使吸烟的不利作用减少的新方法
【专利说明】使吸烟的不利作用减少的新方法 发明领域
[0001 ]本发明涉及健康与医药领域，更具体地，涉及预防或治疗肺疾病(例如C0PD、肺气 肿和肺癌）的领域，或者，克服吸烟带来的问题的领域，更具体地，涉及用于减少烟雾吸入的 不利作用的香烟、烟草和其它吸烟材料。
【背景技术】
[0002] 吸烟有害健康。自从二十世纪七十年代以来，收集到越来越多的证据显示吸烟(尤 其是吸香烟(cigarettes)，以及其他形式的吸烟)对吸烟者与未吸烟的旁人的健康的负面 影响。众所周知，并且也由多次临床实验确定了，香烟烟雾在肺结构的弹性内容物(例如，气 管、支气管、细支气管和肺泡系统）的退化中起关键作用。更具体地，肺气肿是局部肺泡壁损 伤或破坏。
[0003] 肺泡壁中的毛细管是最重要的解剖学特征。它们形成缠结的网络，并且由富含弹 性和网硬蛋白纤维的精细的纤维间质支持。巨噬细胞在肺泡空间中发生，并且形成抵抗入 侵细菌的第一道防御机制。根据"弹性蛋白酶:抗弹性蛋白酶"假说，香烟烟雾会导致炎症， 以及后续的蛋白水解酶超过其天然抑制剂的规模向肺中释放。在缺乏正常修复的情况下， 蛋白水解导致组织破坏和气道扩大。该弹性蛋白酶:抗弹性蛋白酶假说已经主导了近四十 年的COFO研究。1963年，Laurell和Eriksson(Laurell CB，Eriksson S.Scand J Clin Invest 1963,15:132-140)报道了如下观察结果：不生成或生成不足量的α-1-抗胰蛋白酶 (αΙΑΤ)(嗜中性弹性蛋白酶(ΝΕ)的主要抑制剂)的患者发展早发性肺气肿。紧随其后，Gross 等(Gross P等.Arch Environ Health 1965,11:50-58)将木瓜蛋白酶，一种弹性蛋白酶，慢 慢地输入大鼠的肺，导致肺气肿。随后，研究者们能够通过将其它弹性酶(包括人嗜中性弹 性蛋白酶)慢慢地输入实验动物的气道来诱导肺气肿(Senior RM等J Clin Invest 1980， 66:859-862;如11〇打八等^1111^￥1^8?卜018 1977，115:46卜478;5111(16161^等^1111^￥ Respir Dis 1984,129:155-160)。总之，这些观察结果确证NE作为蛋白酶最有可能引起肺 气肿中的组织破坏。吸烟的关系也已由Shapiro等确证（Shapiro S等.Am J Pathol.2003 163(6):2329-2335)。
[0004] 无疑，在多项研究中，已将肺癌的发生与吸烟相关联。肺癌没有单一的形式，并且 其可由支气管癌、肺泡癌、支气管腺瘤和间充质瘤组成。特别是支气管癌，已将其与吸烟(香 烟）相关联。观察到该癌症的解剖学变化是上皮的变化，例如，毛细胞损失、基底细胞增生、 鳞状细胞化生和非典型细胞结构。尽管已经显示弹性蛋白酶抑制会受到存在于香烟烟雾中 并且被证明具有致癌性的化学化合物(如多芳环烃)的致癌活性影响，人们假设弹性蛋白酶 抑制会影响伴随癌发生的级联事件，例如，癌的免疫组分的作用。
[0005] 尽管已表明弹性蛋白酶抑制剂可用于治疗肺气肿（例如K0rak i，T .等，2002， Am.J.Resp·Crit·Care med·166:496-500;Wright，J.等，2003，Eur·Resp·J·22:77-81)，迄 今为止未见这些化合物在肺气肿领域的商业应用。
[0006] 仍然需要对于具体蛋白酶(例如，弹性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、组织蛋白酶G 等)具有特异性的新型蛋白酶抑制剂。
【发明内容】
[0007] 本发明的发明人现已发现发新素(fahsin)可用于预防选自肺气肿、C〇ro和肺癌的 肺疾病。例如在治疗或预防肺疾病(具体为肺气肿）中的应用可优选地通过吸入，尤其是通 过吸入烟雾(更具体地，烟草(例如香烟)烟雾)来实现。
[0008] 本发明还包括用于治疗或预防肺气肿的吸烟制品，例如香烟，包括电子香烟（e-cigarette)、烟斗烟草、雪前或烟卷（joint)。优选地，所述吸烟制品包含弹性蛋白酶抑制 剂，优选地，选自下组：发新素、瓜梅素（guamerin)、匹瓜梅素(piguamerin)、希如斯塔辛 (hirustasin)、德拉斯塔辛(^(161138丨38；[11)和瓜梅素的突变体、在第6个半胱氨酸残基之后 包含亮氨酸残基的匹瓜梅素、希如斯塔辛和德拉斯塔辛。进一步优选地，所述弹性蛋白酶抑 制剂以掺混物形式或由烟草或大麻表达的蛋白质形式包含在所述烟草或大麻中。或者，所 述香烟是过滤嘴香烟或电子香烟，并且，所述弹性蛋白酶抑制剂存在于过滤嘴中。又或者， 所述吸烟制品是香烟或卷烟，并且所述弹性蛋白酶抑制剂存在于卷烟纸中。
[0009] 在另一个实施方式中，所述弹性蛋白酶抑制剂是重组生成的发新素。
