-AA ; CAT-GCT-GAA-GAG-TGC-CCT-TA)或β -肌动蛋白的特异性引物，在含有SYBR green(Quantace)的SensiMix中扩增三份cDNA样品与标准品。将CSE的平均阈值周期 (CT)相对β-肌动蛋白标准化并且相对于对照组表达。
[0053] 体外血管生成测定
[0054] HUVEC 在生长因子减少的 Matrigel (Becton Dickinson，Bedford，ΜΑ)上自发形成 的毛细管状结构用于评估血管生成潜力。用采集自合并先兆子痫的怀孕者和无合并症的怀 孕者的血浆样品在有或无 H2S供体（NaHS)情况下处理HUVEC，并在37°C下培养24小时。按 照制造商的说明书用Matrigel (10mg/ml)涂覆96孔培养板。然后将HUVEC(1 X 104细胞/ 孔）接种在Matrigel涂覆的培养板上。培养6小时之后，用Nikon倒置显微镜观察细胞并 用Image Pro-Plus图像分析软件（Media Cybernetics)记录实验结果。
[0055] 测量血浆中的H2S
[0056] 梓檬酸化的血液来自于无合并症的孕妇（η = 14)和先兆子痫孕妇（η = 14)，还 来自于妊娠终止之前的怀孕小鼠。按照先前所述加以改良，来测量H2S水平。32简单地说， 75 μ 1血浆与250 μ 1 1% (w/v)乙酸锌和425 μ 1水混合，然后混合250ml50%三氯乙酸以 除去蛋白质。然后将在133 μ 1 7. 2mMHCl中的20mM N-二甲基对苯二胺硫酸盐和在133 μ 1 1.2mM HC1中的30μΜ FeClJP入到混合物中。在室温下培养10分钟后，反应混合物经 10000g离心（2分钟）形成小球。在96孔培养板中用分光光度计在670nm下测量所得溶液 的吸光度。用硫氢化钠校准曲线计算溶液中H2S的浓度。
[0057] 统计分析
[0058] 数据以平均值土SEM表示。平均值之间的差异显著性通过非参数Man Whitney t-test来检验。为了统计分析临床样本的变化，使用单向方差分析，随后视情况而定进行 Student-Newman-Keuls检验。对处理不知情的观察者执行分析。统计学显著性设置为p < 0· 05〇
[0059] 结果
[0060] 先兆子痫中胎盘CSE表达降低
[0061] 为了研究先兆子痫中CSE/H2S活性是否改变，测定取自孕龄一致的对照组怀孕者 和那些合并先兆子痫的怀孕者的血浆中的H2S。相比于对照组，先兆子痫母体血浆中H2S水 平显著降低（图1A)。定量实时PCR显示先兆子痫胎盘中CSE mRNA表达显著降低（图1B) 并且免疫组织化学染色证实在这些样本中CSE免疫反应活性显著降低（图1C iv)，表明胎 盘CSE水平的变化影响母体循环H2S水平。CSE的表达位于滋养层、内皮和在绒毛膜绒毛核 内的间充质细胞。后者可能是Hofbauer细胞，它来源于间充质（图1C iii)。本研究的患 者的临床特征描述在表1中。
[0062] 抑制CSE活性减少胎盘外植体中P1GF的释放
[0063] 由胎盘产生的血管生成因子在调节胎盘血管发育中是重要的。33由胎盘产生的 促-和抗-血管生成因子的不平衡29会导致先兆子痫中普遍的母体内皮功能障碍。34为了研 究CSE水平的降低是否会影响胎盘血管生成因子的产生，在浓度增加的CSE抑制剂PAG存 在超过24小时的情侣下，测量来自头三个月的人胎盘外植体的条件培养基中sFlt-l、sEng 和P1GF的水平。当抑制CSE活性时sFlt-1和sEng水平保持不变，而P1GF的产生显著降 低（图2)。这表明内源性H2S的减少会改变胎盘sFlt-1/PlGF比率，它与先兆子痫的发病 有关。18'29此外，当使用CSE特异性抑制剂PAG(50 μ M)培养头三个月的滋养层细胞（HTR-8/ SVneo)时，观察到细胞浸润相比于空白对照组显著减少（ρ < 0.01)(补充图S1A和S1B)， 这表明CSE活性的缺乏会影响发生正常妊娠所必需的胎盘灌注。
[0064] CSE调节内皮细胞中sFlt-Ι和sEng的释放
