以羊栖菜提取物作为有效成分含有的紫外线隔离用组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种以羊栖菜(S.fusiforme)提取物或针对上述羊栖菜提取物以色谱法进行分离的含褐藻多酚的活性组分作为有效成分含有的紫外线隔离用组合物。
【专利说明】
以羊栖菜提取物作为有效成分含有的紫外线隔离用组合物
[0001] 优先权
[0002] 本发明基于申请日为2015年4月22日的韩国专利申请第10-2015-0056550号而 主张优先权。上述专利申请文件引入本文件作为参考。
技术领域
[0003] 本发明涉及一种紫外线隔离用组合物，更为详细地涉及一种以羊栖菜提取物作为 有效成分含有的紫外线隔离用组合物。
【背景技术】
[0004] 皮肤老化（skin aging)大致划分为内在老化（intrinsic aging)和外在老化 (exogenic aging)，前者是表示随着年龄的增长而导致身体功能下降的老化，后者则是在 暴露于持续性紫外线（Ultraviolt，UV)等外部刺激时所引起的老化。紫外线是导致光老 化的典型原因之一，其根据波长的长度分为UV-A(320~400nm)、UV-B(280~320nm)及 UV-C(100~280nm)。UV-C的大部分由臭氧层吸收，到达地表的量甚少，而UV-A属于波长相 对长的紫外线，作用于皮肤免疫系统，可引发长期性皮肤损伤，也有报告称，当暴露时间变 长时，会导致发生皮肤癌。UV-B虽然只到达皮肤的表皮层，但是，在长时间暴露其中的情况 下，也会诱发红斑、水泡、皮肤皲裂、皱纹及甚至皮肤癌。为了有效隔离这种紫外线，多使用 无机紫外线散射剂或有机紫外线吸收剂，但也会堵塞毛孔，导致各种副作用的发生，而且虽 然可以吸收紫外线来保护皮肤，但也会成为过敏致使接触性皮肤炎的成因。
[0005] 如上所述，根据不同波长，皮肤的渗透水平不同，波长长的UVA可深入真皮，从而 出现严重的真皮反应，波长相对短的UVB成为日光烧伤的主因，且促进色素沉淀。UVB具有 强于UBA的能量，容易引起红斑反应和色素沉淀，但是，考虑到长期积累UVA时的日光损伤， 不仅是UVB，UVA对皮肤的影响也不可忽视。因此，为了隔离紫外线，应同时考虑UBB和UBA。
[0006] 作为典型海藻类之一的羊栖菜（Sargassum fusiforme)分布于韩国和日本等东亚 地区，羊栖菜在韩国被视作食用，尤其，在日本，羊栖菜是需求量大的褐藻类。通过针对羊栖 菜的先行研究，已确认其具有高抗氧化效能，并且证明其通过抗炎症反应的特应性症状缓 解效果，皮肤改善有关潜力得到认可。
[0007] 韩国授权专利第1475505号公开了以羊栖菜提取物作为有效成分含有的美白用 化妆材料组合物。
【发明内容】
[0008] 解决的技术问题
[0009] 但是，上述先行技术仅仅是关于以羊栖菜提取物作为有效成分含有的功能性化妆 品材料，并未涉及利用羊栖菜提取物的紫外线隔离剂有关研究。
[0010] 本发明是为了解决包含如上所述的存在问题的各种存在问题而提出的，目的在于 提供一种以羊栖菜提取物作为有效成分含有的紫外线隔离用组合物。但是，这种课题仅仅 是示例性的，本发明的范围并不受此限定。
[0011] 技术方案
[0012] 根据本发明的一观点，提供羊栖菜（S. fusiforme)提取物或针对上述羊栖菜提取 物以色谱法进行分离的含褐藻多酚的活性组分在紫外线隔离用组合物制备中的用途。
[0013] 根据本发明的再一观点，提供羊栖菜（S. fusiforme)提取物或针对上述羊栖菜提 取物以色谱法进行分离的含褐藻多酚的活性组分在皮肤老化改善用化妆材料组合物制备 中的用途。
[0014] 根据本发明的另一观点，提供从动物的皮肤中以色谱法分离具有紫外线隔离或皮 肤老化改善功能的羊栖菜（s. fusiforme)提取物或上述羊栖菜提取物的含褐藻多酸的活 性组分。
[0015] 发明效果
[0016] 根据如上所述构成的本发明的一实施例，利用由羊栖菜提取物制备的紫外线隔离 用组合物可有效实现紫外线隔离效果。当然，本发明的范围并不受到这种效果的限定。
【附图说明】
