槐角苷抗布氏田鼠生育的新方法
【专利摘要】以槐角苷为活性成分的抗雌性布氏田鼠生育灭鼠剂，属于生物防治技术领域。布氏田鼠主要栖息于植被退化的草场上，种群繁殖力强，各年度与季节间的数量变动幅度很大,繁殖速度快，对草原植被的破坏力很强，是畜牧业的大敌，是内蒙古草原主要鼠害之一，鼠害问题不仅严重破坏了生态环境，而且威胁着人类的健康。长久以来，人们采用多种方法对其种群数量加以控制，其中运用抗生育技术对害鼠种群数量进行控制是近些年发展起来的一项新技术。本发明涉及一种以槐角苷为活性成分的雌性不育灭鼠剂用于控制布氏田鼠繁殖。相较于传统的生态灭鼠法及化学毒饵法，抗生育技术具有作用时间长、控制效果明显、环境毒副作用小等优点，能更有效地抑制害鼠种群的超补偿性效应。本发明若能应用于农林牧业生产，将能有效控制害鼠种群数量，具有广阔的经济效益。
【专利说明】
槐角苷抗布氏田鼠生育的新方法
技术领域
[0001]本发明涉及用于控制害鼠布氏田鼠的抗生育灭鼠剂，具体的说是涉及一种以槐角苷为活性成分的雌性不育剂用于控制害鼠布氏田鼠繁殖，主要涉及槐角苷影响布氏田鼠胚胎着床数目来控制其繁殖的新方法。【背景技术】
[0002]因草原鼠害损失的牧草量占15%-20%，重灾年份则会高达44%。草原鼠害的发生-草场土壤肥力下降，水份大量流失，草地的生产力降低，造成杂草滋生及草地沙漠化，环境急剧恶化，呈现逐年扩增的趋势。
[0003]布氏田鼠分布于中国内蒙古中东部地区，辽宁等地，主要栖息于植被退化的草场上，种群繁殖力强，各年度与季节间的数量变动幅度很大，繁殖速度快，对草原植被的破坏力很强，是畜牧业的大敌，是内蒙古草原主要鼠害之一。
[0004]目前，草原鼠害防治仍主要使用化学灭鼠剂来防治害鼠。而化学灭鼠剂具有成二次中毒，产生抗药、耐药以及环境污染等一系列严重问题，使得传统的鼠害防治方法已经不能满足现代农业、畜牧业发展的要求。生物源性抗生育剂因为其具备特异性高，资源丰富、 无环境污染，对生态环境影响小且能有效控制害鼠等优点在现代农业、畜牧业的害鼠生物防治上展现出了广阔的应用前景。
[0005]槐角苷主要来源于豆科植物槐树的果实(槐角)，槐角中异黄酮及其苷类成分非常丰富，槐角苷作为槐角中最主要的异黄酮成分之一被广大科学工作者进行了大量的研究，动物实验阐明了槐角苷呈现出雌激素样活性，具有显著的抗生育作用。
[0006]由于前期实验室探究了槐角苷对ICR小白鼠的抗生育效果，结果显示该药物可明显降低受孕ICR小鼠的子宫胚胎着床数量，即大大降低小白鼠的受孕率，具有相当明显的抗生育效果。有了前期的进展，就为我们下一步的开展提供了实验支持，我们欲探究植物源性异黄酮成分槐角苷对草原一大害鼠布氏田鼠的抗生育效果，力求为草原害鼠生育率的控制提供一种生态、高效的新方法，希望为我国草原鼠害的防治提供一种了新的方法，这对我国农林牧业鼠害的防治具有一定的生态意义与经济意义。
[0007]本发现以槐角中其中一种异黄酮成分槐角苷为药物材料，对草原害鼠布氏田鼠的进行急性毒性实验，再依据急性毒性实验结果，对布氏田鼠的抗生育效果进行探究，发现该药物确实能够通过降低布氏田鼠的胚胎着床数目而具有明显的抗生育作用，降低布氏田鼠的生育率，进一步的实验为槐角苷对布氏田鼠的抗生育作用效果提供了充分的证据，该发现为将槐角苷开发成植物源性不育剂提供足够的理论支持，也为草原鼠害的防治提供了一种新方法。
【发明内容】
[0008]本发现主要是发现了一种新药物对布氏田鼠具有显著的抗生育效果，旨在对草原害鼠布氏田鼠的繁殖率、数量进行控制，为其防治提供一种新方法。
[0009]本发现通过以下技术方案实现。[〇〇1〇]本发现是用槐角中的异黄酮成分槐角苷对怀孕布氏田鼠进行喂药处理，结果发现槐角苷能够明显降低布氏田鼠的胚胎着床数目，从而降低害鼠布氏田鼠的繁殖率，降低其数量。然后利用组织学的研究方法对槐角苷对布氏田鼠的抗生育效果进行进一步探讨，对其抗生育的具体机制进行初步探索。槐角苷是一种中药成分，不会造成环境破坏等一系列问题，为鼠害的防控提供了一种新方法。
[0011]1药物材料及实验动物实验用槐角苷，纯度98%，HPLC，批号:QY-HJG201210040，购自西安清乐生物科技有限公司。实验用布氏田鼠捕捉自内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市东乌珠穆沁旗，皆为幼鼠，以鼠笼盒雌雄分开喂养于内蒙古自治区锡林郭勒盟锡林浩特市毛登牧场中国科学院动物研究所草原动物生态研究站实验室内至性成熟，自然光照，室温，通风良好，供以充足的鼠粮及水，选择健康，达到性成熟的雄鼠及无怀孕迹象的雌鼠备用。