[0065] 尽管胎盘被认为是先兆子痫患者中sFlt-Ι和sEng释放的主要源头，一些研究表 明，产后平均18个月，与那些没有先兆子痫的妇女相比，有先兆子痫病史的妇女的sFlt-1 水平仍然较高35'36,表明该过程还涉及其它抗血管生成环境。为了研究CSE是否影响内皮细 胞中sFlt-Ι和sEng的释放，用siRNA或腺病毒调节HUVEC中CSE的表达。CSE的减量调节 增加了 sFlt-Ι和sEng的释放（图3A、3B)，而CSE的过量表达抑制HUVEC释放sFlt-Ι和 sEng(图3C、3D)。这些数据进一步支持了 CSE活性的损失可能促进先兆子痫发病的观点。
[0066] H2S部分修复先兆子痫血浆引起的体外血管生成抑制
[0067] 已证实先兆子痫胎盘产生的过量sFlt-Ι会抑制体外内皮血管生成，除去先兆子 痫样本中的sFlt-Ι则恢复血管生成。29为了评估H2S是否可以逆转先兆子痫的抗血管生成 作用，在H2S供体lOOmM NaHS存在下，向在生长因子减少的Matrigel上生长的HUVEC中加 入血压正常或先兆子痫妇女的血浆，并进行体外血管生成实验。与早期的发现一致，与正常 对照血清相比，先兆子痫血浆抑制毛细管网形成（图4)。更重要的是，H2S供体NaHS部分 恢复了 HUVEC形成管状结构的能力（图4A、4B)。
[0068] 阻断内源性H2S引起怀孕小鼠高血压和胎盘血管生成异常
[0069] 我们预测在体内抑制CSE会导致怀孕小鼠的先兆子痫样综合症。三组（5-8/组） 怀孕的C57B16/J小鼠从E8. 5到E16. 5每天用溶剂、25mg/kgPAG或50mg/kg PAG治疗。治 疗8天后，将每一治疗组中所有动物的血浆合并，测定总的H2S水平。PAG引起循环H2S水 平剂量依赖性减少。较高的剂量使血浆H2S水平减少了大约50% (图5A)。与这些数据一 致，我们发现大剂量PAG治疗组的平均血压相比于溶剂对照组显著增高（74. 40±4. 61和 64. 74±2. 04)(表2)。虽然在我们的PAG治疗的动物中没有观察到肾脏病变例如蛋白尿 (表2)，但在PAG治疗的动物中观察到由循环肝酶天冬氨酸氨基转移酶（AST)水平增加代 表的肝损伤（表2)。这些数据表明CSE活性缺乏会导致非蛋白尿先兆子痫。有趣的是，缓 释的H2S产生化合物GYY4137(0. 25mg/kg)治疗可消除PAG治疗的怀孕小鼠的所有改变（表 2)。胎盘切片的盲法组织学分析表明，50mg/kg PAG治疗的动物迷路区中的母体血腔与空白 对照组相比显得更大（图5B)。迷路区由滋养层和中胚层来源的细胞组成，它们一起经历分 支形态发生，在母亲和胎儿之间形成用于营养及气体交换的大量表面区域。母体血腔由滋 养层内衬。在胎盘发育过程中，这个空间逐渐分化得更细。37'38使用异凝集素 Μ来突出显 示胎儿内皮细胞，39我们比较了溶剂治疗和50mg/kg PAG治疗的小鼠的迷路区解剖学特征。 在对照小鼠中，迷路表现为具有发育良好的分支形态发生的有条理的胎儿血管。相反，观察 到PAG治疗的动物胎盘的胎儿脉管系统为不规则的分支（图5C)并且母体脉管系统出现扩 大。PAG治疗的动物的胎盘形态学表明胎盘血管缺陷是由抑制CSE活性导致的。这个缺陷 也可以通过H2S供体GYY4137治疗恢复（图S2)。
[0070] 抑制CSE活性对胎儿出生以及sFlt-Ι和sEng产生的影响
[0071] 接受较高剂量PAG的小鼠胎儿体重明显降低（图6A)。这可以用抑制CSE活性引 起的胎盘血管缺陷来解释。0. 25mg/kg的GYY4137可恢复由CSE抑制损害的胎儿生长（图 6A)。此外，在50mg/kg PAG(图5B和5C)治疗的小鼠中，GYY4137抑制由CSE抑制引起的 sFlt-Ι和sEng的血浆水平（图6B和6C)。血浆P1GF低于实验的检出限。这些数据表明 抑制CSE活性改变了母体血管生成的平衡，而且H2S可以帮助恢复正常的血管生成状态。
[0072] 讨论
[0073] 长期服用CSE抑制剂导致大鼠 H2S减少和血压升高。7因此，循环H 2S水平的减少 可导致先兆子痫高血压似乎是有道理的。在本研究中我们提供了先兆子痫与循环H2S减少 相关的证据，其中伴随有负责产生内源性H2S的关键酶胎盘CSE的减量调节。此外，抑制怀 孕小鼠的CSE导致高血压，增加 sFlt-Ι和sEng水平以及导致胎盘异常。这是由于抑制了 H2S的产生，然而缓释的H2S生成化合物GYY4137抑制循环sFlt-Ι和sEng水平并恢复CSE 抑制损害的胎儿生长。这些发现表明CSE/H2S途径功能障碍可以促成先兆子痫的发病。
