化学方法处理过程除杀菌外，所有的处理过程中均在磁力搅拌器中浸泡、搅拌下进行。
[0012]作为优选方案，所述的基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，其特征在于:所述双抗液为青霉素与链霉素的混合溶液。
[0013]作为优选方案，所述的基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，其特征在于:所述混合消化液为0.25%胰酶:0.02%EDTA=1: I。
[0014]作为优选方案，所述的基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，其特征在于:所述离心转速为I 000 !"/!^!!，离心半径]^ Cm。
[0015]有益效果:本发明提供的基于小肠黏膜下层无细胞基质制备平滑肌细胞载体的方法，①体外成功培养出阴道平滑肌细胞，倒置显微镜下，见培养的阴道平滑肌细胞呈现长梭状，细胞集结于培养皿上形成典型的“峰和谷”样构型。②黏膜下层无细胞基质外观呈白色，半透明，有一定韧性。苏木精-伊红染色未见细胞成分存在。③阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片苏木精-伊红染色后，光镜下可见细胞成分逐渐增多，由表浅向深层部位生长。④阴道平滑肌细胞-肠黏膜下层标本切片采用抗兔平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组化染色后，均可见抗兔α-Actin的阳性细胞。结果初步证明了猪小肠黏膜下层基质可作为一种平滑肌细胞载体。
【具体实施方式】
[0016]下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。
[0017]实施例1:
SIS制备及组织学检查:
物理方法处理:小肠取自体质量>200 kg的家猪。在运输过程中将小肠冰冻冷藏，在4 h内完成清洁过程。用裹有纱布的刀柄去除小肠的浆膜层和肌层，其间持续用40 °C温水冲洗。
[00? 8] 化学方法处理:沿纵轴切开经物理方法处理的小肠，切成每段15 cm长，按Abraham等方法制备。化学方法处理过程的每一步均在室温下进行，材料与溶液积的比例都保持在1:100。
[0019]具体方法为:(I)在含有0.5 mmoI/L乙二胺四乙酸(EDTA)和0.4%胰蛋白酶的溶液于37 °C条件下中浸泡、搅拌5.0?6.0 11。(2)继续用0.2%戊二醛对组织进行交联保护；用去离子水冲洗干净，置于含40 ymol/L DNA酶和I mmol/L氯化钠的溶液中浸泡、搅拌猪小肠6?8 11。(3)用去离子水冲洗后在氯化钠(I mmol/L)磷酸缓冲液(PBS)中浸泡、搅拌16 11。(4)用去离子水冲洗后在I3BS溶液(pH值为7.0?7.4)中浸泡2 11。(5)再用去离子水冲洗基质2 h。
(6)杀菌:将SIS在含0.1%过氧乙酸的20%乙醇溶液中浸泡8h，用含0.05%叠氮化钠的I3BS溶液清洗2 h，可短期保存于4 °CPBS溶液中。以上除杀菌过程外，所有的处理过程中均在磁力搅拌器中浸泡、搅拌下进行。
[0020]SIS组织学检查:运用光学显微镜和苏木精-伊红染色观察经物理和化学方法处理后SIS的组织学结构。
[0021 ]阴道平滑肌细胞的分离培养:取材、分离:选取2.0-2.5 kg新西兰雌兔，氯胺酮25mg/kg肌注麻醉后，固定四肢，充分暴露泄殖孔。下腹部及外阴部用碘伏消毒，阴道用无菌甲硝唑液冲洗。在耻骨联合上方，沿腹白线做5 cm左右切口，依次切开皮肤、腹直肌和腹膜，提起阴道，可见与双子宫相连的阴道组织，完整切取阴道组织后，缝合创口，逐层关腹。用无菌生理盐水、双抗液多次冲洗取下的阴道组织，之后将标本放入预先备好的PBS+双抗液(青霉素+链霉素)中，送往实验室。在超净工作台上将阴道组织块浸泡于0.05%洗必泰中5 min，再用DMEM湿润组织块，用刀片和眼科手术器械仔细分离去除黏膜上皮层和浆膜结缔组织层，然后将分离好的平滑肌组织平铺修剪形成I mm3的小块，并尽可能使组织块边缘整齐、光滑。组织块+酶消化法进行原代培养。
[0022]原代培养:将修剪好的组织块用0.1%胶原酶IV在37°C培养箱中消化0.5?1.0 h，至组织块边缘变毛时中止消化，然后将消化好的组织块接种于培养皿上，间隔约5 mm,37°(:恒温培养箱中静置培养3.0?4.0 h，待组织块贴壁牢固后，再补加含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，37 °C恒温静置培养3.0-4.0 d，待细胞游出后换液，每周换液两三次以维持细胞生长。倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。
[0023]兔阴道平滑肌细胞在SIS上种植:待细胞生长达80%融合时即进行传代，弃去旧培养基，向培养瓶加入混合消化液(0.25%胰酶:0.02%EDTA=1:1),37 °C孵育约5 min，观察到细胞间隙增大、细胞呈圆形、部分悬浮于消化液中时向培养皿内加入体积分数为0.8%的胎牛血清终止消化，将细胞悬液离心(I 000 r/min，离心半径13 cm)5 min，离心收集细胞，培养基再悬浮，以5.0 X 106/cm2接种到SIS基质内面上，37 °C、体积分数为5%C02孵箱内静置培养。培养基仍是含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，每隔2 d更换培养基一次。
[0024]倒置显微镜下观察接种于猪SIS的兔阴道平滑肌细胞生长情况:分别取接种I，2，3，4周后的SIS-细胞复合体，用0.01%磷酸盐缓冲液漂洗3次，放入2.5%戊二醛溶液内固定，连同固定液一并送镜检。
[0025]病理学观察:分别取I，2，3，4周SIS-细胞复合体标本常规体积分数为10%甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片后，行苏木精-伊红染色。
[0026]抗兔a-肌动蛋白抗体进行免疫组化染色检测a_Actin(SABC法):分别取I，2，3，4周SIS-细胞复合体标本常规体积分数为10%甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片后，行免疫组化染色。
[0027]主要观察指标:①SIS组织学检查。②阴道平滑肌细胞体外生长特征。③猪SIS上的兔阴道平滑肌细胞生长情况。④免疫组织化学检测平滑肌a_肌动蛋白表达。
[0028]SIS组织学检查经物理和化学方法处理后SIS，大体看呈白色半透明状。光镜下，制备的基质材料由许多排列规则而紧密连接成网状的胶原纤维组成;苏木精-伊红染色呈红色，内部没有发现细胞碎片。
[0029]阴道平滑肌细胞体外生长特征倒置显微镜下，原代细胞逐渐贴壁、生长，细胞大小不等、形状多样，有梭形、长条形、带状三角形等，细胞核呈卵圆形或圆形，核中有I?3个大小不一、深色的核仁。随着细胞的扩增，细胞生长范围不断扩大，至16?20 d细胞覆盖培养瓶底，细胞生长密集，呈梭型或长梭型，胞突起相互交错，彼此融合，部分区域细胞多层重叠，部分区域细胞单层，高低起伏，呈平滑肌细胞培养典型的“峰-谷”状生长结构特征。
[0030]猪SIS上的兔阴道平滑肌细胞生长情况
倒置显微镜下，接种到SIS上I周后，有少数细胞开始贴附SIS上，形态类圆形，长形，随时间推移，贴附细胞数目增多，部分细胞伸展成梭形。SIS-细胞复合体在培养皿中培养时，可观察到长梭状细胞自复合物周围萌出