一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法。将培养至第3代的骨髓间充质干细胞接种到培养液上培养；吸出培养液，再加入复合培养液感染4小时；补充复合培养液继续感染24h；吸去复合培养液，换上含10%FBS培养液继续感染20小时，得到带GFP的报告基因的细胞液；将实现表达GFP的细胞移入培养液中培养，得到带有GFP?BMSCs的种子细胞；将人工肌腱支架，浸泡在DMEM低糖培养液中培养24h时将GFP?BMSCs细胞种植到支架上继续培养48h，再转移到肌腱细胞诱导液中培养1～2周，得到人工肌腱的移植物。本发明制备的可作为组织工程化人工肌腱移植物植入体内损伤肌腱的修复。
【专利说明】
一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法
技术领域
[0001]本发明属于组织工程化的技术领域。具体而言，涉及一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法。
【背景技术】
[0002]据研究资料报道:肌腱损伤常发生在日常的工作和运动中，世界范围内每年有超过3000万人肌腱损伤。依靠传统治疗手段的修复后的肌腱很难恢复到损伤前的功能状态。肌腱损伤的治疗也成了运动医学研究的重点。随着组织工程技术的发展，组织工程化肌腱为解决这一难题提供途径。其与传统的肌腱损伤的治疗手段相比，不再有自体供区功能缺失，及异体移植肌腱的排异等问题。
[0003]组织工程化肌腱原理是将分离的高浓度有活力的肌腱种子细胞种植于生物相容性好、可生物降解的细胞载体即支架材料，体外培养后回植入到缺损部位，形成新的、自身的、具有功能的肌腱组织，最终达到生物学意义上的完全修复。该技术与传统肌腱损伤的治疗方法相比优点在于:①修复用种子细胞和支架材料没有来源限制、无免疫排斥反应。②所形成新的肌腱组织在具有活力和功能上，可以达到完全替代。③种子细胞经体外培养扩增重建的肌腱可以按缺损肌腱形态进行预制，可修复严重的肌腱缺损。
[0004]组织工程化肌腱的构建成功与否，主要决定于一是种子细胞，二是组织工程支架材料，三是诱导因素。种子细胞是一群具有多相分化潜能的细胞，取材方便、易分离纯化，可以多次传代并保持分化能力，移植不发生或程度很轻地发生免疫排斥反应，具有多相分化的潜能，适用于多种组织的修复重建。较为理想的组织工程支架材料具有生物相容性及细胞亲和性好，来源广泛，能够为种子细胞的粘附、增殖、分化和分泌细胞外基质提供三维空间结构，并具有加工性能和力学性能满足修复后肌腱运动。种子细胞的分化受细胞周围环境中物理、化学及生物因素的调控。诱导因素主要包括生长因子都能促进种子细胞增殖并向腱细胞方向分化，强化组织工程肌腱的生物力学的活性。除了上述三个因素以外，还有一个过程关键因素是组织工程化肌腱体外培养或植入体内后，如何便于体外观察种子细胞是否成活生长及了解肌腱损伤的修复情况。目前开发出的组织工程化肌腱不具备这种的体外观察的功能。
[0005]在组织工程支架材料的制备方面，福建师范大学黄祖新等人研制成功了“一种细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架的制备方法”并申请了发明专利(与本发明同日申请)。该专利采用木糖葡糖醋杆菌(Glucoacetobacter xyli/3us)，首先制备细菌纤维素膜(BC膜)，再采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的不锈钢模具，将制备的BC膜压制定型成组织工程化人工肌腱支架。所制备的支架孔隙率、持水性、复水性、力学性能、细胞毒性和细胞相容性等技术指标符合的要求，可应用于组织工程化人工肌腱的制备。
[0006]组织工程学研究是一项重大工程，真正要实现体外预制有生命的种植体完全替代人体组织、器官功能，组织工程化肌腱要真正应用于临床，进行产业化的生产，最终解决人类病损肌腱的修复问题，不但是人工肌腱支架材料，还要解决种子细胞和诱导因素关键技术问题。
[0007]
【发明内容】
:
