从油回收疏水性肽的制作方法

专利名称：从油回收疏水性肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及从植物油回收疏水性肽的方法。更具体地说，本发明涉及从由植物材 料提取的油分离和离析单种疏水性肽的方法。
背景技术：
已知多种来自植物的疏水性肽是高生物活性的材料，具有广泛的治疗应用。举例 来说，紫菀苷(asterin)是从紫菀(Aster tartaricus,也称为tartarian aster)分离的 环五肽，已知其是有效的抗肿瘤化合物。从千针万线草(Stellaria yurmanensis)(也称为 繁缕(chickweed)，通常称作云南繁缕(yurmanins))提取的环七肽对P388白血病细胞具 有细胞毒性效应。同样，红藤草(Rubia akane，也称为亚洲茜草(asian madder))和茜草 (Rubia cordifolia，也称为印度茜草(indian madder))产生具有类似细胞毒性活性的双 环六肽。王不留行环肽(Segetalin)A是得自麦蓝菜(Vaccaria segitalis)(也称为王不 留行或cow cockle)的环六肽，已知其具有类似雌激素的活性。孩儿参(Pseudostellaria heterophylla)(也称为太子参(Tai Zi Shen/false starwort/Prince Seng)是用作“肺 用人参”。已知孩儿参含有环七肽太子参环肽(PseudostellarirOD，其是众所周知的中药， 用于补“气”和产生“阴”津。使用太子参环肽D作为肺和肾的补品是因为其抑制酪氨酸 酶。另外，得自亚麻籽的环亚麻肽在抑制多种免疫反应方面具有活性，这些免疫反应包括 ⑴迟发型超敏反应；(ii)皮肤同种异体移植排斥反应；(iii)移植物抗宿主反应；(iv)佐 剂后关节炎；和(ν)新西兰黑(NZB)小鼠的溶血性贫血。疏水性肽的潜在应用包括(但不限于)以药物形式和以疫苗制剂使用。编码环亚 麻肽的基因的表达与细胞损伤期间的程序性细胞死亡有关。因此，回收和纯化所述疏水性 肽是很重要的。至今所报导的回收疏水性肽的方法和过程都很繁琐，且疏水性肽的产率不 高。此外，先前发明涉及使用硅胶将所有疏水性肽作为组提取，随后进行色谱分离以便离析 单种的疏水性肽，这可能产生问题且很昂贵。Kaufman 等 人(Uber ein Oligopeptid aus Leinsamen Chem Ber,1959,92 2805-9)描述一种从在亚麻籽加工中获得的沉淀“软泥”回收疏水性肽的方法。Morita等 人(Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,1997,7(10) 1269-1272 ；Tetrahedron, 2002,58 5135-5140 ；Phytochemistry,2001,57 :251_260 ；Tetrahedron,1999,55 967-976)描述从亚麻籽、压饼(press cake)和根制备少量的疏水性肽。其提取过程需要大 量的亚麻材料(30千克)，这要用4倍体积的热甲醇进行提取。随后移除溶剂，对整个混合 物进行聚苯乙烯柱(Diaion HP-20)色谱，且用渐增浓度的甲醇洗涤。疏水性肽保持与柱 结合，直到用纯甲醇洗涤。极性溶质可在有水的情况下从柱移除。然后对含有疏水性肽的 甲醇馏分进行正相硅胶色谱，其使用氯仿和甲醇梯度(100 O到O 100)，其中用相对低 浓度的甲醇洗提所述肽。回收甲醇氯仿梯度馏分，且对其进行使用甲醇和乙腈梯度的反 相色谱，以离析含有单种疏水性肽的单种馏分。Stefanowicz (Acta Biochimica Polonica，2001，48 1125-1129)公开从亚麻籽回收疏水性肽。使用5克碾碎的亚麻籽在100毫升丙酮中提取整夜来进行环亚麻肽的提取。 真空浓缩丙酮馏分，将所得混合物溶解于甲醇中，且使用10%氢氧化钠水解。干燥后，通过 乙酸乙酯提取来离析含有环亚麻肽的馏分。所述方法不能分离和离析每种疏水性肽。Briihl 等人的最新公开案(J. Agric. Food Chem.，2007，55 :7864_7868)公开了一 种离析疏水性环肽的方法，其提供低产率的产物。用具有8mm喷嘴的实验室型螺旋压榨机， 在不超过60°C的温度和35rpm的螺旋转速下从亚麻籽制备苦味亚麻籽油。新鲜获得的油 (30%产率)的温度不超过40°C。没有采取额外步骤最大化从亚麻籽获得的油回收率和肽 提取率。随后将苦味亚麻籽油的等份溶解于庚烷(一种未经批准用于食品提取的溶剂)中， 然后用甲醇/水溶剂(6 4;v/v;各200mL)提取3次。经由湿滤纸过滤水层以从水层分 离痕量的油，然后真空移除溶剂。从油获得苦味馏分，然后将其溶解于甲醇/乙醚(1 1 ； ν/ν ；ImL)中且置于填充有硅胶浆料的玻璃柱的顶端。使用各种比率的乙醚与乙醇的溶剂 混合物进行色谱。在真空下从溶剂中分离单种馏分，然后将其溶解于水中。通过反相高效 液相色谱(HPLC)纯化环亚麻肽Ε。将认为含有苦味化合物的某些馏分的等份溶解于水/乙 醇中且在柱上通过HPLC分离，所述柱连接于UVD 340型US/vis检测器，其在210nm波长下 操作。色谱以甲醇/水(75 25 ；ν/ν)的混合物开始且以100%甲醇结束，在25分钟内的 完毕。使用馏分收集器收集Imin馏分中的流出物，其中从溶剂和残余物分离的每种馏分在 超声处理后溶解于水中。从植物回收疏水性肽是困难、繁琐且昂贵的。化学合成所述肽已被视为候选治疗 性疏水性肽的替代来源。举例来说，Wiezorek等人(P印tide Res, 1991,4 :275_283)公开了 使用经叔丁氧羰基保护的氨基酸，在Merrifield树脂上以合成法制备环亚麻肽A。用三氟 乙酸与硫酸的混合物从树脂上分离产物，然后用卡特试剂(Castro’ s reagent)将其环化， 溶解于乙酸乙酯中，随后用IN NaOHUN HCl和水洗涤。最终产物通过HPLC纯化。然而，所 述合成法的产物产率也很低，且无法有效解决在回收内源肽的过程中所遇到的困难。

发明内容
