本发明涉及染色工艺领域，尤其是一种区分羊绒皮质细胞的染色方法。
背景技术：
目前，对羊毛的区分正、副皮质细胞的研究很多，主要有的染料有2％氯化金水、亚甲基蓝、还原-银染色等。但是对羊绒区分正、副皮质细胞的研究还没有报道。羊毛纤维由约含80～90％的皮质层和10％左右的鳞片层以及少量的纤维表面膜组成。羊毛从外到内的由鳞片层和皮质层组成，鳞片层的存在使羊绒具有独特的毡缩性能而皮质层是组成羊毛的主体，对羊毛纤维的物理化学和机械性能起着决定作用。羊毛的外在形态特征是由其内部结构决定的，因此皮质层和皮质细胞的研究就十分重要了。羊毛的皮质层和皮质细胞包含着正皮质层和正皮质细胞以及副皮质层和副皮质细胞。在羊毛中正、副皮质细胞的含量约2:1，在羊毛纤维结构中呈双边分布。正皮质层分布在卷曲羊毛卷曲波的外侧，副皮质层分布在卷曲波的内侧。由于两部分在结构上的差异，正、副皮质细胞的受力情况不同，可能是导致羊毛弯曲的根本原因。本文根据羊毛的基本特性，深入研究羊绒的皮质细胞的结构特征。从羊绒的皮质细胞的含量和分布的结构进行分析其弯曲的原因显得尤为重要。羊绒从外到内分为两层，外表是由鳞片层构成，内层是由皮质细胞层构成。羊绒的鳞片层由片状鳞片细胞组成，鳞片细胞的抱合力很强对羊绒的皮质细胞主要起保护作用。鳞片层容易被酸、碱、氧化剂、还原剂破坏。由于鳞片层和皮质层之间有非均一性的细胞粘合物，即细胞间质。细胞粘合物甘氨酸和酪氨酸含量很高，甲酸是二者的可溶物。甲酸对皮质细胞也有腐蚀作用，所以要严格把控甲酸回流的时间，本文中采用高效快速的甲酸回流和超声波震荡相结合的方法进行破坏细胞间质，并溶胀和软化鳞片，从而将鳞片层剥离，同时也不破坏皮质细胞，使皮质细胞可以有效的染色。因此必须先对羊绒进行脱鳞片，使皮质细胞能够暴露出来，让染料可以充分与皮质细胞结合，hiroshisakabe等通过碱性染料甲基蓝和孔雀绿对经甲酸和蛋白酶处理的美利奴羊毛的双边染色机制进行了研究。正、副皮质细胞中非角质化蛋白质网络结构存在差异，尤其是正、副皮质细胞间结构的不同，正皮质细胞层的细胞间质结构的渗透性比副皮质细胞层的渗透性好，它提供了染料的通道和结合基，在碱性染料的染色中起着至关重要的作用，细胞间质的双边分布最终导致了染色密度的不同。本试验中1％亚甲基蓝溶液是碱性染料，所以正皮质细胞被染成深蓝色，副皮质细胞被染成浅蓝色。
目前，对羊毛区分正、副皮质细胞的染色方法一般为如下的过程。
第一步，羊毛在染色前用实验室常规方法进行脱脂和除杂质，任意选取羊毛5g，卷入滤纸筒中，在索式提取器中先用乙醚提取8h，每小时循环8-10次，然后在用无水乙醇提取8h，每小时8-10次，取出，拣去杂质。将上述试剂在烧杯中用50℃蒸馏水反复洗涤5次，每次3min，然后移入浓度为5％的精制烷基苯磺酸钠(不含碱，防止纤维损伤)溶液中，45℃洗涤5次，每次5min，再用蒸馏水(50℃)洗涤5次，每次5min，以去除吸附的烷基苯磺酸钠。必须注意，在上述处理温度勿高，并避免剧烈搅动，否则发生毡缩，则试验就很难进行。净化的试样脱水后晾干。
第二步，甲酸回流处理：取精制的羊毛品约1g，置于容量为250ml的三角瓶中，加入已蒸馏过的浓度为88％的甲酸100ml，加热至沸腾(107℃)，回流处理。回流的目的是避免甲酸的蒸发并保证条件一致。回流煮沸30min，取出试样，置于500ml的聚乙烯塑料瓶中，再注入50ml的甲酸，用超声震荡仪(电流300ma)30min，取出试样用蒸馏水充分洗净，脱水干燥，在显微镜下观察羊毛鳞片的剥离完全，用亚甲基蓝染色，正皮质细胞被染成深蓝色，副皮质细胞被染成浅蓝色。研究中发现正、副皮质细胞在酸碱方面存在显著性差异，正皮质层反映出耐碱性很差，副皮质层具有较强的耐碱性。为了验证正、副皮质细胞在酸碱条件的变化，首先将羊毛皮质层用亚甲基蓝染色，将染色试样放在载玻片上，盖上盖玻片，在试样上滴加1％的醋酸溶液，在显微镜下观察发现经甲酸回流处理的羊毛皮质细胞沿羊毛长度上的分布与原毛相反，副皮质层分布在卷曲羊毛卷曲波的外侧，正皮质层转向卷曲波的内侧。若向染色的皮质细胞层滴加1％naoh溶液，在显微镜下发现正皮质层迅速膨胀。正皮质层迅速转向卷曲波的外侧，并失去其卷曲形状，成为圆环状，正皮质层出现腐蚀破坏。
以上方法中，脱脂时间过长，导致染色工艺费时、费工、费钱，若将该工艺直接运用于羊绒的染色，也必然存在以上问题。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种区分羊绒皮质细胞的染色方法，该染色方法缩短了脱脂时间，降低了脱脂溶剂对操作者的刺激，从而提高了染色效率和工艺安全度。
为了解决以上技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种区分羊绒皮质细胞的染色方法，包括下列步骤：
将羊绒浸泡在石油醚与无水乙醇的混合液中，进行水浴加热1h，完成脱脂处理；
所述水浴加热的温度为37℃；然后依次进行羊绒鳞片层的剥离和皮质细胞的染色；
所述混合液中，石油醚与无水乙醇的体积比为1:1。
以上染色方法与现有技术的主要区别在于：改变了脱脂所用的溶剂，本发明采用1:1石油醚/无水乙醇为脱脂溶剂，脱脂速率更快，而且两种试剂对人体鼻粘膜的刺激小于乙醚，使操作者的安全得到保障。
综上，与现有技术相比，本发明的染色方法省时、省力，安全性更高。
本发明中，羊绒鳞片层的剥离、用染色液染色这两步的操作方法可以参照羊毛区分正、副皮质细胞的工艺。在脱脂时，为防止乙醇挥发，浸泡的容器应当密封。
另外，在脱脂之前，应当进行必要的预处理——除杂除尘：
将羊绒在50ml烧杯中经60℃温水清洗多次(次数视情况而定，一般5次已足够)，用镊子反复的搅拌，去除羊绒中的砂尘和皮屑。
在脱脂之后，还需清洗羊绒上残留的溶剂、烘干，再进行鳞片剥离、染色等工序。清洗溶剂的方法为：用清水反复清洗。
烘干的方法为在50℃下烘干，烘干时间为30min。
以上染色方法还可以进一步改进，具体如下。
优选地，所述羊绒鳞片层的剥离方法为：
先将羊绒在浓度为88％的甲酸中回流加热，然后在浓度为88％的甲酸中超声裂解。
本发明采用甲酸回流和甲酸超声震荡裂解相结合的方法，能达到剥离更完全、用时更短等效果。
在甲酸中回流适当时间后，羊绒的鳞片细胞松动，此时再进行震荡裂解，剥离更完全，鳞片层剥落后，皮质细胞暴露，且皮质细胞之间的致密结构被破坏，使得亚甲基蓝可以充分染色。
甲酸的浓度对剥离程度、速率有重要影响，经筛选，当甲酸浓度为88％(体积)时，效果最佳。
优选地，所述回流加热的时间为15min。
回流时间会影响工艺成本和剥离效果，经筛选，当回流15min后，既能满足超声震荡剥离细胞的要求，又能将成本控制在合理范围内。
优选地，所述超声裂解的方法为：在功率为52.5w的超声震荡仪中超声30min，在此过程中，每工作2s停止6s。
超声的功率、震荡频率对剥离有重要影响，经筛选，在功率为52.5w的超声震荡仪中超声30min，在此过程中，每工作2s停止6s，获得的剥离效果最佳。
优选地，所述回流加热时，每1g羊绒，加入50ml浓度为88％的甲酸。
回流时甲酸的用量对染色工艺的综合效益有重要影响，用量过多，则成本过高，用量过低则剥离不完全。经筛选，每1g羊绒，加入50ml浓度为88％的甲酸的综合效益高。
优选地，所述超声裂解时，每1g羊绒，加入50ml浓度为88％的甲酸。
超声裂解时甲酸的用量对染色工艺的综合效益有重要影响，用量过多，则成本过高，用量过低则剥离不完全。经筛选，每1g羊绒，加入50ml浓度为88％的甲酸的综合效益高。
优选地，所述染色的方法为：
在37℃的环境中，在亚甲基蓝染液中孵育。
孵育的温度对正、副皮质细胞的区分度和染色均匀性有重要影响。当温度过高时，染色液挥发会导致染色不均匀且染色不充分；当温度过低时耗时太长，影响生产效率，而且正、副皮质细胞的颜色区别度低。亚甲基蓝染液的染色效果为：正皮质细胞被染成深蓝色，副皮质细胞被染成浅蓝色。
优选地，所述亚甲基蓝染液的浓度为0.5％～1％(是指每100ml溶剂中含亚甲基蓝0.5～1g)。
亚甲基蓝溶液应当满足均匀、溶剂对羊绒无损坏等条件，因此其配制方法要适当。以配制1％亚甲基蓝染液为例，配制方法为：54ml95％乙醇与40ml四氯乙烷混合摇匀后，于65℃水浴3min，取出后加1g无水亚甲基蓝粉末，混匀后冷却至4℃，加6ml冰乙酸，混匀后砂芯漏斗过滤，常温保存。或者直接购买成品。
优选地，所述孵育的时间为12h。
孵育12h，有助于染料充分均匀地侵入到皮质细胞。如果时间过短，则染色不均匀。在37℃恒温孵育3h可以看出，染色为浅蓝色，染色不均匀，不能显著区分正、副皮质细胞。在37℃恒温孵育6h，能够略微看到正、副皮质细胞对1％亚甲基蓝的着色不同，但是周围有很多的模糊的界面，效果不是很理想。经过37℃恒温孵育12h，可以看出染成深蓝色的正皮质细胞和染成浅蓝色的副皮质细胞可以很好的区分开，二者之间有明确的界限，正、副皮质细胞在羊绒纤维中呈双边分布。37℃恒温孵育15h，可以看出深蓝色和浅蓝色有相互之间弥散的现象。同时对1％亚甲基蓝染色做了常温(25℃)孵育12h和37℃恒温孵育12h的对比试验，发现常温孵育12h条件下，染色不均匀，不能显著区分两种强度不同的染色。如果温度过高，染液很快地蒸发，使染色时间过短，不能充分的染色。最终确定用1％亚甲基蓝溶液对羊绒染色在37℃恒温孵育12h效果最好，能够很好的区分正、副皮质细胞。
优选地，在所述脱脂之后和所述羊绒鳞片层的剥离之前还包括：
在50℃烘干羊绒。
优选地，所述羊绒鳞片层的剥离之后和所述染色之前还包括：
在50℃烘干羊绒。
综上文所述，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)更省时省力；
(2)对操作人员的危害性小；
(3)对羊绒正、副皮质细胞的染色区分度高，正皮质细胞被染成深蓝色，副皮质细胞被染成浅蓝色，而且两者的染色更均匀，呈现出绚丽的渐变色彩。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的羊绒染色后的显微镜图(放大1000×)；
图2为本发明实施例2提供的羊绒染色后的显微镜图(放大1000×)；
图3为本发明实施例3提供的羊绒染色后的显微镜图(放大1000×)；
图4为本发明实施例4提供的羊绒染色后的显微镜图(放大1000×)；
图5为本发明实施例5提供的羊绒染色后的显微镜图(放大1000×)；
图6为本发明实施例6提供的羊绒染色后的显微镜图(放大1000×)；
图7为本发明实施例7提供的羊绒染色后的显微镜图(放大1000×)。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一种区分羊绒皮质细胞的染色方法：
第一步，羊绒的脱脂除杂预处理：
将羊绒在50ml烧杯中经60℃温水清洗5次，用镊子反复地搅拌，去除羊绒中的砂尘和皮屑。
放在托盘中自然晾干后取羊绒1g置于50ml石油醚:无水乙醇(1:1)混合液中，在37℃水浴加热1h脱脂，用滤纸盖在烧杯上，防止酒精和石油醚的挥发。
然后清水洗净，放在烘箱中50℃烘干30min，拿出备用。
第二步、羊绒鳞片层的剥离：
羊绒脱脂后置于50ml浓度为88％的甲酸中，甲酸回流加热煮沸30min，冷却至室温。
取出绒样置于50ml浓度为88％的甲酸中使用超声裂解仪裂解30min，参数为：功率52.5w，工作2s，停止6s；(每5min取一次样在显微镜下观察鳞片脱离状况，当鳞片全部脱落同时羊绒整体结构保持相对完整时停止超声裂解，大约需要30min)。经过上述处理后，羊绒的鳞片层剥落，皮质细胞暴露，且皮质细胞之间的致密结构被破坏，使得亚甲基蓝可以充分染色。
第三步、羊绒的染色：
使用镊子在羊绒甲酸悬液中捞取单根羊绒至干净的载玻片上(勿拉扯，防止断裂和羊绒生理曲线消失)，再载玻片上滴加几滴甲酸溶液使羊绒可以在干燥后固定在载玻片上，防止自来水冲洗使脱落，然后置于50℃烘箱干燥5min。
将1％亚甲基蓝染液500μl滴加至载玻片有羊绒的部分，37℃恒温孵育2h。时间短染色不均匀，37℃可以充分使染料进入正、副皮质细胞，自来水冲洗干净(注意冲洗力度要小，防止载玻片上的羊绒掉落，可以在烧杯中慢慢的倾斜插入水面中，再拉出水面，如此反复几次，直到润洗干净)。
染色结果：
将染色后的羊绒在50℃烘箱烘干30min，在载玻片有羊绒的部分滴加香柏油，用显微照相系统在10×100倍显微镜下可以清楚的区分正、副皮质层，正皮细胞层被染成深蓝色，副皮质细胞被染成浅蓝色，发现经甲酸回流后的羊绒，在酸性条件下，副皮质层分布在卷曲羊毛卷曲波的外侧，正皮质层转向卷曲波的内侧。正好与原绒的正、副皮质细胞层的分布刚刚相反。也说明了羊绒和羊毛一样在酸性环境下可以让正、副皮质细胞发生翻正现象。由于正、副皮质细胞的含量不同，从图中可以看出羊绒的副皮质细胞层比正皮质细胞层含量多，这就解释了羊绒在二者受力情况的不一致，在正常情况下，羊绒的正皮质细胞层在羊绒弯曲波的外侧，副皮质细胞层在羊绒的内侧，正、副皮质细胞比例的改变可能是造成羊绒弯曲，产生穗状羊绒的原因。
图1为本实施例羊绒染色后的显微镜图，从图中可清晰地看出，正、副皮质细胞有明显的颜色界线，正皮细胞层被染成深蓝色，副皮质细胞被染成浅蓝色，而且二者染色均匀。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于第三步所用的亚甲基蓝的浓度不同，为0.5％，其他步骤及工艺条件与实施例1相同。
该实施例的染色羊绒的显微镜图如图2所示，从图中可清晰地看出，用0.5％亚甲基蓝溶液进行染色，正、副皮质细胞有显著的颜色界线，能看出正皮细胞层被染成深蓝色，副皮质细胞被染成浅蓝色，但效果比实施例1差，皮质细胞染色不均匀，且界线不太明显。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于第三步所用的亚甲基蓝的浓度不同，为0.1％，其他步骤及工艺条件与实施例1相同。
该实施例的染色羊绒的显微镜图如图3所示，从图中可清晰地看出，用0.2％亚甲基蓝溶液对羊绒进行染色，染色效果不理想，无法显著区分正、副皮质细胞层。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于第三步孵育的时长不同，为37℃恒温孵育3h。
该实施例的染色羊绒的显微镜图如图4所示，染色为浅蓝色，染色不均匀，正、副皮质细胞的区分不明显。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于第三步孵育的时长不同，为37℃恒温孵育6h。
该实施例的染色羊绒的显微镜图如图5所示，能够略微看到正、副皮质细胞对亚甲基蓝的着色不同，二者有一定的区分度，但是周围有很多的模糊的界面。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于第三步孵育的时长不同，为37℃恒温孵育15h。
该实施例的染色羊绒的显微镜图如图6所示，能够明显看到正、副皮质细胞对亚甲基蓝的着色不同，二者有明显的区分度，但是可以看出深蓝色和浅蓝色有相互之间弥散的现象。
实施例7
本实施例与实施例1的区别在于第三步孵育的温度不同，为常温(接近25℃)孵育12h。
该实施例的染色羊绒的显微镜图如图7所示，可以看出，常温孵育12h条件下染色不均匀，正、副皮质细胞的染色区分度相比37℃低。
综上实施例可知，本发明适宜染色的条件为：在1％的亚甲基蓝溶液中，孵育，孵育温度37℃，时间12h为最佳。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。