本发明的目的就是针对现有技术问题，选择骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞、以细菌纤维素膜组织工程化人工肌腱支架为载体，将绿色荧光蛋白(GFP)通过Lv病毒转染骨髓间充质干细胞并种植在人工肌腱支架上，经过体外培养，构建含有GFP-BMSCs-BC的组织工程化的人工肌腱移植物。该GFP-BMSCs-BC组织工程化人工肌腱移植物植入体内后，能够在荧光显微镜下看到细胞发出的荧光，说明种子细胞能够在生物支架上生长，可体外观察种子细胞是否在体内成活并生长，同时可了解肌腱损伤的修复情况。
[0008]为实现本发明的目的而采用技术方案如下:
1、种子细胞的制备
(I)骨髓间充质干细胞准备:将培养至第3代的骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种到6孔板中DMEM低糖培养液上，接种的细胞浓度为I X 106/mL，置于细胞培养箱培养，培养到细胞汇合率达50%至70%。
[0009](2)慢病毒LV-GFP转染BMSCs:将带有汇合率达到50%至70%的BMSCs的DMEM低糖培养液吸出，再加入复合培养液，在细胞培养箱中以37 °C温度，5%C02浓度培养条件，感染4小时；4小时时补充复合培养液至原体积，继续感染24h;吸去复合培养液，换上新鲜的含10%FBS的DMEM低糖培养液继续培养20小时，并经过消化，得到带GFP的报告基因的BMSCs液。
[0010]所述的复合培养液，是指在含10%FBS的DMEM低糖培养液为基础液，每毫升基础液分别添加5?8yg的5-二氮^ 亚甲基聚甲溴化物(口01}^1^6116)和5?848的慢病毒1^-6??原液。
[0011](3)转染细胞筛选:将带GFP的报告基因的BMSCs液，通过荧光显微镜观测GFP表达情况，将实现表达GFP的BMSCs移入到已添加5?8yg/mL puromycin的含10%FBS的DMEM低糖培养液中培养，每12h更换上述培养液一次，培养48h后筛选出稳定转染的细胞株，即制备成GFP-BMSCs的种子细胞。
[0012]2、GFP-BMSCs-BC组织工程化人工肌腱移植物:
将组织工程化人工肌腱支架，浸泡在含10%FBS的DMEM低糖培养液中，并置于细胞培养箱中培养24h，使组织工程化人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培养液。将GFP-BMSCs细胞以I?2 X 105/ml的细胞浓度种植到已充分吸收DMEM低糖培养液的支架上。以37 °C温度，5%C02浓度培养条件经过细胞培养箱先培养48h，再转移到肌腱细胞诱导液中培养I?2周，得到本发明所述的含有GFP-BMSCs-BC的组织工程化人工肌腱的移植物;可作为GFP-BMSCs-BC的组织工程化人工肌腱移植物植入体内损伤肌腱的修复。
[0013]采用本发明方法制备得到含有GFP-BMSCs-BC的组织工程化人工肌腱的移植物，按照实验动物和动物伦理委员会的规定用于修复SD大鼠受损肌腱。即在大鼠肌腱中间，切除
0.5cm的肌腱，制造缺损模型;植入本发明制备的含有GFP- BMSCs-BC的组织工程化人工肌腱的移植物，使用3-0缝合线，使组织工程化人工肌腱和SD大鼠受损自体肌腱紧密缝合相连，缝合线缝合皮肤，放入鼠笼里。术后3d，手术部位肿胀消除，无排斥反应和无炎症反应。IW后，伤口愈合。两周后，表皮连线已经脱落，后肢可支撑，但不能正常弯曲。3W后，大鼠可用后肢支撑但不可以正常弯曲行走。伤口没有撕裂，也没有炎症反应。5W后，大鼠可用后肢支撑但仍然不能弯曲行走，伤口没有撕裂，也没有炎症反应。术后12W，大鼠后肢可支撑稳、可弯曲，并可行走，表面伤口已经完全康复，手术部位的毛发也重新长出。
[0014]上述修复过程，通过在荧光显微镜下观察荧光蛋白表达情况，显示植入的GFP-BMSCs细胞能正常生长在BC支架上。
[0015]本发明所述的组织工程化人工肌腱支架，是通过如下方式得到的:
一、BC膜的制备
(一)制备
1、将木糖葡糖醋杆菌(Glucoace tobacter xylinus)菌种接种到固体培养基进行常规的活化后，从固体培养基上挑选活化的菌种，接入装有I OOmL液体培养基的500mL锥形瓶，在28°C和160r/min摇床的条件下培养24?32h制成木糖葡糖醋杆菌种子液，备用。