[0012]2急性毒性实验方法预实验:参照文献，槐角苷对小鼠的最大致死浓度为l〇〇〇mg/kg左右，依据此具体实验方法如下，将实验用布氏田鼠分为4组，每组4只，雌雄各半，1个空白组和3个染毒剂量组，于实验室内自然光照，室温，通风良好，供以充足的鼠粮及水的条件下喂养一周，观察各组实验用布氏田鼠有无异常，如无异常，将实验用槐角苷用0.5%羧甲基纤维素钠配置成不同浓度槐角苷悬液，接着按照空白对照组(0 mg/kg同体积的0.5%羧甲基纤维素钠)、800mg/kg、 400011^/1^、2000011^/1^/(^7的给药方式进行给药，将实验用槐角苷用0.5%羧甲基纤维素钠配置成不同浓度槐角苷悬液，于某天早上9点对实验用布氏田鼠进行灌胃，空白对照组灌以同体积的〇.5%羧甲基纤维素钠悬液，自灌胃时刻其的7天内，观察实验用布氏田鼠的死亡情况，统计数据。依据预实验所得到的实验数据，将备用布氏田鼠分为分为6组，每组6只，雌雄各半，分别为1个空白对照组和5个染毒剂量组，将实验用槐角苷用0.5%羧甲基纤维素钠配置成不同浓度槐角苷悬液，分别为 〇mg/kg、4000mg/kg、6000mg/kg、9000mg/kg、13500mg/kg、 20000mg/kg，空白对照组以同体积的0.5%羧甲基纤维素钠代替，将各组老鼠于实验室内自然光照，室温，通风良好，供以充足的鼠粮及水的条件下喂养一周，观察各组实验用布氏田鼠有无异常，如无异常，于一周后的第一天早上9点对各组布氏田鼠按照预先设定的槐角苷浓度进行灌胃，自灌胃时刻起的7天内，观察实验用布氏田鼠的死亡情况，统计数据，用改良寇氏法公式对槐角苷对布氏田鼠的LD50进行计算，最终得到其LD50大约为10715mg/kg。 [〇〇13]3抗生育效果实验方法依据槐角苷对布氏田鼠的急性毒性实验所得到的数据，按照等比数列的方法设置各个槐角苷给药浓度，将实验备用的布氏田鼠雌雄分开进行一周喂养，观察布氏田鼠采食和饮水有无异常，然后按照雌雄2:1的比例进行合笼，次日早上进行妊娠检查(阴栓检查法)根据检查结果确认已受孕为妊娠第一天(D1)，将受孕田鼠分为5组，每组10只，分别为三个槐角苷染毒实验组(用0.5%羧甲基纤维素钠将槐角苷配置成预先设计的三个浓度剂量)，分别为，一个阳性对照组(用0.5%羧甲基纤维素钠将炔雌醚配置成预先设计浓度剂量)、一个空白对照组(以同样的方法给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠)，灌胃剂量为0.2ml/10g，自 D1起分别对各剂量组于每天早上9:00进行经口灌胃给药，连续给药7天(D7)，第10天(D10) 解剖检验，统计各组胚胎数量、称量子宫及各脏器的重量，计算出各组胚胎平均数量并用SPSS软件对数据进行统计学分析，统计实验组与各对照组的胚胎着床是否有统计学差异， 以P〈0.05为有统计学意义。与空白未经药物处理的布氏田鼠组相比，经槐角苷灌胃处理的布氏田鼠子宫胚胎数目随著槐角苷浓度的增大而显著降低，且差异性显著，结果表明，槐角苷对布氏田鼠具有显著的抗生育作用效果，即可以达到降低其繁殖率，降低种群数量。
[0014]4组织保存将实验解剖所得到的布氏田鼠子宫组织部分保存于动物组织RNA保护液，部分保存于组织固定液(4%多聚甲醛)中带回实验室，再将其转移到冰箱中保存备用，进行下一步实验探究。
[0015]5 HE染色实验分析用HE染色实验对布氏田鼠的子宫组织进行病理组织学组织形态观察。HE结果表明与空白组的布氏田鼠子宫相比，经过槐角苷药物处理的布氏田鼠的子宫结构中子宫内膜腔上皮的厚度明显，腺体增多，间质细胞明显减少，子宫腔上皮有损伤，有明显的组织病理学增生， 说明槐角苷药物的处理对布氏田鼠的子宫组织造成了伤害。[0〇16]6扫描电子显微镜(SEM)用SEM扫描电镜技术对布氏田鼠子宫组织子宫内膜表面进行观察，主要是对子宫内膜表面微绒毛及胞饮突进行观察分析。SEM结果表明，跟空白组相比较，药物处理组的子宫内膜胞饮突大量减少、排列也是相当的混乱，散乱的分布在子宫内膜表面上，子宫内膜容受性是指内膜对胚胎的接受能力，子宫内膜上的胞饮突异常，进而导致胚胎着床失败。