本发明的示例性实施方案涉及从植物油回收疏水性肽的方法。合适的油例如为亚 麻籽油。本发明的一示例性实施方案涉及从植物材料分离和回收单种环肽的方法。合适 的植物材料是从植物材料提取的油。所述方法一般包含以下步骤(a)从植物材料提取油； (b)将提取的油分离成非极性馏分和极性馏分；(c)从非极性馏分分离和回收环肽；和(d) 从极性馏分分离和回收环肽。根据一方面，通过混合选定植物油与合适的吸附剂，从而使疏水性肽附着于吸附 剂上，从所述油回收疏水性肽。合适的吸附剂例如为硅胶。从吸附剂分离油之后，用合适溶 剂洗涤吸附剂至少一次，所述溶剂是为了溶解至少多种附着于吸附剂的疏水性肽而选择出 来的。从溶剂回收所述多种疏水性肽。可选择用一系列溶剂依序流过吸附剂，其中每种溶 剂选择用于溶解至少多种附着于吸附剂的疏水性肽。根据另一方面，合适的溶剂例如为烃、酮、低碳脂肪醇、酯、卤化溶剂、醚、芳香物和 其组合。适合的是包含一系列极性渐增的溶剂。本发明方法的另一示例性实施方案涉及改性油以及产生所述改性油的方法，所述改性油包含一种或一种以上选定疏水性肽的特制组合物。将如本文所公开经分离、纯化和 定量的一种或一种以上选定疏水性肽与不含疏水性肽的植物油混合。本发明的另一实施方案涉及用于调节与细胞凋亡相关的生理障碍的方法，其使用 包含一种或一种以上如本文所公开的产生的纯化疏水性肽的组合物。


将结合参考以下图式来描述本发明，其中图1为从亚麻籽油提取并根据本发明的一实施方案通过从硅胶色谱柱洗提而分 离的环亚麻肽的NMR光谱图。图2为从由亚麻籽油分离的非极性馏分提取的环亚麻肽的NMR光谱图。所述环亚 麻肽根据本发明的一实施方案通过从硅胶色谱柱洗提而分离。图3为从亚麻籽油提取并根据本发明的另一实施方案通过从硅胶色谱柱洗提而 分离的环亚麻肽的NMR光谱图。图4为通过吸附于与亚麻籽油混合的硅胶上而提取，然后根据本发明的另一实施 方案从硅胶回收的环亚麻肽的NMR光谱图。所述环亚麻肽通过从硅胶色谱柱洗提而分离。图5显示以下物质的化学结构(a)环亚麻肽A，(b)环亚麻肽C，(c)环亚麻肽D， (d)环亚麻肽E，(e)环亚麻肽F，和(f)环亚麻肽G。图6包含从由亚麻籽油分离的非极性馏分提取，且根据本发明的一实施方案通过 依次洗涤和从硅胶色谱柱洗提而分离的环亚麻肽的NMR光谱图(a)为第二馏分的NMR光 谱图，(b)为第三馏分的NMR光谱图，(c)为第四馏分的NMR光谱图。图7包含从由亚麻籽油分离的非极性馏分提取，且根据本发明的一实施方案通过 依次洗涤和从硅胶色谱柱洗提而分离的环亚麻肽的NMR光谱图(a)为第二馏分的NMR光 谱图，(b)为第三馏分的NMR光谱图，(c)为第四馏分的NMR光谱图。图8为从由亚麻籽油分离的非极性馏分提取的环亚麻肽的NMR光谱图。所述环亚 麻肽根据本发明的一实施方案通过依次洗涤和从硅胶色谱柱洗提而分离。图9为通过吸附于与亚麻籽油混合的硅胶上而提取，然后根据本发明的另一实施 方案从硅胶回收的环亚麻肽的NMR光谱图。所述环亚麻肽根据本发明的一实施方案通过从 硅胶色谱柱洗提而分离。图10包含从由亚麻籽油分离的非极性馏分提取的环亚麻肽的HPLC色谱图。所述 环亚麻肽根据本发明的一实施方案通过依次洗涤和从硅胶色谱柱洗提而分离(a)为第一 提取物的HPLC色谱图，(b)为第二提取物的HPLC色谱图，(c)为第三提取物的HPLC色谱 图。图11包含从由亚麻籽油分离的极性馏分提取的环亚麻肽的HPLC色谱图。所述环 亚麻肽根据本发明的一实施方案通过从硅胶色谱柱洗提而分离(a)为第一提取物的HPLC 色谱图，(b)为第二提取物的HPLC色谱图，(c)为第三提取物的HPLC色谱图。图12为从由亚麻籽油分离的极性馏分的第一提取物提取的环亚麻肽的HPLC色谱 图。所述环亚麻肽根据本发明的一实施方案通过从硅胶色谱柱洗提而分离。图13包含从由亚麻籽油分离的极性馏分提取，且根据本发明的一实施方案通过 用10%乙醇的乙酸乙酯溶液连续洗涤三次而分离的环亚麻肽的NMR光谱图(a)为第一提取物的NMR光谱图，(b)为第二提取物的NMR光谱图，(c)为第三提取物的NMR光谱图。图14包含显示以下效应的图表(a)环亚麻肽A对P21基因表达的效应，(b)环亚 麻肽C对P21基因表达的效应，和(c)环亚麻肽E对P21基因表达的效应。DMSO用作阴性 对照且喜树碱用作阳性对照。柱状图上的短线代表标准偏差。图15包含显示以下效应的图表(a)环亚麻肽A对凋亡(PUMA)基因的p53上调 调节剂的表达的效应，(b)环亚麻肽C对PUMA基因表达的效应，和(c)环亚麻肽E对PUMA 基因表达的效应。DMSO用作阴性对照且喜树碱用作阳性对照。柱状图上的短线代表标准偏差。图16包含显示以下效应的图表(a)环亚麻肽A对BCL_2a基因表达的效应，(b) 环亚麻肽C对BCL_2a基因表达的效应，和(c)环亚麻肽E对BCL-2 α基因表达的效应。 DMSO用作阴性对照且喜树碱用作阳性对照。柱状图上的短线代表标准偏差。图17为显示环亚麻肽A对线虫中HSP70A基因表达的效应的图表。柱状图上的短 线代表标准偏差。短线上方的字母指明通过使用单因素方差分析的数据分析所确定的显著 差异，其中成对多重比较是通过图基检验(Tukey test)进行。图18为显示环亚麻肽A的三维结构的图解，其是通过对由本发明的示例性方法产 生的环亚麻肽A晶体的X射线分析而产生。
具体实施例方式本发明涉及从例如油、脂肪、蜡和油脂等生物溶剂回收和浓缩高产率的单种疏水 性肽的方法。所述肽可从例如含有高内源含量的生物溶剂的亚麻籽等植物材料提取，或从 含有少量内源生物溶剂的材料提取。已知某些从植物离析的疏水性肽具有生物活性，在治疗上可潜在应用于各种哺乳 动物生理病症。得自亚麻籽油的环亚麻肽尤其可影响程序性细胞死亡或细胞凋亡，以便对 可能由损伤或休克产生的应激信号作出反应而保护多细胞生物体。细胞凋亡是细胞死亡的 一种控制机制，其在生命周期的所有阶段是必不可少的。过度的细胞凋亡会导致发育障碍， 而不足的细胞凋亡又会允许过度的细胞分裂，如癌症中所观察的。细胞凋亡调控性植物化 合物如环亚麻肽作为潜在的化学治疗剂是深受欢迎的。因此，用于回收和纯化具有调控细 胞的凋亡、尤其诱导细胞的凋亡的潜力的这样的疏水性肽的方法是有用且合乎需要的。此 外，优选从一组由植物提取的疏水性肽离析单种疏水性肽，因为每一单种肽可能对细胞基 因表达具有不同的生物活性和效应。因此，本发明涉及从由植物材料提取的油回收单种疏水性肽的方法，其中疏水性 肽可容易地从生物材料富集或回收。本发明涉及与所属领域技术人员当前可用的方法相 比，较不繁琐且产物产率较高的方法。本发明的一示例性实施方案涉及一种回收单种疏水性肽的简化方法。回收疏水性 肽的常用方法涉及从大量植物材料提取油，这不会导致肽产率很高。本文所公开的本发明 方法利用从植物材料提取大量油的策略，从所述油可提取大量的单种疏水性肽。使用物理 方法增加疏水性肽在油中的溶解度。所述方法包括(但不限于)压榨、研磨、乳化、挤压、掺 合和暴露于超声波、微波和红外辐射。包括例如调和和暴露于微波或红外辐射等的其它物 理处理在本发明的范围内。已知疏水性肽对氧化敏感。本发明的方法限制肽和来源植物材料在提取和分离期间暴露于氧，所述方法包括在提取油之前和期间用无氧气氛覆盖肽源材 料。