[0016]2、木糖葡糖醋杆菌种子液以每升酒糟降解液复合液接入6 -8%体积的接种量，接入到酒糟降解液复合液中，充分震荡，使菌液均匀后，放置于28°C培养箱中进行静置培养。培养4?6天后，可见液体培养基液面浮有细菌纤维素膜，此时细菌纤维素膜厚度为2.5?4.5 mm0
[0017]3、取出浮于培养基表面的细菌纤维素膜，用自来水多次冲洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加热并煮沸lOmin，去除膜中的培养基和菌体等杂质。取出，加蒸馏水漂洗10 min。再将细菌纤维素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸1min，用蒸馏水多次漂洗细菌纤维素膜，直至洗涤水pH值为7.0为止。
[0018]4、将细菌纤维素膜用蒸馏水浸24?28h，得到白色半透明的细菌纤维素膜。此时，所制备的细菌纤维素膜由细小的纤维束交错形成中间为大量纳米级孔隙的纤维素膜。
[0019]所述的菌种为木糖葡糖醋杆菌(6^ucoace1/?acier，编号为I.1812，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)。
[0020]所述的固体培养基制备配方为:3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.6%磷酸氢二钠，0.2%硫酸镁，2%琼脂粉。按常规配制，灭菌备用。
[0021 ]所述的液体培养基，其配方为:2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.2%磷酸氢二钠，0.1%硫酸镁;液体培养基pH 6.0-6.5。
[0022]所述的酒糟降解液复合液，以酒糟降解液为母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%柠檬酸，0.02%磷酸氢二钠，0.01%硫酸镁；酒糟降解液复合液pH6.0?6.5，灭菌备用。
[0023 ]酒糟降解液的制备:将10重量份机榨黄酒酒糟中加入50?60重量份5 5 V热水，搅拌混合，再加I重量份复合酶酶解5?6小时，酶解条件:品温为45°C?50°C，pH 6.0?6.5。酶解后经过滤机过滤的液体为酒糟降解液，灭菌备用。
[0024]所述的复合酶，其重量组分比为中温α-淀粉酶:糖化酶:中性蛋白酶=3:4:3。
[0025]所述的中温α-淀粉酶、糖化酶、中性蛋白酶购自诺维信(中国)生物技术有限公司。
[0026]二、支架成型
(一)制备
采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分开不锈钢模具，将本发明制备的孔隙率、持水性、复水性、力学性能技术指标符合要求的BC膜，填充于模具内，压制定型成组织工程化人工肌腱支架，将压制定型后支架放在高压灭菌锅中进行温度121°C、15min的灭菌处理，灭菌处理后降到室温后，放入4°C冰箱保存、备用。由于模具内底部刻有单向凹凸浅花纹，因而压制定型成组织工程化人工肌腱支架表面也具有单向浅花纹。
[0027]所述的肌腱细胞诱导液以10 %FBS的DMEM低糖培养液为基础液，每毫升基础液分别添加100U链霉素、100U青霉素、10 mmol β_甘油磷酸钠、10 mol地塞米松、50mg维生素C、50mg人骨形态发生蛋白12(BMP12)、5yg人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20yg人表皮生长因子(EGF)。
[0028]所述的慢病毒LV-GFP购自汉恒生物科技(上海)有限公司；骨髓间充质干细胞(BMSCs)购自赛齐(上海)生物工程有限公司。
[0029]所述人骨形态发生蛋白12(BMP12)、人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人表皮生长因子(EGF)购自北京中科物源生物技术有限公司。
【附图说明】
[0030]图1是本发明制备的组织工程化人工肌腱移植物GFP-BMSCs-BC细胞HE染色8周后细胞受力方向排列图。
[0031]图2是本发明制备的组织工程化人工肌腱移植物术后2周胶原蛋白I型免疫组化显示图。
[0032]图3是本发明制备的组织工程化人工肌腱移植物胶后2周原蛋白ΙΠ型大量表达显示图。
