白头翁皂苷b4作为ev71病毒抑制剂在制备抗手足口病药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及白头翁皂巧B4作为EV71病毒抑制剂在制备抗手足口病药物中的应用， 属于医药领域。
【背景技术】
[0002] 手足口病（hand-foot-mouth disease,HFMD)是肠道病毒所引起的严重危害5岁 W下婴幼儿急性传染病，自2008年纳入国家疫情报告系统W来，每年报告手足口病发病数 均有100余万例，截至2015年末，全国累计报道手足口病发病近1400万例，婴幼儿死亡达 3300多例，发病率排在法定传染病的第一位，病死率排在前5位，对社会稳定和经济发展造 成重大影响，引起广泛关注。手足口病的主要表现为发热、口腔黏膜溃瘍性瘤疹及四肢末端 水瘤样皮疹，个别患者因病毒侵袭屯、脏与大脑而引发屯、肌炎、肺水肿等致命性并发症，其中 柯萨奇病毒A16 ( Coxsackie A16，CA16 )和肠道病毒71 型（Enterovirus 71，EV71)是本 病的主要致病原，而EV71型肠病毒危害更大。近年来，在亚洲爆发流行的病原体主要是 EV71，其流行呈上升的趋势，目前尚无特效药物。因此，开发有效的抗EV71病毒的药物用 于治疗手足口病迫在眉睫。
[0003] 相对于价格高昂、抗病毒活性不甚理想的传统西药，中药具有价格低廉、药源广 泛、活性显著等优点。传统中药材能抑制病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改 善肺循环、镇痛抗炎等。目前，随着筛选和分离技术的提高，从中药中寻找具有抗病毒活性 的成分已经成为开发抗病毒药物的重要途径之一。
[0004] 大量的体外抗病毒筛选和临床研究结果发现，某些复方及单味中药均显示出良好 的抗EV71病毒活性。研究表明清开灵、双黄连等很多中药复方及单味药能缓解EV71手足口 病病情和缩短病程。如注射用双黄连粉针，主要由连翅、银花、黄琴等提取制成，具有辛凉解 毒清热之功效，易世红等对双黄连粉针剂的体外抗病毒药效学研究表明，其具有明显抑制 新肠道病毒71型的作用，在治疗手足口病的临床应用中具有良好的疗效。张闻等将79例确 诊为小儿手足口病的患儿随机分为2组，对照组给予利己韦林颗粒，观察组给予清开灵颗 粒，观察2组的疗效及副反应，结果显示2组疗效无显著性差异，但对照组的不良反应发生 率明显高于治疗组，运表明清开灵颗粒用于治疗小儿手足口病效果好于利己韦林。牛儿苗 科植物老鹤草的主要成分之一，中医古籍《日华子本经》、《本草纲目》、《滨南本草》均有记载 其清热解毒等功效。现代药理显示其抗病毒、抗菌、护肝药效，实验表明老鹤草在体内和体 外抗EV71均有较好的效果。细胞实验:使用10 yg/mL的药物可在RD细胞上明显抑制EV71病 毒复制，动物实验:老鹤草可W明显降低EV71感染小鼠死亡率，减轻其临床症状，并降低其 组织病毒复制。
[000引 白头翁是毛良科(Ranunculaceae)白头翁属植物白头翁（Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel)的干燥根，具有清热解毒、凉血止频的功效。白头翁的主要药理作用包括抗 菌作用、抗阿米己原虫作用、抗病原体作用、抗癌作用、杀精子作用和镇静镇痛作用。白头翁 的主要有效成分包括白头翁素和白头翁皂巧等，其中白头翁皂巧可通过水提或醇提得到。 现代药理研究发现，白头翁皂巧具有增强免疫功能、抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等作用，因 此受到广泛的研究和关注，但目前尚未有病毒活性的白头翁皂巧单体化合物的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供白头翁皂巧B4作为EV71病毒抑制剂在抗制备抗手足口病药 物中的应用。