[0017] 图1为表示根据本发明的一实施例从采集自大海的羊栖菜（Sargassum fusiforme)提取褐藻多酸提取物（phlorotannins extract, PE)的工序的顺序图。
[0018] 图2为表示根据本发明的一实施例测定从干燥的羊栖菜100g获取的褐藻多酚的 总含量的图表。
[0019] 图3为表示根据本发明的一实施例，为了分离和提炼含在褐藻多酚提取物内的褐 藻多酸而执行HPLC-MS分析，从而识别二苯醚（diphenyl ether)的图表。
[0020] 图4为表示根据本发明的一实施例，为了分离和提炼含在褐藻多酚提取物内的褐 藻多酸而执行HPLC-MS分析，从而识别咲喃昆布醇A(phlorofucofuroeckol A)的图表。
[0021] 图5为表示根据本发明的一实施例，为了确认褐藻多酚提取物（PE)的抗氧化效能 而执行DPPH自由基清除效能分析（DPPH radical scavenging assay)的图表。
[0022] 图6为表示根据本发明的一实施例的羊栖菜提取物的一氧化氮（NO)清除能的测 定结果的图表。
[0023] 图7为根据本发明的一实施例，为了确认褐藻多酚提取物（PE)的抗氧化效能而分 析借助羟基（hydroxyl radical)的蛋白质分解抑制效能的凝胶图片。
[0024] 图8为根据本发明的一实施例，以来自人成纤维细胞（human fibroblast)的 (XD-986sk细胞株作为对象而测定借助UV-B的一氧化氮（NO)发生条件的图表。
[0025] 图9为确认根据本发明的一实施例通过PE处理来有效隔离UV-B，能否调节N0的 发生的图表。
[0026] 图10为根据本发明的一实施例向细胞照射UV-B后通过测定所生成的 LDH (lactate dehydrogenase)的量来比较相对毒性水平的图表。
[0027] 图11为根据本发明的一实施例向因 UV-B而诱发毒性的细胞进行PE处理后观察 降低细胞毒性效能的图表。
[0028] 图12为根据本发明的一实施例测定向细胞照射UV-B (A)及UV-A (B)，从而诱导直 接性细胞凋亡（apoptosis)的时间的图片。
[0029] 图13为根据本发明的一实施例，在照射借助细胞的UV-B㈧或UV-A⑶时，测定 根据PE处理的细胞保护效果的图片。
[0030] 图14为根据本发明的一实施例测定照射UV-B的同时进行PE10 μ g/mL以上处理 时MMP-1基因表达程度的图表。
[0031] 图15为根据本发明的一实施例测定照射UV-A的同时进行PE10 μ g/mL以上处理 时MMP-l(A)及MMP-9⑶基因表达程度的图表。
[0032] 图16为根据本发明的一实施例为了确认借助PE的MMP-1表达机制的调节与否而 执行蛋白质印迹法的凝胶图片。
【具体实施方式】
[0033] 术语的定义：
[0034] 在本文件中所使用的术语"羊栖菜（Sargassum fusiforme) "是褐藻类植物 (phaeophyta)门马尾藻科的海藻，属于生长在韩国西海岸、南海岸及济州岛的天然资源植 物，含有大量的膳食纤维丰富且具有血液凝固作用及免疫增强作用等功能的中性多糖类海 带多糖（laminaran)和含硫酸性多糖类褐藻糖胶（fucoidan)。
[0035] 在本文件中所使用的术语"褐藻多酚（phlorotannins) "是由褐藻类生成的多酚性 物质，属于间苯三酸（phloroglucinol)诱导物质。褐藻类的甘苔、大黄、马尾藻及铁钉菜等 中含有大量的褐藻多酚成分，报告称这种成分具有抗氧化效果、抗炎效果、美白效果、抗高 血压效果及抗糖尿效果等优秀的效果。
[0036] 在本文件中所使用的术语 "DPPH(1, l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl， Sigma_Aldrich，M0, USA) "为化学上稳定的水溶性自由基（free radical)，它是在517nm中 表现出特征性光吸收的紫色化合物。DPPH在酒精等有机溶剂中非常稳定，遇具有抗氧化活 性的物质，则释放电子，自由基（DPPH)被消灭，从初始溶液的紫色变成黄色，肉眼可以轻松 观察到氧化活性，成为应用于抗氧化活性实验的代表性物质。