[0074] H2S是一种血管舒张因子，通过KATP通道引起平滑肌松弛研究中使用CSE遗 传缺陷小鼠证明，在脉管系统和末梢组织中这种酶是H2S的主要来源。9最近，在胎盘和妊 娠子宫肌层中发现了 CSE表达并且表明它在子宫收缩中发挥作用。27'28在该研究中，与血压 正常的对照相比，先兆子痫患者胎盘CSE水平显著降低。最近的一项研究也显示了在先兆 子痫胎盘中类似的CSE模式。41这些发现表明CSE的缺乏导致循环H 2S减少。
[0075] 血管生成失调被强调是先兆子痫的元凶，超过系统炎症。42'43在本研究中，发现 CSE是内皮细胞中抗血管生成因子sFlt-Ι和sEng的负调节剂，表明CSE失调可能会导致 持续的内皮功能障碍和有先兆子痫病史妇女的心血管病风险升高。此外，先兆子痫中VEGF 和P1GF活性的降低被认为是sFlt-Ι过量的结果。16'18由于在孕期的头三个月sFlt-Ι水 平与健康对照相当，所以该理论不能解释为什么在随后型成先兆子痫的妇女怀孕早期P1GF 循环水平是低的。44我们发现通过CSE抑制剂抑制内源性胎盘H2S的生成减少了妊娠头三 个月胎盘外植体中P1GF的产生，该发现提供了一种合理的解释和一种新的待检验的假设： 艮P，怀孕早期P1GF表达的降低是由于产生H2S的酶减少或损失。此外，抑制CSE活性消除 了头三个月外绒毛滋养层细胞浸润，表明CSE/H2S途径的失调不仅可以改变胎盘促血管生 成因子和抗血管生成因子的平衡，而且使母体螺旋动脉重塑和胎盘发育失调。
[0076] 在怀孕小鼠中，CSE抑制减少内源性H2S，而且这伴有血压升高和肝损伤，没有例如 蛋白尿和肾小球内皮增生的肾病理学改变，一种类似于非蛋白尿先兆子痫的综合症。然而， 这也说明其他因素也与先兆子痫的整个疾病谱有关。先兆子痫还在很大程度上与胎盘异常 有关，包括损害绒毛体积和表面积，同时减少胎盘血管生成。15'45在PAG治疗的小鼠中，胎儿 迷路显示出受损的分支形态发生，表明内源性H2S是胎盘发育所需要的。
[0077] 已有报导受损的胎盘灌注和欠佳的氧气以及营养扩散的发生是具有改变的模式、 分支和扩张的不合适迷路血管生成的结果。46被PAG治疗损害的血压、肝功能和胎儿体重 可以被缓释的H2S生成化合物GYY4137恢复，表明CSE抑制剂的作用是由于抑制了 H2S的产 生。这些结果表明，内源性H2S是用于支持胎儿健康的健康胎盘脉管系统所需要的。
[0078] 临床前景
[0079] 本发明的研究表明CSE/H2S途径的失调与先兆子痫相关，并且抑制怀孕小鼠的CSE 活性会产生一些先兆子痫的特征，包括高血压和胎儿出生受损。这些发现支持如下观点： H2S是胎盘脉管系统发育的重要调节剂，H2S缺乏表现出与先兆子痫和胎儿生长受限相关。
[0080] 补充方法
[0081] 滋养层细胞浸润测定
[0082] 人绒毛外滋养层（EVT)细胞系 HTR-8/SVneo 是 Queen' s University，Kingston， Ontario，Canada的Charles H. Graham教授赠送的。按照先前所述加以修正进行浸润测定。3°简单地说，将使用或不使用PAG处理的HTR-8/SVneo(50000)细胞置于Matrigel涂覆的 (lmg/ml) transwell inserts (8 μ m 孔，Falcon，BD，UK)上室中，并置于一个 24 孔板中。在 存在或不存在50 μ M PAG (η = 3)的条件下，使细胞侵润通过重组胞外基质24小时。位于 transwell薄膜下表面的滋养层细胞用冰冷的甲醇固定并用苏木精染色，由Nikon倒置显 微镜和image Pro Plus图象分析软件（Media Cybernetics)获得亮视野的图像。
[0083] 免疫组织化学
[0084] 如先前所述，制备一系列福尔马林固定、石蜡包埋的小鼠胎盘组织的3-5 μπι切片 用于免疫组织化学检测48。使用生物素标记的异凝集素 M。使用Nikon倒置显微镜和Image Pro Plus图象分析软件（Media Cybernetics)分析染色。
[0085] 图7. CSE抑制对滋养层细胞浸润的影响。HTR-8/S