举例来说，用真空移除空气或替换包含疏水性肽的溶液的上方气氛可显著提高所分离 疏水性肽的稳定性。本发明的一示例性实施方案涉及将提取的油分离成极性较高的馏分和极性较低 的馏分。我们已确定了这是有利的，因为对极性馏分和非极性馏分的光谱分析指示环肽的 极性相差很大，并且极低极性的肽存留于非极性馏分中，而较高极性的肽则被浓缩到极性 馏分中。因此，油分离成极性馏分和非极性馏分会将较低极性的疏水性肽浓缩到非极性馏 分中，所述疏水性肽可通过使非极性馏分流过色谱设备可控地且选择性地从非极性馏分中 分离。配置和改良所述方法以便在必要时能从油单步分离肽是在本发明的范围内的。合 适的改良例如为添加硅胶且将硅胶与提取的油直接混合，其中疏水性肽将附着于硅胶。然 后从负载肽的硅胶分离油。负载肽的硅胶可用一系列极性渐增的溶剂依序洗涤，其中选择 的每种溶剂都是为了溶解和洗提某些特定肽。或者，可将硅胶添加到从提取的油分离的非 极性馏分中并与其混合，其后将负载肽的硅胶与非极性馏分分离。负载肽的硅胶可用一系 列极性渐增的溶剂依序洗涤，其中选择的每种溶剂都是为了溶解和洗提某些特定肽。另一 种合适的选择是使从负载肽的硅胶溶解出的每种洗提馏分流过色谱设备，以进一步分离和 纯化单种疏水性肽。所属领域技术人员将认识到能够大规模制备型色谱分离方法，例如离 心分配色谱中的模拟移动床色谱。本发明的范围涵盖其它合适的分离所述化合物的实用色 谱方法。可以用色谱，尤其高效液相色谱(HPLC)测定每一单种疏水性环肽的色谱洗提特 征。HPLC数据可用于精确检测和定量单种疏水性环肽。所属领域技术人员了解也可使用例 如硅胶柱色谱和反相色谱等其它类型的色谱。本发明方法能够回收的疏水性环肽的量大于当前可用的方法所回收的量。举例来 说，布吕尔法(Brilhl process)与本发明的示例性方法的比较结果显示，布吕尔法从IOOg 亚麻籽油回收55mg粗肽馏分，从其中又分离出Ilmg环亚麻肽E。相比之下，本发明的示例 性方法能够从IOOg亚麻籽油回收146mg粗肽，从其中又回收到16. 7mg环亚麻肽E，这比布 吕尔法的回收率要高出51%。另外，还分离和纯化得到以下疏水性环肽(i) 20. 3mg环亚麻 肽 A ;(ii) 16. 3mg 环亚麻肽 C ； (iii) 3. 3mg 环亚麻肽 D ； (iv) 16. 7mg 环亚麻肽 E ； (ν) 1. Omg 环亚麻肽F ；和(vi) 6. Img环亚麻肽G。本发明的另一示例性实施方案涉及用本发明方法分离的单种环亚麻肽的治疗性 应用。更具体地说，本发明涉及使用所分离的疏水性环肽治疗与细胞凋亡调控相关的疾 病。在本发明的范围内，可筛选对于选定基因、尤其涉及细胞凋亡中的基因的表达具有调节 效应的根据本发明方法回收的单种环亚麻肽和其它环肽。本发明的一些实施方案涉及使 用根据本文所公开的方法分离和纯化的选定单种环亚麻肽来调节对细胞凋亡所必需的三 种特异基因(即肿瘤坏死因子α ( “？21”)、细胞凋亡的？53上调调节因子(“PUMA”)和 BCL-2 α )中的至少一种。Ρ21是全身炎症中所涉及的信号传导分子或细胞因子，且是一组 刺激急性期反应的细胞因子中的一员。Ρ21的主要作用是调控免疫细胞，但也能够诱导凋亡 性细胞死亡、诱导炎症和抑制肿瘤发生和病毒复制。Ρ21的调控异常和尤其产生过度与包括 癌症在内的多种人类疾病有关。PUMA是BCL-2蛋白质家族的促凋亡成员。BCL-2家族成员可形成异型二聚体或同型二聚体，并且充当多种细胞活动中所涉及的抗凋亡或促凋亡调控 因子。PUMA的表达受肿瘤抑制因子p53调控，且PUMA已显示与p53介导性细胞凋亡有关。 BCL-2 α或B细胞淋巴瘤2被认为是一种癌蛋白，并且是BCL-2家族的抗凋亡成员，其通过 干扰程序性细胞死亡来延长各种细胞类型的寿命。BCL-2ci的过度表达诱导细胞增殖和癌 症。鉴别因存在单种环肽而受到上调或下调的基因尤其适用于与凋亡下调有关的疾病，例 如神经变性疾病、血液病、AIDS、病毒感染、炎症性疾病、自体免疫疾病、癌症和组织损伤。本文所公开的一些实施例涉及从植物材料提取油的方法。所属领域技术人员了解 从例如亚麻籽等植物材料提取油会伴随实现所提取油中的疏水性肽的提取。实施例实施例1 用实验室螺旋式压榨机(laboratory expelIer press)从亚麻籽提取 亚麻籽油和肽用Komet 螺旋式压榨机(CA 59 G3 型；Komet 是德国 IGB Monforts Oekotec GmbH&Co.的注册商标)压榨亚麻籽以挤出油。使用布赫过滤漏斗(Buchner funnel filter)禾口Whatman #4滤 氏(Whatman是Whatman International Ltd. ,Maidstone,Kent, UK)过滤亚麻籽油，以从新鲜压榨的油中移除碎屑(也称为“渣滓”)。将经过滤的油放置于 真空下以降低氧化速率。实施例2 用己烷提取亚麻籽和亚麻籽中的肽使用咖啡研磨机研磨约5g亚麻籽以产生粗粉。将粗粉放置于烧杯中的宽提取器 套管中，向其中添加大约40到50毫升己烷。烧杯连接于用于提取油的Goldfisch提取器 (22166 型，Labconco Corp. ,Kansas City,Missouri,64132,USA) 将样品回流 5 小时。使 用回收套管回收溶剂，油留在烧杯中。亚麻籽的油含量为大约40%，而压榨粗粉的油含量为 大约12%。实施例3 用两级螺旋式压榨机从亚麻籽提取亚麻籽油和肽以每天24公吨的速率，将全亚麻籽导入商业油籽螺旋式压榨机中。来自这种类型 压榨方法的油被描述为冷榨油。由这种压榨处理所产生的粗粉含有大约20%的油。以每 天19吨的速率，使粗粉通过商业高速挤压机。挤压机的高摩擦作用引起粗粉被加热到大约 110°C。挤压机排出的粗粉通过调节式螺杆(conditioning screw)，其后将其引入第二螺旋 式压榨机。第二压榨机将粗粉的油含量从20%降到大约9%到10%。分析来自亚麻籽的第 一次和第二次压榨产生的油以确定环亚麻肽含量。本文所公开的以下实施例涉及用于从如上所公开由亚麻籽提取的油提取和回收 疏水性肽的方法。本发明教导使用依序洗涤以将特定疏水性肽洗提到特定馏分中，以便避 免对负载于硅胶上的所有疏水性肽使用昂贵且有时发生问题的色谱分离。实施例4 通过吸附于硅胶色谱柱从亚麻籽油分离环亚麻肽将用5%乙酸乙酯(“EtOAc”)的己烷溶液(700mL)稀释的亚麻籽油(700mL)负 载于硅胶柱(50g)上，且依次用10% (v/v)EtOAc的己烷溶液(300mL;馏分1)、50% (ν/ν) EtOAc 的己烷溶液(300mL ；馏分 2) ,100% EtOAc (200mL ；馏分 3)、10% 甲醇(“MeOH”)的二 氯甲烷(“DCM”)溶液(300mL ；馏分4)和20% MeOH的DCM溶液(200mL ；馏分5)洗提。在 每个洗提步骤之后，收集溶剂并蒸发。将一部分无溶剂的提取物溶解于氘化氯仿(“CDC13”) 中，且用于质子核磁共振(“NMR”)分析。将每种部分的无溶剂的残余物溶解于相同量的乙腈(IOmL)中，并各自以5微升的量注射于HPLC柱上(HPLC Agilent 1200系列；柱类型 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (反相柱)，柱尺寸4. 6 A· "150mm, 5 μ m粒度)。色谱条件为柱 流量0. 500ml/min ；溶剂 A 70. 0% (水)；溶剂 B 30. 0% (乙腈)。溶剂B时间表时间 溶剂B 流速0300. 55 30 0. 550 60 0. 560 100 0. 570 30 0. 575 30 0. 5馏分4存在NMR光谱峰(图1)表明存在富集的肽(1. 74g)。在馏分3和馏分5中 观察到较少量的肽。肽产率几乎比所属领域技术人员已知的当前方法高出2个数量级。实施例5 从馏分4移除磷脂将实施例4的馏分(1. 74g)溶解于丙酮中并搅拌30分钟，从而形成沉淀物。通 过过滤移除沉淀物并用丙酮清洗，之后真空浓缩每种份沉淀物和母液，并准备用于质子NMR 分析。低丙酮溶解度、高极性和NMR光谱揭示沉淀物是磷脂。从母液回收高度富集的肽 (1. 23g)，随后通过硅胶色谱纯化。将其依次用100%丙酮(馏分4A)、10% MeOH的丙酮溶 液(馏分4B)和20% MeOH的丙酮溶液(馏分4C)洗提。图2所示的质子NMR结果表明所 有馏分都具有高肽含量(图2)。在第三个丙酮馏分中观察到最高的肽含量。实施例6 通过硅胶柱色谱从亚麻籽油最大限度地回收环亚麻肽将经5 % EtOAc的己烷溶液(800mL)稀释的亚麻籽油(800mL)负载于硅胶柱 (IOOg)上，并用10% (v/v) EtOAc的己烷溶液(1L ；馏分1)、50% (v/v) EtOAc的己烷溶液 (1L ；馏分2)、100% EtOAc(lL ；馏分3)和10 % MeOH的DCM溶液(1L;馏分4)依次洗提。 使用质子NMR分析，发现馏分3和4是由高度富集的肽组成(分别为686mg和1. 686g)(图 3)。从SOOmL亚麻籽油所回收的肽的总质量为2. 312g。实施例7 通过硅胶柱色谱从亚麻籽油大规模回收环亚麻肽将Trysil(40kg, W. R. Grace Corporation)添加到亚麻籽油(2000L)中，并在60°C 下搅拌混合物2小时，然后过滤以回收硅胶。负载油的硅胶的质量为78kg。经过滤的Trysil 储存在桶中以供进一步提取。MALDI-MS显示经过滤的亚麻籽油(1960L)不含肽。将过滤获 得的固体(250g)放置于快速色谱柱中，用100%己烷(4L己烷，馏分1) ,20% EtOAc的己烷 溶液(20 80，ν v，4L总体积，馏分2)和100%乙醇(4L乙醇，馏分3)依次洗提。发现 馏分3(20g)富含环肽(图4)。通过外推78kg负载油的硅胶从2000L亚麻籽油的回收率， 全部馏分将产生6. 4kg富含肽的物质和3. Okg纯肽。实施例8 离析单种环亚麻肽通过HPLC在连接于UV/Vis检测器的250 X 30mm, 10 μ m, Pr印-ODS柱上在254nm 波长下进一步分离从实施例6回收的肽。色谱的进行是以乙腈(“ACN”)于水中的混合物 (30 70, ν ν)开始，然后在120分钟内增加ACN至65%。质谱和质子NMR结果揭示6 种环肽环亚麻肽 F (43% ACN ;MW 1084.46)；环亚麻肽 G(44. ACN ;MW 1098.49)；环亚麻Ι C (45. 4% ACN ；MW 1074.57)；环亚麻肽 E (49. 2 % ACN ;MW 977.54)；环亚麻肽 D (51. 9% ACN ；MW 1064.53)；和环亚麻肽A (59. 3 % ACN ;MW 1040.64)。收集不同馏分并冷冻干燥。 IOOOmL(888g)油中不同环肽的量为18011^环亚麻肽六(“0^”)； 145mg环亚麻肽C(“CLC”)； 29mg 环亚麻肽 D( “CLD”)； 147. 5mg 环亚麻肽 E( “CLE”)；8. 5mg 环亚麻肽 F( “CLF”)；禾口 53.5mg环亚麻肽G( “CLG”)。图5显示这些不同环肽的化学结构。以下实施例公开一种从亚麻籽油提取和回收疏水性肽的不同方法。我们已经确定 亚麻籽油的非极性馏分含有大部分(即便不是全部)环肽，且极性馏分含有可忽略量的环 肽或不含环肽。本发明将亚麻籽油的非极性馏分与硅胶直接混合，所述混合物然后负载于 柱上并依次洗涤以洗提疏水性肽。实施例9 通过吸附于硅胶色谱柱上并依次洗涤，从亚麻籽油的非极性馏分分离 环亚麻肽用磁力搅拌器混合亚麻籽油(IKg)与HCl-MeOH-H2O溶液(5:5: 90 ；w/w) 0离 心(20分钟，4000rpm，22°C )混合物以分离极性相和非极性相。极性馏分作为半固体白色 块体沉降，用DCM(2X300mL)提取。在真空压力下浓缩DCM馏分，将其溶解于MeOH中以执 行高效液相色谱(“HPLC”)，且溶解于⑶Cl3中以执行质子NMR分析。用NH3水溶液(28%; PH 9)碱化半固体块体的另一馏分，并用DCM再次提取，在真空压力下浓缩，溶解于MeOH中 以执行HPLC，并溶解于⑶Cl3中以执行质子NMR分析。极性馏分显示含有可忽略量的环肽 或不含环肽。用磁力搅拌器混合在离心后获得的亚麻籽油的非极性馏分与硅胶(50g)，并负载 于柱上。使油通过柱，并用己烷首先洗涤柱中存在的硅胶，依次用10% EtOAc的己烷溶液 (10 90，300mL，馏分 1)、20% EtOAc 的己烷溶液(20 80，300mL，馏分 2)、50% EtOAc 的 己烷溶液(50 50，500mL,馏分 3)、100% EtOAc (500mL,馏分 4)和 10% MeOH 的 DCM 溶液 (10 90，1000mL，馏分5)洗提。将一部分不含溶剂的馏分溶解于⑶Cl3中以执行质子NMR 分析，且溶解于MeOH中以执行HPLC。根据光谱数据，发现馏分2、3和4富含环肽(分别参 看图6 (a)、6 (b)、6 (c))。进一步纯化这些馏分以分离不同的环肽，主要是环亚麻肽A。