[0037] 在本文件中所使用的术语"N0(nitric oxide)或氧化氮或一氧化氮"是由精氨酸 (L-arginine)借助氧化氮合成酶（nitric oxide synthase)而生成的物质，在身体内以各 种生理调节因子发挥作用，在皮肤中，当暴露于UV时会增加，而在过度合成的情况下，会引 发红斑等。
[0038] 在本文件中所使用的术语"LDH(lactate dehydrogenase) "是利用NADH对乳酸进 行脱氢而制备成丙酮酸的细胞质酶，通常情况下UV会引起细胞毒性，诱发毒性的细胞生成 Lactate dehydrogenase (LDH)，通过测定这种毒性，可以比较相对毒性水平，并用于细胞毒 性分析（Lactate dehydrogenase (LDH) release assay)。
【发明内容】
[0039]
[0040] 根据本发明的一观点，提供羊栖菜（S. fusiforme)提取物或针对上述羊栖菜提取 物以色谱法进行分离的含褐藻多酚的活性组分在紫外线隔离用组合物制备中的用途。
[0041] 在上述用途中，上述羊栖菜提取物能够以C1至C4的低元醇、乙醇或它们的混合溶 剂进行提取而制备。
[0042] 上述紫外线可以是UV-A、UV-B或UV-C，上述羊栖菜提取物可占组合物总重量的 0. 1至50重量％。
[0043] 上述羊栖菜提取物可以是选自由i )将羊栖菜浸渍于η-己烷并去除脂质，以丙酮 提取的丙酮提取物；ii )针对上述丙酮提取物以碳数为1至4的低元醇或其水溶液去除盐 的酒精提取物；以及iii)在以上述酒精提取物进行提取的过程中，针对残留的残渣利用甲 苯（toluene)来去除色素，并以丙酮重新提取的丙酮提取物组成的组中的一种或两种以上 的混合物。
[0044] 在上述用途中，上述褐藻多酸可以是二苯醚（diphenyl ether)或咲喃昆布醇 A(phlorofucofuroeckolA) 〇
[0045] 根据本发明的再一观点，提供羊栖菜（S. fusiforme)提取物或针对上述羊栖菜提 取物以色谱法进行分离的含褐藻多酚的活性组分在皮肤老化改善用化妆材料组合物制备 中的用途。
[0046] 上述羊栖菜提取物可以是选自由i )将羊栖菜浸渍于η-己烷并去除脂质，以丙酮 提取的丙酮提取物；? )针对上述丙酮提取物以碳数为1至4的低元醇或其水溶液去除盐 的酒精提取物；以及iii)在以上述酒精提取物进行提取的过程中，针对残留的残渣利用甲 苯（toluene)来去除色素，并以丙酮重新提取的丙酮提取物组成的组中的一种或两种以上 的混合物。
[0047] 根据本发明的另一观点，提供从动物的皮肤中以色谱法分离具有紫外线隔离或皮 肤老化改善功能的羊栖菜（S. fusiforme)提取物或上述羊栖菜提取物的含褐藻多酸的活 性组分。
[0048] 羊栖菜提取物可以是选自由i )将羊栖菜浸渍于η-己烷并去除脂质，以丙酮提 取的丙酮提取物；ii )针对上述丙酮提取物以碳数为1至4的低元醇或其水溶液去除盐的 酒精提取物；以及iii)在以上述酒精提取物进行提取的过程中，针对残留的残渣利用甲苯 (toluene)来去除色素，并以丙酮重新提取的丙酮提取物组成的组中的一种或两种以上的 混合物。
[0049] 下面，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。但是，本发明并不限定于以下公 开的实施例，而是能够以各种不同的形态实现，提供以下实施例是为了使本发明的公开更 加完整，并为了向本发明所属技术领域的普通技术人员更全面地说明本发明的范畴。
[0050] 实施例1 :提取来自羊栖菜的phlorotannins
[0051] 在本发明中使用的羊栖菜从2012年12月到2013年1月期间在东海采集，并使用 自来水去除盐分和沙子后，在阴凉处进行自然风干，破碎后进行保管，证据标本保管于国立 生物资源馆（标本凭单：NIBRAL0000137941)，采用现有方法（Fairhead et al.，Polar Biol 28 :680-686. 2005 ;Lopes et al.，PLoS ONE 7 :e31145. 2012)按照下列方式提取褐藻多酚 提取物（phlorotannins extract，以下简称为"PE"）。
[0052] 首先，将破碎的上述羊栖菜100g浸渍于300mL的η-己烧（n-hexane) 2次，去除 上清液，去除脂质并蒸发溶剂后，将剩余残渣再次浸渍于70%丙酮水溶液500ml，在室温下 提取 24 小时，使用过滤纸（Whatmann International Ltd·, Maidstone，UK)过滤后，蒸发 溶剂（Rotary evaporator, N-1110, Eyela，Tokyo，Japan)，从而确保丙酮提取物。将上述 丙酮提取物浸渍于100%甲醇500ml，去除上清液，从而去除盐，使溶剂蒸发后，使用甲苯 (toluene)清洗剩余残渣，从而彻底去除色素，利用70%丙酮水溶液500ml进行再提取。按 照如上所述的方式，使以丙酮重新提取的上清液的溶剂蒸发，最终取得含褐藻多酚羊栖菜 提取物6. 28g (图1)。
[0053] 实施例2 :DMBA分析
[0054] 为了定量测定根据本发明的一实施例提取的褐藻多酚提取物（PE)，执行DMBA分 析。
[0055] 具体地，作为用于进行相对比较而算出的标准物质（standard substance)，使用 了间苯三酸（phloroglucinol，Sigma-Aldrich，M0，USA)，为了确认含在PE绝对量内的褐 藻多酚的相对容量，使PE溶解于蒸馏水，以达到62. 5~1000 μ g，接着，调整所有样品的最 终容量以达到10 μ 1，添加甲醇10 μ 1，并添加 N，N-二甲基甲酰胺（DMF) 10 μ 1以及以乙酸 (acetic acid)稀释的16%盐酸（hydrochloric acid) 200 μ 1。向准备的上述各混合液中 添加溶解于乙酸的DMBA(20mg/mL)200 yl，在30°C恒温水槽（water bath)中培养60分钟， 并在510nm中测定吸光度，算出标准物质浓度有关相对含量。
[0056] 在对根据PE绝对量的褐藻多酚的含量进行测定后，基于此制订回归方程式之后， 代入提取物总量，经确认，从干燥的羊栖菜l〇〇g所获得的褐藻多酚的总含量为约57. 87mg， 在最终提取物（PE)中，算出含有9·21mg/g((λ9%干燥重量）（图2)。
[0057] 实施例3 :HPLC_MS分析
[0058] 根据本发明的一实施例，为了分离并提炼上述最终提取物（PE)内含有的褐藻多 酚而执行HPLC-MS分析。
[0059] 具体地，通过 HPLC (ThermoAccela UPLC，Waltham，MA，USA)-MS (Thermo LTQ-〇rbi trap XL，Waltham，MA，USA)分析从羊栖菜中提取的PE，试料溶解于蒸馏水，第一次测定时 注入2 μ 1。在上述分析中使用的圆柱为ACQUITYBH1 C18column(150 la 2. 1mm，1. 7 μπι)，流 动相（mobile phase)使用向蒸馏水添加0· 1 %甲酸的溶剂Α和向乙腈（acetonitrile)添 加 0· 1 % 甲酸的溶剂 B(HPLC grade，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)，溶剂 梯度最初以〇% A、100% B开始，20分钟后，直线增加溶剂A的浓度，以达到80% A，截止到 20~30分钟，以100% A、0% B进行分析。流速设定为400 μ 1/min，在200~500nm的波 长下测定吸光度，圆柱的温度固定为35°C。当搜集质谱（mass spectra)时，HESI探头温度 (probe temperature)设定为 300°C、喷涂电压（spray voltage)设定为 3. 5kV、喷涂流量 (spray flow rate)设定为 50arb、质量范围（mass range)设定为 150 ~1600m/z、隔离区 域（isolation width)设定为2. 5m/z及CID能量设定为45进行了分析。
[0060] 结果，在230nm下确认两个类型的褐藻多酚。首先，在停留时间（retention time) 0.9分钟中识别出二苯醚（diphenyl ether，理论分子量=170. 21g/mol)(图3)，在 25. 2分钟下识别出预估为咲喃昆布醇A(phlorofucofuroeckolA，理论分子量=602. 45g/ mol)的物质（图4)。
[0061] 实施例4:抗氧化效能分析
[0062] 根据本发明的一实施例为了确认褐藻多酚提取物（PE)的抗氧化效能，执行了 DPPH自由基清除效能分析（DPPH radical scavenging assay)以及借助羟基（hydroxyl radical)的蛋白质分解抑制效能分析（protein degradation assay)。
[0063] 4-1 :DPPH自由基清除效能
[0064] 根据本发明的一实施例，制备含DPPH 0. 3mM的甲醇溶液，从100 μ g到1. 5 μ g，混 合以2倍比例连续稀释（serial dilution)的PE后，在室温下反应10分钟，而后在517nm 下测定吸光度，对自由基清除效能进行了比较分析，作为阳性对照组，使用了抗氧化效果优 秀的抗坏血酸（ascorbic acid，50 μ M)〇
[0065] 结果，在PE的情况下，表现出了浓度依赖性的自由基清除倾向，但在50 μ g以上的 浓度下表现出统计学上的显著性差异（图5)。
[0066] 4-2 :氧化氮（N0)消除效能
[0067] 为了确认褐藻多酚提取物（PE)是否具有氧化氮清除活性，执行修正的非-细胞氧 化氮消除分析（SNAP 分析）。即，准备混入 100 μ mol/L 的 SNAP(Snitros〇-N_acetylpenicil lamine)、10% DMS0、各种浓度的PE (3. 125-100 μ g/mL)的溶液。反应的最终体积为150 μ L， 在37°C下培养3小时。反应结束后，按照指南将各样品（50yL)与格里斯试剂（Griess reagent)相混合，并在540nm下测定吸光度。结果，随着PE浓度的增加，观察到NO消除，且 在50 μ g/mL以上浓度下确认到显著水平的N0消除能力（图6)。
[0068] 4-3 :蛋白质分解抑制效能
[0069] 根据本发明的一实施例，执行金属离子催化剂氧化抑制效果（protein degradation assay)分析，即，利用金属离子催化反应确认在因活性氧（reactive oxygen species，R0S)而导致的损伤中保护蛋白质或酶的抗氧化物质的效果。首先，靶蛋白 (target protein)使用 0· 5 μ g/mL 的 BSA(bovine serum albumin)，在第一次反应中，添加 Cu2+(100yM)和H202(lmM)，生成羟基（hydroxyl radical)后，混合BSA和各浓度实验物 质，而后执行第二次反应。结束反应的各组在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，确认了 借助各试料的BSA蛋白质抑制水平（degradation)，作为阳性对照组，使用抗氧化效果优秀 的抗坏血酸（50 μ M)。
[0070] 结果，在仅添加过氧化氢（Η202)和Cu2+的实验组中，经确认已发生BSA的彻底分 解，相反地，在PE处理实验组中，在25 μ g以上浓度下出现蛋白质保护效果，在50 μ g以上 的浓度下观察到作为阳性对照组的抗坏血酸以上的效能（图7)。
[0071] 实施例5 :UV_B、UV-A隔离in vitro模型实验