[0017]7免疫组织化学实验分析用免疫组织化学染色实验技术对布氏田鼠子宫中相关蛋白的表达进行分析，相关的蛋白主要是胚胎着床过程中扮演至关重要角色的蛋白，如ERa，PR等。IHC结果表明，与正常状态下怀孕布氏田鼠相比，经槐角苷处理组布氏田鼠子宫的ERa、PR、MMP2表达水平都显著降低，与空白组相比较，槐角苷处理组的E-caderin在子宫中的表达显著增加，总之，子宫中在胚胎着床过程中扮演重要角色的蛋白其表达水平相较于正常状态下的布氏田鼠子宫都出现了异常表达，其蛋白出现异常表达，其胚胎着床过程也就不能正常运作了，从而导致了胚胎着床失败。
[0018]本发现与现有技术相比具有以下优点。
[0019]1槐角苷属于植物源性中药材，其健康、生态、来源广泛，槐角苷的使用不会对环境造成污染、二次中毒等相关问题。
[0020]2草原鼠害是对草原在不断开发利用过程中逐渐出现的严重的生态学问题，布氏田鼠是草原上典型的一大害鼠，其对草原的破坏力相当大的，也给农业带来了很大的麻烦， 而槐角苷能够通过影响布氏田鼠的胚胎着床过程从而影响其生育过程，这是一个可观的发现，也是一个非常有意义的发现，为槐角苷的开发利提供了理论证据，也为草原鼠害的防治提供了一种新方法。【附图说明】
[0021]图1图2槐角苷对布氏田鼠胚胎着床数量的影响图1槐角苷对布氏田鼠胚胎着床的影响;A:空白对照组布氏田鼠胚胎着床情况;B、C、D: 槐角苷药物处理组布氏田鼠胚胎着床情况;E:经过药物槐角苷处理过的未怀孕布氏田鼠的子宫角肿大(雌激素样所用);F:经过药物槐角苷处理过的怀孕布氏田鼠子宫的胚胎受损伤情况图3图4布氏田鼠子宫内膜结构的HE染色图图3槐角苷对布氏田鼠子宫内膜结构的影响;A子宫腔;B:子宫腔上皮;C:腺体细胞;D: 间质细胞;E:槐角苷药物处理组的布氏田鼠子宫内膜结构图(200 X );F:槐角苷药物处理组的布氏田鼠子宫内膜结构图(400 X )图5图6图7图8布氏田鼠子宫内相关蛋白表达水平的IHC图图9布氏田鼠子宫内膜表面的SEM图
[0022]实例 1:选用纯度为98%的槐角苷为不育剂药物，以受孕第一天的雌性布氏田鼠小鼠为研究对象，以450mg/kg/day的剂量连续灌胃给药7天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比明显减少。
[0023]实例2:选用纯度为98%的槐角苷为不育剂药物，以受孕第一天的雌性布氏田鼠为研究对象，以 900mg/kg/day的剂量连续灌胃给药7天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比明显减少。
[0024]实例3:选用纯度为98%的槐角苷为不育剂药物，以受孕第一天的雌性布氏田鼠为研究对象，以 1800mg/kg/day的剂量连续灌胃给药7天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比显著减少， 且具有显著的统计学意义(P〈〇.05)。病理学研究发现，槐角苷处理后子宫内膜病理学增生、 厚度增加，子宫内膜结构发生改变，子宫内影响胚胎着床的关键受体ERa的表达水平显著降低(P〈0.05)，PR的表达水平显著降低(P〈0.05)。实验结果为槐角苷对雌性布氏田鼠具有显著的抗生育效果。
【主权项】
1.一种抗生育灭鼠剂，其特征在于，所述抗生育灭鼠剂是以槐角苷作为活性组分的抗 生育剂。2.权利要求1所述的抗生育灭鼠剂，其特征在于，所述鼠类为害鼠布氏田鼠。3.权利要求1或2中所述的抗生育灭鼠剂，其特征在于，所述槐角苷主要来源于豆科植 物槐树的果实槐角，尼泊尔黄花木茎，漆树科植物宽叶尚乳香叶等。4.一种灭鼠方法，其特征在于，通过使用权利要求1-3任一项所述的抗生育灭鼠剂，控 制害鼠布氏田鼠的生育及其种群的数量。5.权利要求4所述的方法，包括在布氏田鼠繁殖开始或繁殖期内，每鼠每天按照450 mg/kg-2000mg/kg体重进行口服/灌胃给药的方法，连续给药6-7天，即可控制雌性鼠类生育 及其数量。
【文档编号】A61K31/7048GK105943546SQ201610310073
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月12日
【发明人】张 杰, 张兴利, 谢晨文, 丁仁芳, 刘筱雪
【申请人】四川大学