实施例10 通过吸附于硅胶色谱柱上且依次洗涤，从亚麻籽油的非极性馏分分离 环亚麻肽用磁力搅拌器混合亚麻籽油(IKg)与HCl-MeOH-H2O溶液(5:5: 90 ；w/w) 0离 心(20分钟，4000rpm，22°C )混合物以分离极性相和非极性相。极性馏分作为半固体白色 块体沉降，将其丢弃，因为如实施例9所述，早期光谱结果显示这些馏分含有可忽略量的环 肽或不含环肽。用磁力搅拌器混合在离心后获得的亚麻籽油的非极性馏分与硅胶(50g)，并负载 于柱上。使油通过柱，并用己烷(IL)和10% EtOAc的己烷溶液(IL)首先洗涤柱中存在 的硅胶，然后依次用20% EtOAc的己烷溶液(20 80，1L，馏分1)、50% EtOAc的己烷溶 液(50 50，300mL，馏分 2)、100% EtOAc(lL，馏分 3)和 10% MeOH 的 DCM 溶液(10 90， IOOOmL,馏分4)洗提。将一部分不含溶剂的馏分溶解于CDCl3中以执行质子NMR分析，且溶 解于MeOH中以执行HPLC。根据光谱数据，发现馏分2、3和4富含环肽(分别参看图7 (a)、 7 (b)、7 (c))。进一步纯化这些馏分以分离不同的环肽，主要是环亚麻肽A。实施例11 通过吸附于硅胶色谱柱上且依次洗涤，从亚麻籽油的非极性馏分分离环亚麻肽用磁力搅拌器混合亚麻籽油(2Kg)与HCl-MeOH-H2O溶液(2. 5 2. 5 90 ；w/w)。 离心(20分钟，4000rpm，22°C)混合物以分离极性相和非极性相。极性馏分作为半固体白 色块体沉降，将其丢弃，因为如实施例9所述，早期光谱结果显示这些馏分含有可忽略量的 环肽或不含环肽。用磁力搅拌器混合在离心后获得的亚麻籽油的非极性馏分与硅胶(IOOg)，并负载 于柱上。使油通过柱，并用己烷(2L)首先洗涤柱中存在的硅胶，且依次用50% EtOAc的己 烷溶液(50 50，2L，馏分 1)、100% EtOAc (2L，馏分 2)和 10% MeOH 的 DCM 溶液(10 90， 2L，馏分3)洗提。将一部分不含溶剂的馏分溶解于CDCl3中以执行质子NMR分析，且溶解 于甲醇中以执行HPLC。根据光谱数据，发现馏分2、3和4富含环肽(图8)。进一步纯化这 些馏分以分离不同的环肽，主要是环亚麻肽A。实施例12 通过吸附于硅胶色谱柱上且依次洗涤，从亚麻籽油分离环亚麻肽用磁力搅拌器混合未经任何预处理的亚麻籽油(2Kg)与硅胶(IOOg)，并负载于柱 上。使油通过柱，并用己烷(2L)首先洗涤柱中存在的硅胶，且用EtOAc-己烷(50 50、 60 40,70 30,80 20,90 10 ;2L ；馏分 1)、100 % EtOAc (100 0，2L，溜分 2)、10 % MeOH 的 DCM 溶液(10 90，2L，馏分 3)和 MeOH-DCM-氢氧化铵(20 80 1，1L，馏分 4) 进行梯度洗提。将一部分不含溶剂的馏分溶解于CDCl3中以执行质子NMR分析，且溶解于 甲醇中以执行HPLC。根据光谱数据，发现馏分2和3富含环肽(图9)。进一步纯化这些馏 分以分离不同的环肽，主要是环亚麻肽A。实施例13 从亚麻籽油的非极性馏分和极性馏分分离环亚麻肽分三个平行组，用酸性MeOH提取亚麻籽油(300mL)。在各组中，将亚麻籽油 (IOOmL)与HCl-MeOH溶液(5 95 ；w/w)在分液漏斗中一起振荡。用酸性MeOH(1 X IOOmL) 提取第一组(提取物1)；用酸性Me0H(2X100mL)提取第二组(提取物2)；并用酸性 MeOH(3X IOOmL)提取第三组(提取物3)。用磁力搅拌器混合非极性层与硅胶(5%，w/ v)，并使用布赫漏斗过滤。用EtOAc-己烷(20 80)首先洗涤存在的硅胶，然后用IOOmL Me0H-DCM(10 90)洗涤。收集滤液并通过真空蒸发移除溶剂。将残余物溶解于MeOH中并 执行HPLC。提取物1、提取物2和提取物3富含环肽，其中提取物1所含的量最高(图10)。再次用己烷(2 X IOOmL)提取极性馏分提取物1A、提取物2A和提取物3A以移除残 余的油。对不含油的极性馏分进行HPLC以观察任何环肽的存在情况。所有馏分都含有环 肽，其中提取物IA所含的量最高(图11)。实施例16 通过吸附于硅胶上且依次洗涤而从 亚麻籽油分离环亚麻肽分三个平行组，用硅胶提取亚麻籽油(300mL)。在各组中，用磁力搅拌器混合亚麻 籽油(IOOmL)与硅胶(5%，w/v)，并使用布赫漏斗过滤。首先用EtOAc-己烷(20 80)洗涤 存在的硅胶，然后用 IOOmL Me0H-DCM(10 90)洗涤。用 EtOAc-己烷(20 80) (IXlOOmL) 洗涤第一组，然后收集滤液，即提取物1 ；用EtOAc-己烷(20 80) (2 X IOOmL)洗涤第二组 以收集提取物2 ；并用EtOAc-己烷(20 80) (3 X IOOmL)洗涤第三组以收集提取物3。通 过真空蒸发干燥所收集的滤液。将残余物溶解于乙腈中并进行HPLC。提取物1富含环肽， 而提取物2和提取物3都不含任何肽(图12)。实施例14 用于从亚麻籽油分离和纯化环肽的简化纯化方法
在200mL烧杯中混合亚麻籽油(IOOmL)与硅胶(5%，w/v)，并用磁力搅拌器在室温 下搅拌混合物30分钟。使用布赫漏斗(Whatman· #1滤纸，直径65mm)过滤油-硅胶溶液。
首先用EtOAc-己烷(20 80)洗涤布赫漏斗中的硅胶以移除植物油和低极性物质。此后， 如下所述用极性渐增的溶剂反复洗涤硅胶。为了测定从每种馏分洗提的溶剂中肽的存在情况，收集馏分并通过真空蒸发移除 溶剂。将每种部分的不含溶剂的残余物溶解于相同量的乙腈(IOmL)中，并将5μΜ注射于 HPLC 柱(HPLC Agilent 1200 系列；柱类型Z0RBAX EclipseXDB_C18 (反相柱)；柱尺寸 4. 6 A-150mm, 5 μ m粒度(Z0RBAX 是 Agilent Technologies Inc. ,Santa Clara，CA，USA 的 注册商标))上。在本实施例和实施例18中，使用HPLC作为分析工具以测定对每种馏分洗 提得到何种肽(基于表1所示的保留时间)，并定量每种馏分中每种环肽的量。表1 环肽标准品的保留时间(分钟)