[0072] 根据本发明的一实施例，确立in vitro模型，以来自人成纤维细胞（human fibroblast)的CCD986sk细胞作为对象来调整UV-B及UV-A的照射强度及时间条件，确立 可形成借助UV-B及UV-A的刺激但不诱发极端毒性的条件后，确认借助PE的保护效果。为 了构建模型，一边照射UV-B及UV-A，一边对培养的细胞测定一氧化氮（N0)及LDH (lactate dehydrogenase)，通过核染色，设定细胞发生直接损伤的时间，观察引起mRNA及蛋白质等 基因水平变化的条件等。为了在细胞中诱发人为的紫外线刺激，照射（irradiation)则 利用VILBER L0UMAT(BLX-E312)，按照所设定的恒定时间间隔，并以20mJ/cm2的强度照射 UV-B(312nm，20mJ/cm2)及 UV-A(10J/cm2)〇
[0073] 5-1 :测定一氧化氮（nitric oxide)发生条件
[0074] 根据本发明的一实施例，以来自人成纤维细胞（human fibroblast)的(XD986sk 细胞株作为对象，为了确认借助UV-B的一氧化氮（NO)发生条件，培养相同数量的细胞后， 以30分钟、1小时及2小时的间隔照射UV-B (20mJ/cm2)。照射UV-B后，采集50 μ 1的培养 基，使得格里斯试剂（griess reagent)和上述培养基反应15分钟，诱导显色反应，利用分 光光度计（spectrophotometer)在540nm下测定吸光度，比较对照组有关相对NO发生水 平。
[0075] 结果，从30分钟到2小时期间，阶段性地向细胞照射UV-B，在纵向出现N0的增加， 可确认已发生UV-B下的刺激（图8)。
[0076] 5-2 :调节一氧化氮（nitric oxide)的发生
[0077] 为了确认借助本发明的一实施例的PE处理能否通过有效隔离UV-B来调节NO 的发生，以(XD986sk细胞为对象，对10~100 μ g/mL的PE进行6小时的处理后，照射 UV-B(20mJ/cm2) -分钟，结束UV-B照射后，补充培养16小时，通过显色反应来比较向培养 基分泌的N0的相对量。
[0078] 结果，在UV-B实验组中，相比于对照组，表现出接近4倍的N0发生，相反地，在处 理PE之后照射UV-B时，可确认N0的发生显著减少。即，在PE处理实验组中，从最低浓度 的10 μ g以上到与对照组几乎相同的水平，N0生成被阻碍（图9)。
[0079] 5-3 :细胞毒性分析（LDH release assay)
[0080] 根据本发明的一实施例，通过测定向细胞照射UV-B后所生成的LDH(lactate dehydrogenase)的量，比较相对的毒性水平。首先，培养相同数量的CCD_986sk细胞，以30 分钟、1小时及2小时为间隔，照射UV-B (20mJ/cm2)后，采集部分培养基，放入同量的LDH反 应液（CytoTox 96 ① Non-Radioactive CytotoxicityAssay，Promega，WI，USA)，在暗条件 下反应30分钟。反应结束后，添加停止液（stop solution)后，在490nm下测定吸光度，评 估对照组相关相对细胞毒性。
[0081] 结果，与N0测定结果相同，从纵向维度上LDH的量增加，诱发因 UV-B的毒性（图 10) 〇
[0082] 5-4 :验证降低细胞毒性效能
[0083] 根据本发明的一实施例，向因 UV-B诱发毒性的细胞进行PE处理，从而观察降低细 胞低下效能。首先，为了确认借助UV-B隔离效果的细胞毒性降低与否，以CCD986sk细胞 作为对象，将10~100 μ g/mL的PE进行6小时处理，并照射UV-B (20mJ/cm2) 1分钟，完成 UV-B照射后，补充培养16小时，通过显色反应比较了向培养基分泌的LDH的相对量。
[0084] 结果，在所有PE处理实验组中，相比于UV-B照射实验组，检出少量的LDH，考虑到 以与对照组类似的水平进行测定，可判断为屏蔽了向细胞传达的大部分UV-B光线（图11)。
[0085] 5-5 :诱导细胞凋亡（apoptosis)
[0086] 根据本发明的一实施例，向细胞照射UV-B，确认了除从细胞分泌或生成的指标以 外的诱导直接细胞凋亡（apoptosis)的时间。
