最小抑菌浓度(MIC)测定
[0077]采用试管二倍稀释法。将有抑菌效果的药液用生理盐水倍比稀释，依次配成浓度 为2.2中的9个浓度的肉汤培养基试管，向各管中添加菌悬液50μ1，将各管置于37°C条件下 恒温培养。18~24h后，观察记录各试管是否长菌及生长情况。每一浓度梯度做三组平行试 验，肉眼观察不长菌的最低浓度为该药物的最低抑菌浓度。
[0078]最小杀菌浓度(MBC)测定
[0079]先测出试验菌的MIC，根据其结果，再依次将未见细菌生长各管培养液分别吸取50 μL，仔细涂布于无菌新鲜的琼脂平板中，置37°c培养箱培养24h后观察结果。平皿上菌落数 小于5个的最小稀释度的药物浓度即为MBC。
[0080]结果与分析
[0081 ]解热实验结果
[0082] 实验结果见表1。表1结果显示给药后体温均有所下降，与空白对照组相比，阳性对 照组解热作用极显著(P<〇.01);清肺止咳散中、低剂量组解热作用显著(P<〇.05)，高剂量 组解热作用不显著（P>〇. 05)。而与阿司匹林组比较，试验药物解热作用差异不显著（P> 0.05)，各组4h解热趋势见图1。
[0083]表Γ清肺止咳散"对脱脂牛奶致热家兔的解热作用
[0086] 注：*阳性组与空白组比较P < 0.01;林试验药物中、低剂量组与空白组比较P < 0.05; 试验药物高剂量组与空白组比较P>0.05; @试验组与阳性组比较P>0.05。
[0087]体外抑菌实验结果 [0088]药物敏感性测定结果
[0089] "清肺抗炎止咳散"三种浓度药液均有抑菌活性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌都 有一定的抑菌效果，结果见表2。
[0090] 表2"清肺抗炎止咳散"对供试菌的抑菌圈平均直径(单位:_)
[0092] 最小抑菌浓度(MIC)测定结果
[0093] 培养结束后，肉眼可见高浓度药物试管、阳性对照试管及空白对照试管均保持原 有颜色，未见变化。低浓度药物试管内有变色现象，出现白色浑浊物。阴性对照试管内液体 变浑浊，产生白色沉淀。说明实验操作得当结果可信。肉眼观察结果见表3,可判断"清肺抗 炎止咳散"对金葡球菌、大肠杆菌的MIC分别为80mg/ml和80mg/ml。
[0094] 表3"清肺抗炎止咳散"最小抑菌浓度(MIC)
[0096]注："一"无菌生长，"+"菌体较少，"++"菌体较多，"+++"菌体多。
[0097]最小杀菌浓度(MBC)测定结果
[0098]将未见细菌生长的两组1-5号管培养液分别吸取涂布于无菌新鲜的琼脂平板中， 置37°C培养箱培养24h后观察到的结果见表4。由表4可知，"清肺抗炎止咳散"对金黄色葡萄 球菌和大肠杆菌的MBC分别是160mg/ml和640mg/ml。杀菌活性为：金黄色葡萄球菌〉大肠杆 菌。
[0099]表4"清肺抗炎止咳散"最小杀菌浓度(MBC)
[0101] 注："一"无菌生长，"+"菌体较少，"++"菌体较多讨论
[0102] "清肺抗炎止咳散"的解热作用
[0103] 中医理论认为肺与大肠之间借助经络的沟通，病理生理活动相互影响，形成"肺与 大肠相表里"的关系。肺为华盖，居上焦，为吸入清气、呼出浊气的上窍;大肠居下焦，为传送 糟柏、排出浊气的下窍，两者表里相关，密切配合，共同发挥升清降浊的作用。在"清肺抗炎 止咳散"的四味药中，大黄苦寒，入脾、胃、大肠、心包、肝经，主攻积滞，有清湿热，泻火，凉 血，祛瘀，解毒功能，是一味传统中药，因通过泻热通肠改善呼吸功能而为君药。金荞麦具有 清热解毒、健脾利湿、下气消积之功效;积雪草具有清热利湿，解毒消肿之功效。二者均能清 热解毒，助大黄清除肺热，为臣药。而桔梗归太阴肺经，能宣肺祛痰，还能开提肺气，疏通胃 肠，为载药上行之主药，使各药效能到达肺部，为佐使药。诸药合用，以祛邪为主，兼顾正气， 以达清肺止咳之功效。
[0104] 现代药理研究显示，大黄能明显抑制内毒素诱生的肺泡巨噬细胞分泌肿瘤坏死因 子和白细胞介素-1、白细胞介素-2,从而减轻对肺脏的损害，具有明显的解热作用。现代药 理研究表明其还具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、镇痛解热等多种功效。目前研究认为 其发挥药效的活性成分主要是黄酮类成分，但更多成分的药用机理还有待进一步研究。植 物化学研究发现积雪草的全草主要化学成分为β-谷留醇，胡萝卜苷、积雪草酸、香草酸和积 雪草苷。积雪草苷可能通过抑制C0X-2/PGE2系统，降低致热介质PGE 2含量，抑制C0X-2蛋白表 达而起到预防发热作用。桔梗皂苷也有显著的解热作用。