环肽ACDEFG保留时间 (tR)60.1942.1853.1248.8437.0439.87 实施例15 用于从亚麻籽油分离和纯化环肽的简化纯化方法在200mL烧杯中混合亚麻籽油(IOOmL)与硅胶(5%，w/v)，并用磁力搅拌器在室 温下搅拌混合物30分钟。使用布赫漏斗(Whatman #1滤纸，直径65mm)过滤油-硅胶溶 液。首先用EtOAc-己烷(20 80)洗涤硅胶，然后用10% EtOH的EtOAc溶液洗涤。丢弃 用20% EtOAc的己烷溶液(IOOmL)初次洗涤而获得的滤液的第一馏分。通过连续用10% EtOH的EtOAc溶液洗涤而收集滤液的后续馏分，即提取物1 (IOOmL)、提取物2 (IOOmL)和提 取物3(100mL)。收集滤液并通过真空蒸发移除溶剂。将每种部分的不含溶剂的残余物溶 解于相同量的乙腈(IOmL)中，并如实施例17所述进行HPLC分析，以检查环肽的提取效率。 根据HPLC色谱图，发现提取物1富含环肽A和环肽C，而提取物2主要含有环肽C (分别参 看图13 (a)、13 (b)、13 (c))。此结果为环肽C以及环肽A的大规模简单纯化提供指导。实施例16 具有改良聚合性质的亚麻籽油如实施例1所述产生亚麻籽油，并将其分成两个I-L样品。使一个亚麻籽油样品 通过含有50g硅胶的柱，并在其从柱流出后进行收集。第二样品用作对照参照油。对流出 的亚麻籽油的分析显示硅胶处理后流出的油不含环亚麻肽。使用3号歇尔杯(Shell cup) 在28°C下测定这两个亚麻籽油样品的粘度。将这两个样品放置于歇尔杯中，加热到160°C 并在所述温度下保持300分钟，然后冷却到28°C。冷却后，重复测量粘度。数据显示含有 环亚麻肽的对照参照油的粘度在热处理后没有改变。然而，移除环亚麻肽的油的粘度在热 处理后增加。这些数据表明含有环亚麻肽的亚麻籽油比移除环亚麻肽的亚麻籽油更慢地聚
I=I O实施例17 具有标准化含量的环亚麻肽和/或环亚麻肽状况的生物活性亚麻籽油本文公开的硅胶吸附方法能够(a)从亚麻籽油完全移除环亚麻肽；和(b)从回收 的馏分分离、鉴别和定量单种环亚麻肽。所属领域技术人员将了解这些方法可经调适以用 于产生具有标准化量的选定环亚麻肽的亚麻籽油，从而基于重量比，将一种或一种以上经分离和定量的环亚麻肽重新添加到先前移除所有环亚麻肽的亚麻籽油中。我们已经发现， 通过添加易于由质谱分析测量的内标物，分析的精确度得到了很大的提高。特定来说，我们 已经发现，缬氨霉素(valinomycin)是用于测定亚麻籽油的环亚麻肽含量的理想标准物。实施例18 用环亚麻肽A、C和E诱导人类肺上皮癌细胞系的凋亡以下实施例涉及使用如本文所公开经回收和加工的选定的纯化单种环亚麻肽来 调节应激基因的表达。使线虫(Nematode) (Caenorhabditus elegans)培养物暴露于以下物 质中的一种持续2小时DMS0 (阴性对照)、0. 1 μ M环亚麻肽A、1. 0 μ M环亚麻肽Α、10. 0 μ M 环亚麻肽A和100. 0 μ M环亚麻肽Α，然后进行培养以评估环亚麻肽A对线虫的热休克基因 HSP70A表达的效应。对照处理为未经改变的培养基。结果显示于图17中，其中显而易见的 是，向培养基中添加0. 1 μ M或10. 0 μ M环亚麻肽A会导致Hsp70A蛋白的产生增多30%，而 添加1. 0 μ M则导致这种热休克蛋白的产生增多3. 5倍。实施例19 用环亚麻肽A、C和E诱导人类肺上皮癌细胞系的凋亡本文公开的以下实施例涉及一种显示环亚麻肽与癌细胞系的凋亡诱发的关系的 方法。细胞培养从ATCC(Manassas，VA，USA)获得人类支气管上皮腺癌细胞 系(Calu-3)，并在50cm2塑料培养烧瓶中，在补充有10%胎牛血清、谷氨酰胺(4mM ； Sigma-Aldrich,加拿大)和青霉素(100U mL-1)-链霉素(IOOyg mL-1)溶液 (Sigma-Aldrich，加拿大)的改良伊格培养基(modified eagle，s medium, MEM)中培养。 细胞以IO6个细胞/毫升的初始密度培养，并在第3天添加新鲜培养基。细胞在培养箱中 在37°C、5% CO2和100%湿度下生长。化学处理用不同浓度(0-100 μ M)的环亚麻肽A ( “0^”)、环亚麻肽((“CLC”) 或环亚麻肽E (“CLE”)处理Calu-3细胞。分别使用喜树碱(Sigma-Aldrich，加拿大；4 μ M) 和二甲亚砜(DMSO)作为阳性对照和阴性对照。喜树碱适合在测试某些化合物对癌细胞系 中凋亡的效应的研究中用作阳性对照。喜树碱是一种细胞毒性喹啉生物碱，抑制DNA拓扑 异构酶I(topo I)且已显示显著的抗癌活性。喜树碱的两种类似物已获批准用于癌症化学 疗法中。DMSO是常用的阴性对照且用作溶解肽的溶剂，因为肽不溶于水。定量实时逆转录酶聚合酶链反应(qRTPCR)使用RNeasy Mini试剂盒(RNeasy是 德国Qiagen GmbH Corp.，Hilden, Fed. Rep.的注册商标)，根据制造商的说明书提取RNA0 用琼脂糖凝胶电泳证实RNA的完整性，并用NanoDrop 分光光度计(NanoDrop是NanoDrop Techologies LLC.，Wilmington, DE, USA 的注册商标)定量 RNA0 在 DNase 处理后，使用 QuantiTect. 逆转录试剂盒(QuantiTect 是德国 Qiagen GmbH Corp.，Hilden，Fed. R印的注 册商标)，根据制造商的说明书，在42 V下将mRNA逆转录30分钟。将此cDNA用于qRTPCR， 以便使用 QuantiFast. SYBR Green PCR试剂盒(SYBR是Molecular Probes Inc. ,Eugene, OR, USA的注册商标)，根据制造商的说明书来表达肿瘤坏死因子α (Ρ21 ；GenBank登记号 S67388)(图 14) ,PUMA (GenBank 登记号 AF354655)(图 15)和 BCL-2 α (登记号 ΝΜ_000633) (图16)基因。使用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH ^enBank登记号ΝΜ_002046)作为 参照看家基因。使用以下引物对进行反应对于Ρ21是5’ -ATG TCA GAA CCG GCT GGG-3’ 和 5，-TCC CAG GCG AAG TCACCC-3，，对于 PUMA 是 5，_ATG AAA TTT GGC ATG GGG TCT-3，禾口 5，-GCC TGGTGG ACC GCC C_3，，对于 GAPDH 是 5，-ATG GGG AAG GTG AAG-3，和 5，-GACAAGCTT CCC GTT 0103，，且对于80^-2是5，-八丁6 GCG CAC GCT GGG AGAAC-3，禾口 5，-GCG ACC GGG TCC CGG GAT GC-3，。使用MX3005P, LightCycler_ (MX3005P是Stratagene alifornia Corp. ， La Jolla, CA, USA WSil^fe ；LightCycIer ^tIH Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Fed. Rep.的注册商标)进行实时PCR分析，程序设定为在95°C下cDNA变性5分 钟，随后经由45个以下循环扩增目标DNA 在95°C下变性30秒、在55°C下退火30秒和在 60°C下延伸45秒。使用MxPro软件，在校正GAPDH表达之后计算相对表达水平。实施例20 单种环亚麻肽的微阵列分析当前微阵列设计平台便于设计基因表达阵列以用于分析目的化合物和其对许多 已知基因的影响。因此在微阵列分析中使用环亚麻肽A、环亚麻肽C和环亚麻肽E，以测定 其对人类肺腺癌细胞的凋亡调控中所涉及的基因的表达不足和过度表达的影响(表2)。