[0010] 本发明还包括转基因烟草或大麻，其包含弹性蛋白酶抑制剂，优选地是发新素。因 此，本发明包括含有所述转基因烟草或大麻的香烟。
[0011] 本发明的另一个部分是预防或减轻肺气肿、C0PD或肺癌的方法，所述方法包括抽 吸本发明的吸烟制品。
[0012] 本发明的另一个实施方式是预防或减轻肺气肿、coro或肺癌的方法，所述方法包 括吸入弹性蛋白酶抑制剂，优选是发新素，更优选是重组发新素。
[0013] 本发明还包括一种改善吸烟者的肺功能的方法，所述方法通过给予弹性蛋白酶抑 制剂，优选地通过吸入给予所述抑制剂来进行。优选地，在所述方法中，所述吸入是吸入烟 雾，其中所述烟雾包含所述抑制剂。
[0014] 在另一个实施方式中，本发明提供发新素、瓜梅素、匹瓜梅素、希如斯塔辛和德拉 斯塔辛的新型突变体。
【附图说明】
[0015]图1:五种不同安逖斯塔辛(ant istas in)型丝氨酸蛋白酶抑制剂的一级氨基酸序 列的比对。所述蛋白质中具有相似间距的半胱氨酸残基以粗体表示。反映所述抑制剂的特 异性的反应位点(P1)氨基酸残基以下划线表示。
[0016]图2.不同瓜梅素突变体对人嗜中性弹性蛋白酶的抑制。X轴指示突变体P1位的残 基(met是野生型），空白是仅有底物，而最大(max)是底物+弹性蛋白酶。短线表示自孵育开 始之后的时间。Y轴显示检测到的A405-A540的差。
[0017]图3.不同浓度的发新素突变体对组织蛋白酶G的抑制。突变体指示和y轴与图2中 类似。
[0018]图4.瓜梅素突变体对不同蛋白酶的抑制。A:组织蛋白酶G，B:糜蛋白酶，C:弹性蛋 白酶，D:胰蛋白酶，E:纤溶酶，F:凝血酶 [0019]发明详述
[0020] 近期发现的弹性蛋白酶抑制剂之一是发新素，其源自尼罗河水蛭（Limnatis nilotica)(De Bruin，E.等，FEMS Yeast Res.5:1069-1077,2005;TO 96/13585)。在该公开 文件中已证明，发新素是对人嗜中性弹性蛋白酶(hNE)具有特异性的蛋白酶，并且是其它重 要的血液源性丝氨酸蛋白酶，例如纤溶酶、凝血酶、tPA、凝结因子Vila、Xa、XIa和Xlla所无 法比拟的。这使其成为本发明的理想候选物。
[0021] 此外，尽管发新素是肽化合物，其在重组技术的协助下易于生成，并且已证明其具 有相当的稳定性。所述氨基酸序列(GenBank DQ097891.1)和编码所述氨基酸序列的核苷酸 序列(GenBank AAY85799.1)已示于图1。如De Bruin等（同上)所述，发新素类似于其它安逖 斯塔辛型蛋白酶抑制剂，它们以特定的距离具有10个半胱氨酸残基的共有序列：
[0022] C(X4)CS(X4)C(X4)CXC(X4)C L(X3)C(X6)DXNGC(X3)CXC
[0023] 其中X可以是任何氨基酸，并且C、L、N、G和C具有其氨基酸命名中的常规含义。
[0024] 对于NE的特异性归因于第6个半胱氨酸残基之后的亮氨酸残基。认为具有上述共 有序列的肽可用于本发明，并且将具有NE-抑制效应。
[0025] 发新素之外，其它安逖斯塔辛型丝氨酸蛋白酶(NE)抑制剂也可用于本发明。示例 有:瓜梅素、匹瓜梅素、希如斯塔辛和德拉斯塔辛。这些化合物的氨基酸序列为：
[0026] 瓜梅素（日本医輕（Hirudo nipponia)): vdenaedthg lcgektcspa qvclnnecac taircmifcp ngfkvdengc eypctca
[0027] 匹瓜梅素（日本医輕）：tdcggktcse aqvckdgkcv cvigqcrkyc pngfkkdeng ctfpctca
[0028] 希如斯塔辛（欧洲医輕（Hirudo medicinalis)) : tqgntcgget csaaqvclkg kcvcnevhcr irckyglkkd engceypcsc akasq
[0029] 德拉斯塔辛（欧洲医輕）：f dvnshttpc gpvtcsgaqm cevdkcvcsd lhckvkcehg fkkddngcey acicadapq
[0030] 发新素的这些替代物中，特别优选的是突变的瓜梅素，其中，第6个半胱氨酸残基 之后的甲硫氨酸残基被改成亮氨酸残基：vdenaedthg lcgektcspa qvclnnecac tairclifcp ngfkvdengc eypctca。已显示(结果未显示），所述突变的瓜梅素对化学和生物 氧化作用均不敏感，并且，该突变的蛋白质还似乎是NE分子的强抑制剂(如野生型发新素）。 据信，将该特定残基(参见图1)，其在上述的其它分子中是精氨酸残基（匹瓜梅素和希如斯 塔辛)或赖氨酸残基(德拉斯塔辛），改变为亮氨酸残基，也能够提供对NE具有提高的反应性 的突变蛋白，并且其比野生型蛋白质更加稳定。
[0031] 由此，