[0105] "清肺抗炎止咳散"的体外抑菌作用
[0106] 本试验选用常见致病菌作为研究对象。金黄色葡萄球菌是动物和人类的一种重要 病原菌，可引起许多严重感染，传统的防治方法是使用抗生素类药物。但随着医药卫生事业 的发展，抗生素、合成抗菌药物大量使用和滥用造成，由此带来的药物残留、抗药性以及动 物性食品安全问题日益尖锐。利用中草药防治流行疾病、解决抗生素残留和抗药性问题已 成为中药药理学研究热点之一。抗菌药物对某种细菌敏感还是耐药，决定于抗菌药物的作 用机制和细菌的基因型，耐药基因的检出可以直接预告耐药，但由于监测耐药的分子生物 学方法相对于体外药敏试验更需要复杂的设备和仪器。细菌耐药涉及多种因素，其机制尚 未完全阐明，因此，目前临床微生物实验室主要还是通过体外药敏试验来预测细菌耐药。体 外抑菌试验方法有管碟法、纸片法、打孔法等。但打孔法因中药液黏稠度大，以至滴在孔内 的药液难以扩散。纸片法简单易行，但纸片所吸附的药量较少，且吸附到纸片上的药液不易 扩散，会影响药物的抑菌效果。而管碟法取量精确，试验结果较为准确，故本试验采用此方 法进彳T抑菌试验。
[0107] 植物是抑菌活性物质的天然宝库，Grange和Ahmed报道约有2400种植物具有防治 有害生物的活性。组织学研究显示，大黄能保护小肠黏膜上皮细胞的完整性，促进小肠绒毛 内杯状细胞的大量增生，后者分泌的碱性黏液能加固肠黏膜屏障，抑制肠道细菌移位。金荞 麦对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、苏云芽孢杆菌、卡拉双球菌都有明显的抑 菌作用。积雪草苷体外具有抗菌作用，尤其对各种耐药细菌有较强抗菌活性，桔梗皂苷也有 一定的抑菌作用。本试验已初步确定"清肺抗炎止咳散"对以上两种细菌均有抑制作用，但 由于"清肺抗炎止咳散"水煎液具有一定黄褐色，故试管二倍稀释法测定其最小抑菌浓度存 在一定的误差。
[0108] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制;尽管 参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换； 而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和 范围。
【主权项】
1. 一种清肺抗炎止咳散，其特征在于它是由积雪草、桔梗、牛耳大黄和金荞麦四味中 药组成，其中，各成分的重量百分比为： 积雪草 26.3%(重量） 桔梗 15.8%(重量） 牛耳大黄 31.6% (重量） 金荞麦 26.3% (重量） 各成分的重量百分比的总和为100%(重量）。2. -种如权利要求1所述的清肺抗炎止咳散的制备方法，其特征在于具体包含具体包 含以下步骤： (1) 、分别取积雪草25g、金荞麦25g、牛耳大黄30g、桔梗15g，置于大烧杯内，加入600mL 的冷蒸馏水浸泡1.5小时； (2) 、将浸泡好的中药连同浸泡中药的蒸馏水一起煎煮，煮沸30min，进行第一次过滤， 制得第一次药液； (3) 、在过滤后的药渣中加入400ml的冷蒸馏水进行继续煎煮，煮沸20min，然后减压进 行第二次过滤，制得第二次药液； (4 )、将第一次药液和第二次药液进行合并，制得第三次药液； (5)、将三次药液加热分别浓缩成相当于原药材2. Og/mL、1.0g/mL、0.5g/mL高中低三种 浓度药液，并与4°C冰箱中保存备用。
【专利摘要】本发明公开了一种清肺抗炎止咳散，它是由积雪草、桔梗、牛耳大黄和金荞麦四味中药组成，其中，各成分的重量百分比为：积雪草26.3%(重量)；桔梗15.8%(重量)；牛耳大黄31.6%(重量)；金荞麦26.3%(重量)。本发明能清热利湿，解毒消肿，宣肺利咽，宣肺化痰，排脓，祛痰镇咳，清热凉血，化痰止咳，能清热解毒，清肺排脓，活血化瘀，在临床治疗肺热咳嗽证，具有较好的疗效，且对肺部疾病引起的疼痛、发热、咳嗽等症状有显著疗效，并且原料药来源广、价格便宜，利于推广。
【IPC分类】A61P11/14, A61K36/70, A61P29/00, A61K9/14
【公开号】CN105687342
【申请号】CN201610152664
【发明人】叶刚, 李英伦, 何晓利, 殷中琼, 赵玲, 施飞, 林居纯, 吕程, 景波, 王讯
【申请人】四川农业大学
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年3月17日