[0007] 白头翁皂巧B4，分子式：C日姐96〇26，英文名：Anemoside B4，化学名：3-0-a-k化喃鼠 李糖基-(1 一2)-日-心化喃阿拉伯糖基-30，23-二径基羽扇豆烧-A 20(29)締-28-0-日寸-化 喃鼠李糖-(1 一 4)-e-D-化喃葡萄糖-(1 一 6)-e-D-化喃葡萄糖巧。
[0008] 白头翁皂巧B4在抗制备抗手足口病药物中的应用是通过抑制EV71病毒感染引起 的细胞调亡与坏死的活性达到的，本发明的白头翁皂巧B4作为EV71病毒抑制剂在治疗手足 口病中的应用属于首次公开，属于纯天然制剂，安全可靠无毒副作用，对WEV71病毒抑制剂 为祀标的手足口病药物开发具有潜在的价值。
[0009] 本发明通过具体实施例中的实验证明了白头翁皂巧B4作为EV71病毒抑制剂具有 治疗手足口病的作用。
【附图说明】
[0010] 图1:白头翁皂巧B4的结构式。
[00川图2: EV71病毒感染畑细胞不同时间点调亡与坏死分析 图3:白头翁皂巧B4对EV71病毒的抑制作用的调亡比例统计分析 图4:不同浓度的白头翁皂巧B4对EV71病毒抑制作用的巧光显微镜致病变效应分析 图5:不同浓度的白头翁皂巧B4对EV71病毒抑制作用的调亡比例统计分析。 具体实施例
[0012] W下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受具体实 施例的任何限制，而是由权利要求加 W限定。
[001引实施例1:白头翁皂巧B 4体夕晰EV71的活性现憶。
[0014] (1)病毒感染 感染模式:RD细胞(人横纹肌瘤细胞），EV71能在RD细胞中感染并复制，引起RD细胞调亡 与坏死，EV71主要感染人的肌肉与神经组织，体外用EV71感染畑细胞可W模拟手足口病模 型。
[001引感染方法:EV71感染RD细胞引起RD细胞调亡与坏死将RD细胞种在6孔板，待细胞贴 壁后，浓度达到80%，EV71感染细胞，正常培养的RD细胞作为空白对照。在感染后不同时间取 样，用倒置巧光显微镜观察病毒致细胞病变效应(切topathic Effect, CPE)观察，用流式 细胞仪测定细胞的调亡与坏死。流式细胞仪测定结果如说明书附图2所示。
[0016]结果分析:在本实验感染复数下，24小时内细胞基本没有出现明显的调亡与坏死， 24小时后调亡与坏死急剧增加，到第36小时，大部分细胞已裂解，或收缩变圆，或脱壁，显 示RD细胞出现了明显的调亡与坏死(调亡结果中未计算已裂解的细胞）。
[0017] (2)白头翁皂巧B4对EV71的抑制作用(病毒感染与药物处理同步） 实验方法:将RD细胞种在6孔板，待细胞贴壁后，浓度达到80%，正常培养的RD细胞与仅 加 B4的孔作为空白对照；只感染EV71的孔作为阳性对照;在感染EV71的同时加入B4作为实 验组。B4处理浓度为50 ng/血，36小时后取样，流式细胞测定调亡，实验结果如说明书附图 3所示： 结果分析:B4具有明显的抑制EV71感染引起的细胞调亡与坏死的活性。
[001引（3)白头翁皂巧B4对EV71的抑制作用(先感染后用药物处理） 实验方法:使用同样的感染模型，将RD细胞种在6孔板，待细胞贴壁浓度达到80%，先用 EV71感染18小时，然后再分别用不同浓度（1 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL)的白头翁皂巧B4 药物处理EV71感染的细胞，用倒置巧光显微镜观察病毒的致细胞病变效应(Cytopathic Effect, CPE)现象。倒置巧光显微镜观察效果结果(如说明书附图4所示），18小时后用流式 细胞仪分析细胞的调亡与坏死情况(如说明书附图5所示）。
[0019] 结果分析:倒置巧光显微镜观察效果在低浓度(1 ng/mL)时，略有保护作用但不明 显，在中高浓度(25 ng/mL和50 ng/mL)有明显的保护作用，且高浓度保护作用较中浓度略 强。流式细胞仪分析显示相同的感染模式与给药处理方式，不同浓度的白头翁皂巧B4对细 胞活性无明显影响，低浓度保护作用不明显，中高浓度具有明显的保护作用。
[0020] 实施例2:白头翁皂巧B 4体内抗EV71的活性测定 (1)实验动物:2日龄ICR小鼠，平均体重在1.6-1.8克。
[0021] (2)感染方法:取2日龄乳鼠，禁食5小时后，EV71病毒腹腔注射。
[0022] (3)实验分组:共分成9组：阴性组(未感染病毒组），模型组(感染病毒后，每天腹腔 注射等体积的生理盐水），阳性对照组(感染病毒后，每天利己韦林腹腔注射治疗，100 mg/ kg/天），实验组1(感染病毒24小时后，每天腹腔注射白头翁皂巧B4 1次，剂量分别为50， 100, 200 mg/kg/天），实验组11(感染病毒72小时后，每天腹腔注射白头翁皂巧B4 1次，剂 量分别为50，100, 200 mg/kg/天）。每组实验动物为12只，给药体积为10 yL/g。
[0023] (4)实验结果： 状态观察结果:感染病毒2天后，模型组所有动物一侧后肢明显僵直，略呈绕圈爬行，饮 食正常，实验组I各剂量组症状不明显。感染病毒3天后，模型组和实验组II中所有动物双后 肢僵直，爬行略困难，生长变慢，体重相对阴性组明显下降，个体大小表现明显差异，胃内依 然有食物残留；实验组I中仅低剂量组巧0 mg/kg/天)有5只出现一侧后肢僵直，其它剂量组 动物的症状不明显。
[0024] 各组成活数目统计:数据见表1和表2,感染病毒7天后，模型组和阳性对照组所有 动物均已死亡;实验组I中的低剂量组存活动物1只，但有一侧后肢僵直;实验组I中的中剂 量组存活动物6只，但个体平均体重仅阴性组一半，有4只动物出现一侧后肢僵直，2只动物 两后肢均僵直，前肢均正常，胃内残留食物量少;实验组I中的高剂量组存活动物9只，且有6 只动物体重与阴性组间无明显差异，2只动物出现一侧后肢略有僵直症状且体重较轻，1只 动物出现一侧后肢明显僵直症状;实验组II中仅高剂量组存活动物4只，且双后肢有明显僵 直，体重仅阴性组一半左右。
[0〇2引表1:病毒感染24小时后给药白头翁皂巧B4,各组小鼠存活数统计
表2:病毒感染72小时后给药白头翁皂巧B4，各组小鼠存活率统计
【主权项】
1. 白头翁皂苷Μ在制备抗手足口病药物中的应用。2. 如权利要求1所述的的应用，其特征在于：白头翁皂苷Μ是通过抑制EV71病毒感染引 起的细胞凋亡与坏死的活性达到的。
【专利摘要】本发明公开了白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂在制备抗手足口病药物中的应用，白头翁皂苷B4在制备抗手足口病药物中的应用是通过抑制EV71感染引起的细胞凋亡与坏死的活性产生的，本发明的白头翁皂苷B4作为EV71病毒抑制剂在治疗手足口病中的应用属于首次公开，属于纯天然制剂，安全可靠无毒副作用，对治疗手足口病药物研发具有潜在价值。
【IPC分类】A61P31/14, A61K31/704
【公开号】CN105535004
【申请号】CN201610069887
【发明人】刘琦
【申请人】刘琦
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月2日