[0087] 具体地，在4孔玻片腔室中培养CCD-986sk细胞后，照射UV-A(10J/cm2)各10分 钟、30分钟、60分钟、120分钟，UV-B(20mJ/cm2)以10分钟、20分钟、30分钟、60分钟及90 分钟为间隔照射，接着以PBS清洗后，以4%多聚甲醛进行固定，并以0. 25 %曲通X-100溶 解细胞膜。固定的上述细胞利用hoechst33342(life technologies，MA，USA)进行10分钟 的染色后，清洗并使用荧光显微镜观察。
[0088] 结果，UV-A从照射60分钟开始发生核凝缩，UV-B从照射20分钟开始发生核凝缩， 30分钟开始发生明确的核凝缩，从而确认到已进行细胞凋亡（apoptosis)(图12)。
[0089] 5-6 :验证细胞保护效果
[0090] 根据本发明的一实施例，向细胞进行PE处理，照射UV-B及UV-A并诱导细胞凋亡， 从而验证借助PE的细胞保护效果。
[0091] 具体地，将(XD-986sk细胞播种于4孔玻片腔室滑箱后，将100及250 μ g/mL浓度 的PE进行6小时处理，而后照射UV-B (20mJ/cm2) 15分钟。接着，对照射UV-B的各实验组 的细胞核（cell nucleus)进行荧光染色后，在荧光显微镜下观察核的形态变化。
[0092] 结果，在UV-B及UV-A处理实验组中确认到明确的核凝缩，相反地，在PE处理实 验组中，保持与对照组相似的核的形态，从而证明了 PE的紫外线隔离及细胞保护效果（图 13) 〇
[0093] 5-7 :mRNA 表达水平
[0094] 根据本发明的一实施例，为了确认照射UV-B及UV-A后细胞内的遗传性的变化， 针对(XD-986sk细胞以提取的PE按浓度（10~100 μ g/mL)进行6小时预处理，分别照射 UV-B(20mJ/cm2)或UV-A(10J/cm2)各1分钟或10分钟，在新的培养基上补充培养16小时。 完成培养后，从上述实验组和对照组中，利用trizol试剂（trizol reagent，Invitrogen， Carlsbad，CA，USA)提取总RNA。将所提取的上述RNA lyg作为对象，使用OligodT引物及 TOPscript?逆转录酶（Enzynomics, Seoul, Korea)，合成cDNA。利用所合成的上述cDNA，通 过real-time PCR放大被用作胶原蛋白分解酶的MMP-1及MMP-9基因，被放大的MMP-1及 MMP-9表达水平与GAPDH表达水平相比较，从而进行标准化。
[0095] 对借助PE的UV-B及UV-A隔离及细胞保护效果进行验证的结果，在仅处理UV-B或 UV-A的实验组中，相比于对照组，表现出高出3~5倍以上的MMP-1/MMP-9表达水平，相反 地，在PE处理实验组中，相比于UV-B或UV-A处理实验组，表现出显著的MMP-1及MMP-9基 因抑制效果，尤其，UV-B照射的同时，在PE 50 μ g/mL以上的高浓度处理实验组中，已确认 到以与对照组相似的水平调节了 MMP-1，从而验证了借助PE的UV-B高隔离效果（图14)。 并且，UV-A照射的同时，当PE 10 μ g/mL以上处理时，已验证到具有显著水平的MMP-1及 MMP-9基因表达抑制效果（图15)。
[0096] 下表1中表示了用于上述基因放大的引物的序列。
[0097] [表 1]
[0098]
[0099] 5-7 :蛋白质印迹法分析
[0100] 根据本发明的一实施例，为了确认借助PE的MMP-1表达机制的调节与否，针对 CCD-986sk细胞按浓度（10~100 μ g/mL)进行PE处理6小时，照射UV-B(20mJ/cm2) 1分 钟。接着，以PBS洗涤照射UV-B的(XD-986sk细胞，并利用1 %放射线免疫促进分析（RIPA) 缓冲剂（Rhoche, Mannheim, Germany)来提取蛋白质。提取的蛋白质利用Pierce BCA蛋白 质分析试剂（Thermo scientific, Florida, USA)并通过显色反应来定量，并将BSA设定为 标准物质。