表。‘H
表2 暴露于CLP-A、-C和-E的人类肺腺癌细胞(Calu-3)中上调或下调的基因列
分别指示过度表达和表达不足的基因。基因CLP-ACLP-CCLP-ECDEB+++BAK+无无Fas+++FASLG+无无TNF+++TP53BP2+++TP53++无CASPlO无+无CIDEA无++HRK无++BCL-2+_-针对微阵列检查所选择的基因是促凋亡基因或抗凋亡基因，包括(i)BAK(Bcl_2 同源拮抗剂/扼杀剂)，一种Bcl-2家族的促凋亡基因；(ii)Fas配体(FASLG)和Fas受体， 其中Fas配体与其受体的结合诱导细胞凋亡；(iii)TNF(肿瘤坏死因子α或Ρ21，如上所 述)；(iv)TP53BP2基因，其编码ρ53相互作用蛋白ASPP(p53的凋亡刺激蛋白)家族的成 员；(ν) TP53基因，其编码p53，p53是一种肿瘤抑制蛋白，其涉及参与癌症预防且能够在DNA 损伤被证明无法修复的情况下引发凋亡；(vi)CASPlO，其编码在细胞凋亡的执行阶段中起 中心作用的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶；(vii)CIDEA，其编码已被显示激活凋亡的小鼠蛋 白CIDEA的同系物；(viii)HRK，一种促凋亡基因，其编码经由与死亡抑制蛋白相互作用而 调控细胞凋亡的蛋白；和(ix)BCL-2，其可编码促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白。实施例21 再结晶环亚麻肽A在约22°C下将根据实施例8所述的方法从亚麻籽油分离和回收的50mg环亚麻肽 A样品(50mg)溶解于5mL甲醇中。将0. 2mL水等份缓慢添加到环亚麻肽-甲醇溶液中，然 后缓慢蒸发所得混合物。约48小时后开始形成环亚麻肽A晶体。用X射线分析系统检查 如此产生的环亚麻肽A晶体样品。图18显示由Z射线分析产生的环亚麻肽A的三维结构。
虽然已参照示例性实施方案描述了本发明，但是应了解可对本文公开的示例性实 施方案进行各种方法改变和变更，所述示例性实施方案仅受随附权利要求书的范围限制。
权利要求
从生物来源材料分离和回收单种环肽的方法，所述方法包含以下步骤从生物来源材料提取内源性油；收集所述经提取的油；从所述经提取的油分离环肽；和从所述经分离的环肽回收单种环肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法另外包含纯化和精制从所述经提取的油 回收的所述单种环肽。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法另外包含在所述提取步骤之前将选定的 油与所述生物来源材料混合。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物来源材料是选自由种子、坚果、根、果实、 果肉柄、乳胶和叶组成的组的植物材料。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物来源材料是亚麻籽。
6.根据权利要求1所述的方法，其中使用至少一种物理方法从植物材料提取所述油。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述至少一种物理方法选自由压榨、研磨、乳化、 挤压、掺合、调和和暴露于超声波、暴露于微波和暴露于红外辐射组成的组。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法另外包含在所述油的所述提取期间和从 所述经提取的油分离环肽期间，限制所述油暴露于氧。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包含在提取和分离所述环肽之前和期间 用无氧气氛覆盖所述植物材料和所述经提取的油。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包含以下步骤之一用真空移除空气， 和用氮气替换所述经提取的油的上方的气氛。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述环肽是通过溶解于选定溶剂中而从所述经 提取的油分离。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述溶剂选自由烃、酮、低碳脂肪醇、酯、卤化溶 剂、醚、芳香物和其组合组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述烃包括由丙烷、丁烷、己烷和其异构体组成 的组。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述酮包括由丙酮、2-丁酮和甲基乙基酮组成 的组。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述低碳脂肪醇包括由甲醇、乙醇、正丙醇、异 丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇、戊醇、异戊醇和活性戊醇组成的组。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述酯包括由乙酸乙酯和三乙酸甘油酯组成的组。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述卤化溶剂包括由氯仿、二氯甲烷和四氯化 碳组成的组。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述醚包括由二嗎.烧、四氢呋喃、二甲醚和乙醚 组成的组。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述芳香物包括由苯、二甲苯和甲苯组成的组。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述环肽是通过物理方法从所述经提取的油分罔。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述物理方法选自由硅胶柱色谱、高效液相色 谱和反相色谱组成的组。
