一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解N-甲基有机氮农药中的应用的制作方法

本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用。

背景技术：

我国是世界上最大的农药使用国之一。有机氮农药和有机磷农药是使用最为广泛的两类农药。它们在使用过程中可以通过喷洒、挥发和风蚀作用进入大气以及水体，并在长时间内有一定的残留。其中，n-基有机氮农药是一类具有高效、低毒的广谱杀虫剂，且与有机磷农药相比具有较短的分解时间，因此我国农业生产和农药市场中到了广泛的使用。

但是，n-甲基有机氮农药的残留不仅能对环境造成污染，，而且在进入恒温动物体内后能够对其生理过程产生重要的影响：如导致血浆中很多细胞的数量变化，改变肝脏坏死性和代谢能力，降低磷脂的合成和代谢，改变组织呼吸过程，抑制动物血液和某些组织胆碱酯酶，增加甲状腺活动，增加肾上腺重量，改变碱性磷酸酶、转氨酶、精氨酸酶等多种酶的活性等。此外，n-基有机氮农药的“三致”问题也受到国际社会的日益关注。

n-甲基有机氮农药与有机磷农药相比，具有性质相对活泼，稳定性相对较弱，自然降解时间相对较短等特点，所以通常不被认是一种危险品。但是，全世界每年用于农业生产西维因超过了100000吨，其残留所造成的环境污染以及生态污染是必须面对的问题。

目前，n-甲基有机氮农药的降解仅仅局限于自然降解，它们在使用过程中可以进入大气与水体，能够与oh、o3、no3等自由基或分子发生反应，而其中oh自由基对n-甲基有机氮的降解起着非常重要的作用。但是，在n-甲基有机氮农药的酶法生物降解方面仍存在较大的空白。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用。本发明方法所用宿主菌bacillussubtiliswb600具有较好的生物安全性，反应条件温和，步骤简单，生物降解活性高。

本发明的技术方案如下：

一种重组bacillussubtiliswb600细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用，所述重组bacillussubtiliswb600细胞为转化带有pma5-trsox基因质粒或pma5-ywbn-trsox基因质粒的重组细胞。

所述重组bacillussubtiliswb600细胞制备方法如下：将thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于pma5-trsox质粒，并转化bacillussubtiliswb600细胞中，并进行胞内表达，得到重组bacillussubtiliswb600细胞；其中，所述pma5-trsox质粒的基因序列如seqidno.1所示。

所述重组bacillussubtiliswb600细胞制备方法如下：将thermomicrobiumroseum肌氨酸氧化酶基因构建于ma5-ywbn-trsox质粒，并转化bacillussubtiliswb600细胞中，并进行内分泌表达，得到重组bacillussubtiliswb600细胞；其中，所述pma5-ywbn-trsox质粒的基因序列如seqidno.2所示。

所述重组bacillussubtiliswb600细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药的具体方法步骤如下：将所得重组bacillussubtiliswb600细胞进行发酵培养，并与n-甲基有机氮农药溶液混合，进行生物降解。

所述重组bacillussubtiliswb600细胞的酶法生物降解n-甲基有机氮农药的具体方法步骤如下：将所得重组bacillussubtiliswb600细胞进行发酵培养，得到培养液上清，并将所得培养液上清与n-甲基有机氮农药溶液混合，进行生物降解。

所述重组bacillussubtiliswb600细胞发酵的方法为：使用tb培养基，在30-50℃下，发酵36-72h。

所述生物降解的反应条件为：ph值为6-8，温度为30-50℃，时间为3-5h。

所述重组bacillussubtiliswb600细胞或培养液上清与n-甲基有机氮农药溶液的体积用量比为1：1-1：50。

所述n-甲基有机氮农药为西维因、速灭威、涕灭威、害扑威、残杀威、涕灭威、灭多威、异丙威、混杀威、牙根灵中一种或多种。

本发明有益的技术效果在于：

本发明利用培养bacillussubtiliswb600细胞，分别开展胞内或分泌性表达具有极端环境耐受性的thermomicrobiumroseum来源肌氨酸氧化酶，能够高效的将n-甲基切除，使游离的氨基暴露，且更容易被细胞转入胞内并分解，从而加快n-甲基有机氮农药的生物降解。以n-甲基有机氮农药(西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威)(100mm)为底物，在ph值为6-8，温度为30-50℃，反应时间为3-5h的温和条件下，快速降解n-甲基有机氮农药，降解率高于95％。

附图说明

图1为本发明pma5-trsox质粒的构建，其中，trsox基因序列前端融合分泌表达信号肽ywbn序列，并通过ndei与mlui两个限制性内切酶酶切位点链接如下pma5质粒。

图2为本发明pma5-ywbn-trsox质粒的构建，其中，trsox基因序列前端融合分泌表达信号肽ywbn序列，并通过ndei与mlui两个限制性内切酶酶切位点链接如下pma5质粒。

图3为本发明中涉及的常用n-甲基有机氮农药。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1：

一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：

1)将转化入pma5-trsox质粒(seqidno.1)的bacillussubtiliswb600细胞以5％的接种量，接入5ltb培养基，温度30℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；同时，以转化入pma5空质粒的bacillussubtiliswb600细胞作为空白对照。