[0101] 为了进行蛋白质印迹法分析，将同量的蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电 泳，并转换为PVDF(polyvinylidene difluoride)隔膜。接着，利用 5%脱脂乳（skim milk) 对隔膜进行阻塞（blocking)后，使p38、p-p38、I κ Β、ρ-Ι κ B及肌动蛋白（actin) 1次抗体 反应1小时30分钟，使聚合HRP (horseradish peroxidase)的2次抗体反应2小时后，利用 Amersgam ECL(enhanced chemiluminescence) 7义溶液（West Pico Maximum Sensitivity Substrate，Thermo scientific，Rockford，IL，USA)使反应部位发光，从而测定蛋白质表达 水平。蛋白质表达水平的定量比较以肌动蛋白（actin)的表达量为基准。
[0102] 结果，IkB及p38在实验组之间表现出相似倾向，相反地，在ρ-Ι κ B、p_p38中，观察 到PE处理组中具有显著的抑制效果（图16)。由此，可以判断出，相比于抑制I κ B及p38 蛋白质的生成，通过抑制两个蛋白质的磷酸化来阻碍MMP-1的表达。
[0103] 综上所述，包括借助来自于羊栖菜的褐藻多酚的皮肤老化改善及紫外线隔离效 果，针对强紫外线的细胞保护效果已得到验证，并基于此，可作为适用于天然UV隔离剂的 新材料。
[0104] 本发明以上述实施例作为参考进行了说明，但这仅仅是示例性的，本发明所属技 术领域的普通技术人员能够理解由此可以实施各种变形及等同的其他实施例。因此，本发 明真正的技术保护范围应由所附的权利要求书的技术思想来决定。
【主权项】
1. 一种羊栖菜（s. fusiforme)提取物或针对上述羊栖菜提取物以色谱法进行分离的 含褐藻多酚的活性组分在紫外线隔离用组合物制备中的用途。2. 根据权利要求1所述的用途，其中，上述羊栖菜提取物以C1至C4的低元醇、乙醇或 它们的混合溶剂进行提取而制备。3. 根据权利要求1所述的用途，其中，上述紫外线为UV-A、UV-B或UV-C。4. 根据权利要求1所述的用途，其中，上述羊栖菜提取物占组合物总重量的0. 1至50 重量％。5. 根据权利要求1所述的用途，其中， 上述羊栖菜提取物是选自由 i )将羊栖菜浸渍于η-己烷并去除脂质，以丙酮提取的丙酮提取物； ii )针对上述丙酮提取物以碳数为1至4的低元醇或其水溶液去除盐的酒精提取物； 以及 iii)在以上述酒精提取物进行提取的过程中，针对残留的残渣利用甲苯（toluene)来 去除色素，并以丙酮重新提取的丙酮提取物 组成的组中的一种或两种以上的混合物。6. 根据权利要求1所述的用途，其中，上述褐藻多酸为二苯醚（diphenyl ether)或咲 喃昆布醇 A (phlorofucofuroeckolA) 〇7. -种羊栖菜（S. fusiforme)提取物或针对上述羊栖菜提取物以色谱法进行分离的 含褐藻多酚的活性组分，在皮肤老化改善用化妆材料组合物制备中的用途。8. 根据权利要求7所述的用途，其中， 上述羊栖菜提取物是选自由 i )将羊栖菜浸渍于η-己烷并去除脂质，以丙酮提取的丙酮提取物； ii )针对上述丙酮提取物以碳数为1至4的低元醇或其水溶液去除盐的酒精提取物； 以及 iii)在以上述酒精提取物进行提取的过程中，针对残留的残渣利用甲苯（toluene)来 去除色素，并以丙酮重新提取的丙酮提取物 组成的组中的一种或两种以上的混合物。9. 一种从动物的皮肤中以色谱法分离具有紫外线隔离或皮肤老化改善功能的羊栖菜 (S. fusiforme)提取物或上述羊栖菜提取物的含褐藻多酚的活性组分。
【文档编号】A61K8/33GK106063773SQ201510811010
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2015年11月20日 公开号201510811010.8, CN 106063773 A, CN 106063773A, CN 201510811010, CN-A-106063773, CN106063773 A, CN106063773A, CN201510811010, CN201510811010.8
【发明人】朱成洙
【申请人】江陵原州大学校产学协力团