养层细胞浸润的影响。
[0032] 图8. H2S供体恢复怀孕小鼠胎盘血管生成。
[0033] 材料和方法
[0034] 胎盘组织采集和制备
[0035] 机构伦理委员会批准血液和组织采集并且获得了书面知情同意。我们分析了从低 风险和高风险的门诊以及临产和分娩部门征集的单胎妊娠妇女的血样。所有妇女从登记直 到分娩都按照预期进行跟踪。人胎盘组织采集自择期剖腹产的合并先兆子痫的怀孕者和无 合并症的怀孕者。处理胎盘组织样品以提取RNA，并采集同一患者的母体血浆用于分析（η =14ΡΕ和η = 14对照）。从另一组患者采集胎盘以供免疫组织化学研究（η = 5ΡΕ和η =5对照）。先兆子痫定义为至少2次连续测量血压大于140/90mmHg并且母体蛋白尿至 少300mg/24小时。头三个月的胎盘组织（6-9周胎龄）取自经过选择终止妊娠的正常怀孕 者。绒毛外植体按照先前描述制备。29简单地说，在有或无 PAG的情况下培养人胎盘绒毛 外植体24小时，采集条件培养基并分析sFlt-Ι或sEng和P1GF。
[0036] 动物实验方案
[0037] 8-10周龄的C57/black6小鼠进行交配。妊娠第一天（E0. 5)由第二天早晨阴道栓 的存在确定。怀孕小鼠被随机分成四个组：（i)盐水（溶剂对照），（ii)25mg/kg DL-炔丙 基甘氨酸（PAG ;Sigma，Poole，UK)，（iii) 50mg/kg 组 PAG 和（iv)伴有 0· 25mg/kg 缓释 H2S 供体GYY4137 (Sigma)的50mg/kg PAG。小鼠从Ε8· 5开始腹腔内注射（i. p.)盐水或PAG。 血压通过尾部袖带容积描记法测定。训练小鼠从E4. 5开始隔天测量。或者，小鼠经过氯胺 酮/赛拉嗪混合剂麻醉。分离颈动脉并插入与压力传感器（Millar Instruments，Houston， Texas，USA)相连的3-Fr高置信度微尖导管。记录血压并且以10分钟周期取平均值。在 E17. 5,测量血压和采集血样后将这些动物处死并采集肾、肝和胎盘。计数和称重未被吸收 的胎儿和胎盘。
[0038] 所有实验依照 United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act，I986,使 用爱丁堡大学伦理检查委员会批准的程序进行。
[0039] 组织病理学
[0040] 将肾、肝和胎盘浸泡固定在4%多聚甲醛中24小时并用石蜡处理。切成一系列 5- μ m的切片并用苏木精&曙红（H&E)染色处理。
[0041] 细胞培养
[0042] 按照先前描述的，分离和培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC)。3°用第三或第四代 HUVEC进行试验。
[0043] RNA 干扰
[0044] 为了沉默人CSE的表达，我们使用电穿孔（Nucleofector，Amaxa)对小干扰 RNA(siRNA)双链执行转染。对照组和 CSE siRNAs 由 Eurogentec (Cologne，Germany)合成。 HUVEC中CSE的击倒（knockdown)用蛋白质印迹法证实。
[0045] 腺病毒基因转移
[0046] 按照先前描述，将编码人CSE的重组复制缺陷型腺病毒（AdCSE)和空白载体 (AdEV)用CsCl梯度纯化，测定效价，并在使用之前于-80°C下储存于病毒存储缓冲液中。31用兔抗CSE抗体（Abeam)，通过蛋白质印迹测定最优的AdCSE多重感染为20IFU/细胞。AdEV 感染的HUVEC用作阴性对照。
[0047] 酶联免疫吸附测定
[0048] 人和鼠可溶性Flt-1、可溶性内皮糖蛋白和P1GF的酶联免疫吸附测定（ELISA)试 剂盒从R&D Systems获得并且按照制造商的说明书使用。
[0049] 免疫组织化学
[0050] 如先前所述制备福尔马林固定、石蜡包埋的人和鼠胎盘组织的一系列3-5 μπι切 片用于免疫组织化学测定。29使用生物素标记的异凝集素 M、抗CSE(5mg/ml)和同型对照。 染色分析使用Nikon倒置显微镜和Image Pro Plus图象分析软件（Media Cybernetics)。
[0051] 实时聚合酶链反应（PCR)
[0052] 按照先前所述进行样品制备和实时定量PCR。3°简要地说，在RNAeasy 柱（Qiagen)上使用TRIzol和DNase-1消化/纯化提取来自胎盘组织的mRNA，并 用 cDNA 合成试剂盒（Promega)反转录。使用 CSE(GCC-CAG-TTC-CGT-GAA-TCT