2)将上述500ml菌液离心清洗后重悬在500ml磷酸盐缓冲液内，分别与5l100mm含量的n-甲基有机氮农药西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威混合，搅拌桨转速150rpm，ph值维持在7，反应温度维持在40℃，分别反应3h，4h以及5h，利用hplc检测残留的n-甲基-有机氮农药含量(表1)。

表1n-甲基有机氮农药降解率

实施例2：

一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：

1)将转化入pma5-trsox质粒(seqidno.1)的bacillussubtiliswb600细胞以5％的接种量，接入5ltb培养基，温度30℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；同时，以转化入pma5空质粒的bacillussubtiliswb600细胞作为空白对照。

2)将上述500ml菌液离心清洗后重悬在500ml磷酸盐缓冲液内，分别与500ml100mm含量的n-甲基有机氮农药西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威混合，搅拌桨转速150rpm，ph值分别维持在6，7及8，反应温度维持在40℃，反应4h，利用hplc检测残留的n-甲基-有机氮农药含量(表2)。

表2n-甲基有机氮农药降解率

实施例3：

一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：

1)将转化入pma5-trsox质粒(seqidno.1)的bacillussubtiliswb600细胞以5％的接种量，接入5ltb培养基，温度30℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；同时，以转化入pma5空质粒的bacillussubtiliswb600细胞作为空白对照。

2)将上述500ml菌液离心清洗后重悬在500ml磷酸盐缓冲液内，分别与500ml100mm含量的n-甲基有机氮农药(西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威)混合，搅拌桨转速150rpm，ph值维持在7，反应温度分别维持在30℃、40℃及50℃，反应4h，利用hplc检测残留的n-甲基-有机氮农药含量(表3)。

表3n-甲基有机氮农药降解率

实施例4：

一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：

1)将转化入pma5-ywbn-trsox质粒(seqidno.1)的bacillussubtiliswb600细胞以5％的接种量，接入5ltb培养基，温度40℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；发酵液上清trsox活性达到1500u/ml；

2)将上述500ml含有1500u/mltrsox的发酵上清液与100mm含量的n-甲基有机氮农药(西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威)混合，搅拌桨转速150rpm，ph值维持在7，反应温度维持在40℃，反应3，4，以及5h，利用hplc检测n-甲基有机氮农药的含量(表4)。

表4n-甲基有机氮农药降解率

实施例5：

一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：

1)将转化入pma5-ywbn-trsox质粒(seqidno.1)的bacillussubtiliswb600细胞以5％的接种量，接入5ltb培养基，温度40℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；发酵液上清trsox活性达到1500u/ml；

2)将上述500ml含有1500u/mltrsox的发酵上清液与100mm含量的n-甲基有机氮农药(西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威)混合，搅拌桨转速150rpm，ph值分别维持在6、7及8，反应温度维持在40℃，反应4h，利用hplc检测n-甲基有机氮农药的含量(表5)。

表5n-甲基有机氮农药降解率

实施例6：

一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用，其具体应用操作方法包括如下步骤：

1)将转化入pma5-ywbn-trsox质粒(seqidno.1)的bacillussubtiliswb600细胞以5％的接种量，接入5ltb培养基，温度40℃，搅拌桨转速150rpm，培养36h；发酵液上清trsox活性达到1500u/ml；

2)将上述500ml含有1500u/mltrsox的发酵上清液与100mm含量的n-甲基有机氮农药(西维因，速灭威，涕灭威以及害扑威)混合，搅拌桨转速150rpm，ph值维持在7，反应温度维持在30℃、40℃及50℃，反应4h，利用hplc检测n-甲基有机氮农药的含量(表6)。

表6n-甲基有机氮农药降解率

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种重组枯草芽孢杆菌细胞在酶法生物降解n-甲基有机氮农药中的应用

