基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，属于医学皮肤组织工程技术领域。
【背景技术】
[0002]生物衍生材料具有与细胞外基质相似的结构和良好的生物相容性，是一种非常有优势的组织工程支架材料。在众多的生物衍生材料中，小肠粘膜下层(SIS)具有低免疫原性，抗菌性和促进组织生长等优势，所以被认为是一种非常理想的组织工程支架材料。
[0003]SIS中含有丰富的蛋白多糖、胶原蛋白和纤维粘连蛋白，能促进细胞与组织间的黏附、增殖和分化。蛋白多糖常在细胞黏附的早期阶段，如细胞的附着和伸展阶段起作用；胶原蛋白通过I型胶原的α?链，纤维粘连蛋白通过RGD序列与细胞膜受体特异结合，激活信号传导通路促进细胞黏附。
[0004]SIS包含的多种生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、喊性成纤维细胞生长因子(b-FGF)等在组织的修复和重构中有着重要的促进作用。SIS具有独特的解剖结构:胶原纤维间的类肝素硫酸蛋白聚糖主要集中在血管；呈弥散分布;VEGF则主要分布在血管周围。这种结构在组织再生中发挥重要作用。
[0005]目前国内外用于阴道组织工程研究的主要支架材料聚乙醇酸存在降解过快等缺陷。天然脱细胞支架材料尤其是小肠黏膜下层逐渐成为组织工程研究的重点。
[0006]阴道是女性重要生殖器官，由于先天性疾病或后天损伤、肿瘤等原因造成的部分或全部缺失，需要进行修复和再造。应用各种自体或异体组织进行阴道修复时，不但会造成新的损伤，而且术后可能出现再造阴道挛缩、分泌物过多及异味等现象，另外再造的阴道在组织学、形态学和功能方面都与正常阴道组织有很大差异。倘若能利用患者自身的少量细胞，通过组织工程技术“再造”出接近自然的阴道组织，再覆盖阴道穴腔，则无疑是一种新型的、理想的阴道成形术。
[0007]2003年，De Filippo等将阴道上皮细胞和平滑肌细胞种植于包被有50:50异量分子聚合物(左旋和右旋的内交脂和乙醇酸交脂聚合物)的聚乙醇酸支架上成功地构建了组织工程阴道组织，种植于其上的阴道上皮细胞和阴道平滑肌细胞生长增殖良好。但聚乙醇酸材料在免疫原性、抗微生物原性、能促进组织再生等特性与天然支架材料相比还有一定的差距。小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)基质作为天然细胞外基质类生物衍生材料，是自猪小肠解剖出其黏膜下层经处理后获得富含胶原的生物材料，具有无免疫原性、抗微生物原性、能促进细胞再生、提供细胞生存和铺展的三维空间，利于细胞新陈代谢等特性，在实验和临床工作中已被较多用于血管、膀胱、神经及腹壁等组织缺损的修复，显示出良好的组织相容性。Rotariu等用猪SIS修复兔长达2.5 cm尿道缺损，观察到SIS能促进尿道上皮的再生，组织学检查见基质中新生的尿道组织层几乎与正常无差别。Gabouev等将膀胱上皮细胞和膀胱平滑肌细胞种植在SIS上，免疫组化显示形成了膀胱上皮和膀胱平滑肌细胞双层结构，成功地制成了组织工程化膀胱。本发明制备无细胞成分的SIS细胞基质，将培养扩增阴道平滑肌细胞种植于SIS上，体外复合培养观察细胞在该材料上黏附、增殖、侵入情况，以探讨猪SIS用作组织工程学阴道平滑肌细胞载体的可行性，为研制无细胞基质组织工程学阴道奠定基础。
【发明内容】
[0008]目的:为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法。
[0009]技术方案:为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
一种基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，包括以下步骤:
1)SIS制备:
物理方法处理:小肠取自体质量>200 kg的家猪;在运输过程中将小肠冰冻冷藏，在4 h内完成清洁过程；用裹有纱布的刀柄去除小肠的浆膜层和肌层，其间持续用40 °C温水冲洗；
化学方法处理:沿纵轴切开经物理方法处理的小肠，切成每段15 Cm长，按Abraham方法制备;化学方法处理过程的每一步均在室温下进行，材料与溶液积的比例都保持在1:100;
2)阴道平滑肌细胞的分离培养:取材、分离:选取2.0?2.5kg雌兔，氯胺酮25 mg/kg肌注麻醉后，固定四肢，充分暴露泄殖孔;下腹部及外阴部用碘伏消毒，阴道用无菌甲硝唑液冲洗;在耻骨联合上方，沿腹白线做5 cm左右切口，依次切开皮肤、腹直肌和腹膜，提起阴道，可见与双子宫相连的阴道组织，完整切取阴道组织后，缝合创口，逐层关腹;用无菌生理盐水、双抗液多次冲洗取下的阴道组织，之后将标本放入预先备好的PBS+双抗液中，送往实验室;在超净工作台上将阴道组织块浸泡于0.05%洗必泰中5 min，再用DMEM湿润组织块，用刀片和眼科手术器械仔细分离去除黏膜上皮层和浆膜结缔组织层，然后将分离好的平滑肌组织平铺修剪形成I _3的组织块，并使组织块边缘整齐、光滑；
3)原代培养:组织块+酶消化法进行原代培养;将修剪好的组织块用0.1%胶原酶IV在370C培养箱中消化0.5-1.0 h,至组织块边缘变毛时中止消化，然后将消化好的组织块接种于培养皿上，间隔约5 mm,37 °(:恒温培养箱中静置培养3.0?4.0 h，待组织块贴壁牢固后，再补加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，37 °C恒温静置培养3.0-4.0 d,待细胞游出后换液，每周换液两三次以维持细胞生长；
4)阴道平滑肌细胞在SIS上种植:待细胞生长达80%融合时即进行传代，弃去旧培养基，向培养瓶加入混合消化液，37 °C孵育3-7 min，观察到细胞间隙增大、细胞呈圆形、部分悬浮于消化液中时向培养皿内加入体积分数为0.8%的胎牛血清终止消化，将细胞悬液离心5min，离心收集细胞，培养基再悬浮，以5.0 X 106/cm2接种到SIS基质内面上，37 °C、体积分数为5%C02孵箱内静置培养;培养基仍是含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，每隔2 d更换培养基一次。
[0010]作为优选方案，化学方法处理具体是指:(I)在含有0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTAMp0.4%胰蛋白酶的溶液于37 0C条件下中浸泡、搅拌5.0-6.0 h; (2)继续用0.2%戊二醛对组织进行交联保护；用去离子水冲洗干净，置于含40 ymol/L DNA酶和I mmol/L氯化钠的溶液中浸泡、搅拌猪小肠6?8 h; (3)用去离子水冲洗后在氯化钠(I mmol/L)磷酸缓冲液(PBS)中浸泡、搅拌16 h; (4)用去离子水冲洗后在I3BS溶液(pH值为7.0?7.4)中浸泡2 h;(5)再用去离子水冲洗基质2h; (6)杀菌:将SIS在含0.1%过氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05%叠氮化钠的PBS溶液清洗2 h，可短期保存于4 °CPBS溶液中。
[0011]作为优选方案，所述的基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，其特征在于: