利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法与流程

本发明涉及环保技术领域，具体涉及利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法。

背景技术：

漆酶(laccase，ec1.10.3.2)是一种含cu²⁺多酚氧化酶(polyphenoloxidases，ppo)，其氧化底物包括酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、甾体激素、生物色素、金属有机化合物等。

漆酶按照来源可以分为3类，包括真菌漆酶、细菌漆酶和植物漆酶。目前细菌漆酶逐渐引起大家的关注，细菌漆酶往往不需要糖基化、热稳定性高、酶的最适ph范围广、在卤素溶液中稳定，对极端环境抗性高、细菌的生长周期短，繁殖力强等优势使其比真菌漆酶相比，具有更广阔的应用前景。

有机磷农药是目前种类最多，运用最广泛的农药，可用作杀虫剂、除草剂。多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类。在弱酸性环境下能够稳定保存。低毒类的有敌百虫、乐果、氯硫磷、乙基稻丰散等，高毒类的有甲基对硫磷、二甲硫吸磷、敌敌畏、亚胺磷，剧毒类的有甲拌磷、内吸磷、对硫磷、保棉丰、氧化乐果。

合理的农药的使用可以有利于农产品的保收和增产，但是农药的不合理使用会污染环境，不能及时分解的农药会进入到水、大气环境，甚至随着食物进入到人类体内，威胁人类的身体健康。农药制造厂的利用率低、回收率低等原因也使农药扩散到人类的居住环境，造成环境污染。随着大家安全意识的增强，蔬果、日用水的质量控制站在越来越重要的位置，如何用科学手段绿色环保安全地解决农药污染的问题，显得极其重要。

目前降解农药的方法可以归纳为物理、化学、生物三类。物理方法包括吸附法、超声波法、洗涤法和辐照法；化学法包括氧化分解、水解法和光化学催化氧化法；生物法包括微生物酶解和微生物作用。

目前有研究报道称淡紫青霉、粗毛栓菌真菌漆酶、木霉菌可以降解有机磷农药，然而目前关于细菌漆酶对有机磷农药的降解方面的研究鲜有报道，其应用条件等需要进一步研究。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，包括以下步骤：

1)将产漆酶细菌接种到扩大培养基，培养至培养基呈浑浊状态；

2)将步骤1)得到的扩大培养基加至产酶培养基中，培养，离心收集得到粗酶液；所述产酶培养基中含有cu²⁺；

3)将粗酶液加至农药稀释液，于ph＝8-10、温度为25-35℃、加入介体降解；所述介体为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐、1-羟基本病三唑、紫尿酸或n-羟基乙酰苯胺。

本发明研究了铜离子能有效活化产漆酶细菌、并在于ph＝8-10、温度为25-35℃时介体的作用下，可有效降解5种有机磷农药，包括乐果、敌敌畏、敌百虫、毒死蜱、氧化乐果，6h后的降解效率可高达15％以上。

进一步地，步骤1)中，产漆酶细菌为lrr3s菌株。

进一步地，步骤1)中，所述扩大培养基包括以下组分：0.4-0.6％的酵母浸膏、0.8-1.2％的蛋白胨和0.4-0.6％的氯化钠，所述扩大培养基的ph为6.5-7.5。

进一步地，步骤2)中，所述产酶培养基包括以下组分：0.4-0.6％的酵母浸膏、0.8-1.2％的蛋白胨、0.4-0.6％的氯化钠和0.001-0.005％的硫酸铜，所述产酶培养基的ph为6.5-7.5。

进一步地，步骤2)中，扩大培养基与产酶培养基的体积比为1：2-4。

进一步地，步骤2)中，采用3000-5000r/min离心10-30min。

进一步地，步骤2)中，每1ml的粗酶液中加入0.5-1.5×10^-3mmol的介体。

进一步地，步骤3)中，所述介体为2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐。

进一步地，步骤3)中，加入浓度为0.002-0.003％硫酸铜。

进一步地，步骤3)中，于ph＝9、温度为30℃时降解。尤其是ph值对降解的效率影响最大，当ph＝9时，降解效率显著高于其它ph＝8或ph＝10。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种利用细菌漆酶对有机磷农药的降解方法，并研究了活化金属离子、最适宜ph、温度和介体，该降解方法可有效降解乐果、敌敌畏、敌百虫、毒死蜱、氧化乐果在内的有机磷农药，菌种的使用量小，6h的降解率可高于15％。

附图说明

图1为实施例2的无机磷含量与吸光值的标准曲线；

图2为实施例2的5种有机磷农药的吸光值；

图3为实施例3的温度对酶促农药降解的影响图；

图4为实施例3的ph对酶促农药降解影响图；

图5为实施例3的硫酸铜浓度对酶促农药降解影响图；

图6为实施例5的介体对酶促农药降解影响作用；

图7为实施例6的降解时间对酶促农药降解影响图。

具体实施方式

下面，结合附图和具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。

以下具体实施方式中，如未特殊说明，所记载的百分含量均为重量百分含量。

以下具体实施方式中，lrr3s菌种来源于仲恺农业工程学院，lrr3s菌种分类命名为brevibacteriumcasei，已于2019年12月04日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；电话：010-64807355；保藏号为no.19080。

实施例1：产酶培养

1)培养基制备：取酵母浸膏、蛋白胨和氯化钠加水配制成含有0.5％的酵母浸膏、1.0％的蛋白胨和0.5％的氯化钠，调节ph至7.0，得到扩大培养基；将五水硫酸铜溶于水，制成5％的硫酸铜溶液，向每l扩大培养基中加入8ml5％的硫酸铜溶液，调节ph至7.0，得到产酶培养基；扩大培养基和产酶培养基均用高压灭菌锅在121℃灭下灭菌20分钟。

2)将lrr3s菌株在超净工作台上将平板上的细菌接种到扩大培养基中，放在恒温培养箱中34℃培养1天；待培养液呈浑浊状态时，将其按1：3的体积比转移到产酶培养基中，在34℃恒温培养箱中培养6天；

3)收集步骤2)获得的培养液，4000r/min离心20min，取上清液备用。

4)使用愈创木酚法为底物测量漆酶酶活，在465nm波长处检测吸光值。

实施例2：有机磷农药降解检测

1)标准曲线绘制：使用磷酸二氢钾作为标准品，配制成无机磷标准溶液组，使用磷钼蓝分光光度法，在710nm处检测od值，绘制标准曲线；结果如图1所示，磷含量与吸光值呈现较好的线性关系；

2)农药中总磷含量测定：取0.5ml0.2％农药稀释液于50ml三角瓶中，加5ml过硫酸钾溶液，1ml1:35的硫酸溶液，加水至25ml，在调温电热套上加热至近干，把时间控制在30-40min内，使农药的有机磷全部降解为无机磷。取出冷却，用磷钼蓝分光光度法测定磷含量。加适量水溶解晶体，将溶液移入50ml容量瓶中，加2ml钼酸铵溶液，3ml抗坏血酸溶液，充分混匀，并静置10min。另外用去离子水代替农药部分做空白对照。测定样品在710nm处的od值，测得降解体系中代表1mg农药所含有机磷的量的od710值a；结果如图2所示，乐果、敌敌畏、毒死蜱、敌百虫和氧化乐果吸光值所含有机磷的量不一样，通过换算成无机磷以计算漆酶对农药的降解能力；

3)计算总降解率：反应前，取出1ml农药漆酶混合液于50ml容量瓶中，加2ml钼酸铵溶液与3ml抗坏血酸溶液，加去离子水定容，静置10min，另外用灭活性的酶液做空白对照。同时将其剩余的4ml放在设计的条件下反应，降解反应计时开始。用分光光度计测出710nm处od值a1，在不同的条件下反应后，取1ml反应液于50ml容量瓶中，添加同样的试剂，定容静置10min后，测出反应后的od值a2，降解率的表达式为

实施例3：单因素实验

1)温度对酶促农药降解的影响

准备6组洁净试管，分别添加2.5ml农药稀释液和2.3ml的漆酶，0.2ml1mmol/l的abts溶液，以灭活性的漆酶为对照，在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃下反应6h。测出农药降解率，根据降解率与温度的关系作图。

结果如图3所示，温度对5种有机磷农药酶促降解均有影响，影响趋势基本相同。都是在20-30℃之间时，降解速度随着温度的升高而提高，在30～45℃之间，随着温度的提高而降低。在30℃时，五种有机农药降解率达到峰值，其中乐果可以达到8.43％，敌敌畏达到6.42％，毒死蜱达到5.76％，敌百虫达到7.73％，氧化乐果达到7.88％。

2)ph对酶促农药降解影响

准备7组洁净试管，分别添加2.5ml农药稀释液和2.3ml的漆酶，0.2ml1mmol/l的2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(以下简称abts)溶液，以灭活性的漆酶为对照，用1mol/lnaoh溶液1mol/lhcl溶液将反应体系调ph为6、7、8、9、10、11、12，在室温下反应6h。测出od值的变化，计算降解率，根据降解率与ph的关系作图。

结果如图4所示，ph对5种有机磷农药酶促降解均具有影响。5种有机磷农药降解率在碱性环境下比较明显，而在弱酸性环境下降解率很低，此现象应该与该漆酶的性质有关，该漆酶在中性、碱性的环境下能稳定存在，在酸性环境下酶活力的损失较大。随着碱性越来越强、农药也越来越容易水解，就算没有的漆酶的作用，也会生出越来越多的磷酸根，所以ph10-12的区间内，对照组也检测出越来越多的磷酸根，而不能明显体现出来是细菌漆酶的催化作用。五种有机磷农药的最适降解ph在8到9之间。乐果可达到12.98％，敌敌畏可达到9.54％，毒死蜱可达到10.23％，敌百虫可达到10.46％，氧化乐果可达到10.15％。

3)硫酸铜浓度对酶促农药降解影响

准备6组洁净试管，分别添加2.5ml农药稀释液、1.8ml漆酶0.2ml1mmol/l的abts溶液和0.5ml不同浓度的硫酸铜溶液，以灭活性的漆酶为对照。硫酸铜梯度为0、0.0025％、0.005％、0.01％、0.02％、0.04％，在室温下反应6h。测出od值的变化，计算降解率，根据降解率与硫酸铜浓度的关系作图。

硫酸铜浓度梯度设置如下，准备6支试管，2-6号试管加0.5ml去离子水，添加1ml2g/l的硫酸铜溶液到1号试管中，取0.5ml到2号试管中，充分混匀，再从2号试管中取0.5ml溶液于3号试管中，充分混匀，如此类推，最后1只试管，取出0.5ml丢弃，6组试管的硫酸铜浓度设置完成。

结果如图5所示，硫酸铜浓度对5种有机磷农药酶促降解均具有影响，影响趋势基本相同。在0-0.0025％之间，降解速度随着硫酸铜浓度的升高而提高，在0.0025％-0.004％之间，降解速度随着硫酸铜浓度的升高而下降。估计是因为硫酸铜本身属于酸性溶液，虽然硫酸铜可以促进漆酶的催化作用，可是过多的硫酸铜溶液会导致降解体系的ph值偏酸，抑制酶活。所以，5种有机磷农药降解最适的硫酸铜浓度为0.0025％。乐果的降解率可达到11.54％，敌敌畏可达到9.87％，毒死蜱可达到8.22％，敌百虫可达到10.56％，氧化乐果可达到10.54％。

由实施例3可知，以，irr3细菌漆酶对乐果的最佳降解条件为：温度为30℃、ph为9、硫酸铜浓度为0.0025％。

实施例4：验证试验

将实施例3得到的最佳降解条件，以乐果为试验农药，进行验证，结果如下表所示：

表1验证试验条件和结果

由上表可知，在最优的降解条件下，降解6小时后降解率能达17.21％。

实施例5：介体对酶促农药降解影响作用

准备两组试管，均含有2.5ml0.2％乐果农药稀释液和2.3ml粗酶液，一组添加0.2ml1mmol/l的abts溶液，另一组用去离子水代替。每一组都有一只试管用失活的粗酶液作对照。反应6h，用磷钼蓝分光光度法检测反应前后od710值，计算降解率。

结果如图6所示，降解体系加入abts后，降解率有明显的提升，而不加abts时的降解率非常低，添加abts比不添加降解率提高了10倍以上。

实施例6：时间对酶促农药降解影响

准备6组洁净试管，分别添加2.5ml农药稀释液和2.3ml的漆酶,0.2ml1mmol/l的abts溶液，以灭活性的漆酶为对照，在常温下分别反应0h、2h、4h、6h、8h、10h。测出农药降解率。

结果如图7所示，细菌漆酶对五种有机磷农药均具有降解能力，而时间对细菌漆酶酶促降解五种有机磷农药影响趋势也基本相同。5种有机磷农药的降解率均随着反应时间的延长不断提高，当反应8小时之后，降解率不再增加。所以实验的最佳反应时间为8小时。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。