【具体实施方式】
[0033]实施例1
1、种子细胞的制备
(I)骨髓间充质干细胞准备:将培养至第3代的骨髓间充质干细胞(BMSCs)接种到6孔板中DMEM低糖培养液上，接种的细胞浓度为I X 106/ml，置于细胞培养箱培养。培养到细胞汇合率达55 %。
[0034](2)慢病毒LV-GFP转染BMSCs:将带有汇合率达到50 °/c^BMSCs的DMEM低糖培养液吸出，再加入复合培养液，在细胞培养箱中以37 °C温度，5%C02浓度培养条件，感染4小时;4小时时补充复合培养液至原体积，继续感染24h;吸去复合培养液，换上新鲜的含10%FBS的DMEM低糖培养液继续培养20小时，经过消化，得到带GFP的报告基因的BMSCs液。
[0035](3)转染细胞筛选:将带GFP的报告基因的BMSCs液，通过荧光显微镜观测GFP表达情况，将实现表达GFP的BMSCs移入到已添加5yg/mL puromycin的含10%FBS的DMEM低糖培养液中培养，每12h更换上述培养液一次，培养48h后筛选出稳定转染的细胞株，即制备成GFP-BMSCs的种子细胞。
[0036]2、GFP-BMSCs-BC组织工程化肌腱移殖物:
将组织工程化人工肌腱支架(BC膜支架)，浸泡在含10%FBS的DMEM低糖培养液中，并置于细胞培养箱中培养24h，使BC膜支架充分吸收DMEM低糖培养液。将GFP-BMSCs细胞以2 X105/ml的细胞浓度种植到已充分吸收DMEM低糖培养液的BC膜支架上。经过细胞培养箱培养48h，然后肌腱细胞诱导液中培养I周，得到含有GFP-BMSCs-BC的组织工程化肌腱移植物。
[0037]采用本发明方法制备得到含有GFP-BMSCs-BC的组织工程化肌腱移植物，用于修复SD大鼠受损肌腱。即在大鼠肌腱中间，切除0.5cm的肌腱，制造缺损模型;植入本发明制备的含有GFP- BMSCs-BC的组织工程化肌腱移植物，使用O号或3号缝合线，使组织工程化肌腱和SD大鼠受损自体肌腱紧密缝合相连，缝合线缝合皮肤，放入鼠笼里。术后3d，手术部位肿胀消除，无排斥反应和无炎症反应。IW后，伤口愈合。两周后，表皮连线已经脱落，后肢可支撑，但不能正常弯曲。3W后，大鼠可用后肢支撑但不可以正常弯曲行走。伤口没有撕裂，也没有炎症反应。5W后，大鼠可用后肢支撑但仍然不能弯曲行走，伤口没有撕裂，也没有炎症反应。术后12W，大鼠后肢可支撑稳、可弯曲，并可行走，表面伤口已经完全康复，手术部位的毛也重新长出。
[0038]上述修复过程，通过在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况，显示GFP-BMSCs细胞能正常生长在BC支架上。
[0039]GFP-BMSCs-BC细胞HE染色结果证明:术后8周细胞数量减少到正常水平且呈受力方向排列(见图1);免疫组化显示:术后2周胶原蛋白I型(见图2)和胶原蛋白m型(见图3)大量表达。
【主权项】
1.一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法，其特征是: (1)骨髓间充质干细胞准备:将培养至第3代的骨髓间充质干细胞接种到6孔板中DMEM低糖培养液上，接种的细胞浓度为I X 106/mL，置于细胞培养箱培养，培养到细胞汇合率达50%至70%; (2)慢病毒LV-GFP转染BMSCs:将DMEM低糖培养液吸出，再加入复合培养液，在细胞培养箱中以37 °C温度，5%C02浓度培养条件，感染4小时;4小时时补充复合培养液至原体积，继续感染24h;吸去复合培养液，换上新鲜的含10%FBS的DMEM低糖培养液继续培养20小时，经过消化，得到带GFP的报告基因的BMSCs液； (3)转染细胞筛选:将实现表达GFP的BMSCs移入到已添加5?8yg/mlpuromycin的含10%FBS的DMEM低糖培养液中培养，每12h更换上述培养液一次，培养48h后筛选出稳定转染的细胞株，得到GFP-BMSCs的种子细胞； (4)将组织工程化人工肌腱支架，浸泡在含10%FBS的DMEM低糖培养液中，并置于细胞培养箱中培养24h，使组织工程化人工肌腱支架充分吸收DMEM低糖培养液;将GFP-BMSCs细胞以I?2 X 105/mL的细胞浓度种植到人工肌腱支架上；以37°C温度，5%C02浓度培养条件，经过细胞培养箱先培养48h，再转移到肌腱细胞诱导液中培养I?2周，得到含有GFP-BMSCs-B(^9组织工程化人工肌腱的移植物。