22.从植物材料分离和收集单种环肽的方法，所述方法包含以下步骤 从生物来源材料提取油；从经提取的油回收非极性馏分； 从所述非极性馏分分离环肽；和 从经分离的环肽回收单种环肽。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法另外包含纯化和精制从所述非极性馏 分回收的所述单种环肽的步骤。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物来源材料选自由种子、坚果、根和叶组 成的组。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述生物来源材料是亚麻籽。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述经提取的油的所述非极性馏分的所述回收 另外包含以下步骤将所述经提取的油与吸附剂混合，从而至少一些环肽附着于所述吸附剂上； 分离所述油和所述附着有环肽的吸附剂；使至少一种溶剂流过所述附着有环肽的吸附剂，从而至少一些一种类型的环肽从所述 吸附剂回收到所述溶剂中；和从所述溶剂分离所述至少一些所述一种类型的环肽。
27.根据权利要求26所述的方法，其中选定的多种溶剂依次流过所述附着有环肽的 吸附剂，从而通过组成所述多种溶剂的每种溶剂从所述吸附剂回收至少一些一种类型的环肽。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述吸附剂是硅胶。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述溶剂选自由水、乙腈、乙酸乙酯、乙醇、己 烷、甲醇、二氯甲烷、氢氧化铵和其组合组成的组。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述溶剂是乙酸乙酯与己烷的组合。
31.根据权利要求26所述的方法，其中所述溶剂是乙醇与乙酸乙酯的组合。
32.根据权利要求27所述的方法，其中所述多种溶剂包含具有渐增极性的溶剂。
33.根据权利要求22所述的方法，其中所述方法另外包含以下步骤 将所述经提取的油分离成极性馏分和非极性馏分；从所述经提取的油回收所述极性馏分； 从所述极性馏分分离环肽；和 从所述经分离的环肽回收单种环肽。
34.根据权利要求33所述的方法，其中通过混合所述经提取的油与化学溶液所述经提 取的油被分离成极性馏分和非极性馏分。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述化学溶液包含盐酸、甲醇和水的组合。
36.根据权利要求33所述的方法，其中混合己烷与所述极性馏分，从而从所述极性馏 分分离环肽。
37.通过根据权利要求1和21之一所述的方法从亚麻籽油回收的环亚麻肽，所述环亚 麻肽经配置以用于调节与细胞凋亡有关的哺乳动物生理病症。
38.根据权利要求37所述的环亚麻肽，其中所述生理病症选自由组织损伤、神经变性 疾病、血液病、AIDS、病毒感染、炎症性疾病、自体免疫疾病和癌症组成的组。
39.根据权利要求38所述的环亚麻肽，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、肺癌、神经胶 质瘤、肝癌、成神经细胞瘤、白血病、淋巴瘤和前列腺癌组成的组。
40.根据权利要求37所述的环亚麻肽，其中所述环亚麻肽选自由环亚麻肽A、环亚麻肽 C、环亚麻肽D、环亚麻肽E、环亚麻肽F和环亚麻肽G组成的组。
41.具有根据图18的三维结构的环亚麻肽。
42.改性亚麻籽油，其包含最低浓度的至少一些的至少一种选定环亚麻肽，所述改性亚 麻籽油是由以下步骤产生将亚麻籽油分离成极性馏分和非极性馏分； 从经提取的油回收所述非极性馏分； 从所述非极性馏分分离至少一些的至少一种环亚麻肽； 回收和定量所述至少一些的所述至少一种从所述非极性馏分分离的环亚麻肽； 混合不含环亚麻肽的亚麻籽油与选定部分的经回收的至少一些的所述至少一种从所 述非极性馏分分离的环亚麻肽。
43.改性亚麻籽油，其包含最低浓度的至少一些的至少一种选定环亚麻肽，所述改性亚 麻籽油是由以下步骤产生将亚麻籽油分离成极性馏分和非极性馏分； 从经提取的油回收所述极性馏分； 从所述极性馏分分离至少一些的至少一种环亚麻肽； 回收和定量所述至少一些的所述至少一种从所述极性馏分分离的环亚麻肽； 混合不含环亚麻肽的亚麻籽油与选定部分的经回收的至少一些的所述至少一种从所 述极性馏分分离的环亚麻肽。
44.一种改性亚麻籽油，其包含最低浓度的至少一些的至少一种选定环亚麻肽，所述改 性亚麻籽油是由以下步骤产生将亚麻籽油分离成极性馏分和非极性馏分； 从经提取的油回收所述非极性馏分； 从所述非极性馏分分离至少一些的至少一种环亚麻肽； 回收和定量所述至少一些的所述至少一种从所述非极性馏分分离的环亚麻肽； 从所述经提取的油回收所述极性馏分； 从所述极性馏分分离至少一些的至少一种环亚麻肽； 回收和定量所述至少一些的所述至少一种从所述极性馏分分离的环亚麻肽； 混合不含环亚麻肽的亚麻籽油与以下物质中的至少一种选定部分的经回收的至少一 些的所述至少一种从所述非极性馏分分离的环亚麻肽，和选定部分的经回收的至少一些所 述至少一种从所述极性馏分分离的环亚麻肽。
全文摘要
本发明涉及从植物材料分离和回收单种环肽的方法，所述方法包含以下步骤(a)从植物材料提取油；(b)将提取的油分离成非极性馏分和极性馏分；(c)从非极性馏分分离和回收环肽；和(d)从极性馏分分离和回收环肽。所述方法适用于从亚麻籽油分离和回收单种环亚麻肽(cyclolinopeptide)。单种环亚麻肽适用于调节与细胞凋亡相关的生理障碍。可通过混合不含环亚麻肽的亚麻籽油与至少一种用本文公开的方法分离和回收的环亚麻肽来产生改性亚麻籽油。
文档编号C11B1/10GK101945888SQ200880126759
公开日2011年1月12日 申请日期2008年12月22日 优先权日2007年12月21日
发明者云华·贾, 南希·泰勒, 吉姆·埃尔德, 建恒·沈, 萨拉伯杰特·辛格, 辛西娅·肖克, 马丁·J·雷尼 申请人:萨斯喀彻温大学