2.根据权利要求1所述的一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法，其特征是所述的复合培养液，是指在含10 %FBS的DMEM低糖培养液为基础液，每毫升基础液分别添加5?8yg的5-二氮^^一亚甲基聚甲溴化物和5?8yg的LV-GFP病毒原液。3.根据权利要求1所述的一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法，其特征是所述的组织工程化人工肌腱支架，是通过如下方式得到的: 1)将木糖葡糖醋杆菌((Wucoace1/?acierifius)菌种接种到固体培养基进行常规的活化后，从固体培养基上挑选活化的菌种，接入装有I OOmL液体培养基的500mL锥形瓶，在28°C和160r/min摇床的条件下培养24?32h制成木糖葡糖醋杆菌种子液，备用； 2)木糖葡糖醋杆菌种子液以每升酒糟降解液复合液接入6?8%体积的接种量，接入到酒糟降解液复合液中，充分震荡，使菌液均匀后，放置于28°C培养箱中进行静置培养，培养4?6天后，可见液体培养基液面浮有细菌纤维素膜，此时细菌纤维素膜厚度为2.5?4.5 mm； 3)取出浮于培养基表面的细菌纤维素膜，用自来水多次冲洗后，放于0.1M的NaOH溶液中加热并煮沸lOmin，去除膜中的培养基和菌体等杂质。取出，加蒸馏水漂洗10 min，再将细菌纤维素膜放于0.1M的NaOH溶液并再次煮沸lOmin，用蒸馏水多次漂洗细菌纤维素膜，直至洗涤水pH值为7.0为止； 4)将细菌纤维素膜用蒸馏水浸24?28h，得到白色半透明的细菌纤维素膜； 5)采用基本符合天然肌腱外形和尺寸的二分开不锈钢模具，将本发明制备的BC膜填充于模具内，压制定型成组织工程化人工肌腱支架，将压制定型后支架放在高压灭菌锅中进行温度12rC、15min的灭菌处理，灭菌处理后降到室温后，放入4°C冰箱保存、备用。4.根据权利要求3所述的一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法，其特征是所述的固体培养基制备配方为:3%葡萄糖，0.8%蛋白胨，0.8%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.6%磷酸氢二钠，0.2%硫酸镁，2%琼脂粉，按常规配制，灭菌备用； 所述的液体培养基，其配方为:2%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.5%酵母浸出物，0.1%柠檬酸，0.2%磷酸氢二钠，0.1%硫酸镁;液体培养基pH 6.0-6.5； 所述的酒糟降解液复合液，以酒糟降解液为母液，含有0.2%葡萄糖，0.05%蛋白胨，0.05%酵母浸出物，0.01%柠檬酸，0.02%磷酸氢二钠，0.01%硫酸镁；酒糟降解液复合液pH6.0?6.5，灭菌备用；其中酒糟降解液的制备:将100重量份机榨黄酒酒糟中加入50?60重量份55 0C热水，搅拌混合，再加I重量份复合酶酶解5?6小时，酶解条件:品温为45 °C?500C，pH 6.0?6.5;酶解后经过滤机过滤的液体为酒糟降解液，灭菌备用； 所述的复合酶，其重量组分比为中温淀粉酶:糖化酶:中性蛋白酶= 3:4:3。5.根据权利要求1所述的一种基于人工肌腱支架材料的组织工程化人工肌腱移植物的制备方法，其特征是所述肌腱细胞诱导液以含10 %FBS的DMEM低糖培养液为基础液，每毫升基础液分别添加100U链霉素、100U青霉素、10 mmol β-甘油磷酸钠、1mol地塞米松、50mg维生素C、50mg人骨形态发生蛋白12(BMP12)、5yg人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20yg人表皮生长因子(EGF)。
【文档编号】A61L27/38GK106075585SQ201610534817
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月8日
【发明人】黄镇, 黄祖新, 周文浩
【申请人】福建师范大学