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>8322

<212>dna

<213>pma5-trsox

<400>1

catatgagttatgcagtttgtagaatgcaaaaagtgaaatcagggggatccatgcgtggc60

tctcatcatcatcatcatcatggctctcgtgaagaacgtgctacagttatcgttgttggc120

cttggcatcatgggctctgctacagcttgggctcttgctcgtcgtggcgttcgtgttgtt180

ggccttgaacaatacgctcctttccatgctcttggctcttctcatggcaaaacacgtatc240

atccgtgaagcttacttcgaatctcctgaatacgttcctcttgttcaacgtgcttacgaa300

ctttgggatgaacttggcgaacgtacaggccgtcgtcttcttcgtgttacaggcggcgtt360

tctatcggccgtcttgattctcctttcatcgttggcgctcgtgaatctgctcaacgtcat420

ggccttgctcatgaacttcttgatgctcaagaagctcgtaaacgtttccctgttcttgct480

cttcctgatgatttcgttgctcttgttgaaggccgtgctggcatccttttcgctgaagaa540

tgctggcgtgctttctgcgaagatgctgttcgtcatggcgctgaacttcgtttcggcgtt600

cgtgttcatggcttcgctcctgatggcgaaggcatgacagttgaaacagaatctggccgt660

cttcgtgctgatcgtgttgttgttacagctggcccttggtctacaacacttcttgctgat720

cttggccttcctcttgaagttcgtcgtgttcttgttgttcatgttcaacctgatgatcct780

acacgtttccgtcctgaagttcttcctatcttcatcatggatgttcctgaaggcgaatac840

tacggcttccctttccttcctgatcaaggcgttaaattcggccgtcatgatgatggcgaa900

gtttgcacacctgaatctgttcgtcgtacagttacagatgatgaagttcgttggatgaca960

ggcgttcttcaacgttaccttcctggcgctgctcgtgaagttcttatgacagttacatgc1020

ctttacacaatgacacctgattctcatttcatgatcgatcgtcatcctgaatggcctcaa1080

gttgttttcgctgctggcttctctggccatggcttcaaattcgcttctgttatgggcgaa1140

gctcttgctgatcttgctcttgaaggcgcttctcgtcttcctatcggcttcctttctttc1200

cgtcgtcttgctaaatgaacgcgttctagaggtcgaaattcacctcgaaagcaagctgat1260

aaaccgatacaattaaaggctccttttggagcctttttttttggagattttcaacgtgaa1320

aaaattattattcgcaattccaagctaattcacctcgaaagcaagctgataaaccgatac1380

aattaaaggctccttttggagcctttttttttggagattttcaacgtgaaaaaattatta1440

ttcgcaattccaagctctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacaca1500

tgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgcagatcacgcgccctgta1560

gcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgcca1620

gcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggct1680

ttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggc1740

acctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgat1800

agacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttcc1860

aaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgc1920

cgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaatttta1980

acaaaatattaacgcttacaatttgatctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggta2040

tcagctcactcaaagcggtaatacggttatcccagaatccggggataacgcaggaaagac2100

aggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaataca2160

ttcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaa2220

aaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcatt2280

ttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatca2340

gttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagag2400

ttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgc2460

ggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctca2520

gaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagt2580

aagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttct2640

gacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgt2700

aactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtga2760

caccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactact2820

tactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggacc2880

acttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtga2940

gcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgt3000

agttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctga3060

gataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatact3120

ttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttga3180

taatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgt3240

agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgca3300

aacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactct3360

ttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgta3420

gccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgct3480

aatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactc3540

aagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacaca3600

gcccagcttggagcgaacgacctacaccgaagtactgagatacctacagcgtgagctatg3660

agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggt3720

cggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcc3780

tgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcg3840

gagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcc3900

ttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgc3960

ctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgag4020

cgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattca4080

ttaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaat4140

taatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggcata4200

ttctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttcaccgtaacacgccacatcttgc4260

gaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtattcactccagagcgatgaaaac4320

gtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtgaacactatcccatatcaccagc4380

tcaccgtctttcattgccatacgaaattccggatgagcattcatcaggcgggcaagaatg4440

tgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttctttacggtctttaaaaaggccgta4500

atatccagctaaacggtctggttataggtacattgagcaactgactgaaatgcctcaaaa4560

tgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggtatatccagtgatttttttctcc4620

attttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactcaaaaaatacgcccggtagtgat4680

cttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgccgatcaacgtctcattttcgc4740

caaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggacaccaggatttatttattctgcg4800

aagtgatcttccgtcacaggtatttattcgaagacgaaagggcatcgcgcgcggggaatt4860

cccgggagagctcgatatcgcatgcggtacctctagaagaagcttggagacaaggtaaag4920

gataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaatttgaa4980

ctaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtttataa5040

aataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctttctta5100

tcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgttgaagt5160

gttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaaaaacc5220

ccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttcttttaa5280

tattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtggacaa5340

gacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgattactt5400

tgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgctgaaat5460

attagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtggttttg5520

taaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcattcagtc5580

acaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgtttctcac5640

attaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagatatggc5700

tcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggttttat5760

gcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatgcatgt5820

attggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaaaaaca5880

atggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaagttca5940

aatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaaactgc6000

aaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttgaaacg6060

tttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggtttgtt6120

aaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgattcatac6180

agatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaattggga6240

acggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaagattag6300

atgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaatagct6360

gaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaattatctga6420

aaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatgaagat6480

tgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggctattgg6540

tgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatgatgtg6600

tgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtggaaggt6660

ggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaatcaga6720

ttggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggtggata6780

cttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgatgcgat6840

ttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatattcgtgt6900

gcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggtgccat6960

gttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgagcgcttcggtcttaactgaagc7020

agttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatctgtgccagttcgtaatgtctgg7080

tcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctagagaatttctggaatgggattca7140

ggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtcaaaacgcataccattttgaac7200

gatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtatttattaacttctcctagtatt7260

agtaattatcatggctgtcatggcgcattaacggaataaagggtgtgcttaaatcgggcc7320

attttgcgtaataagaaaaaggattaattatgagcgaattgaattaataataaggtaata7380

gatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcgtgagaatgttacagtctatcccggc7440

attgccagtcggggatattaaaaagagtataggtttttattgcgataaactaggtttcac7500

tttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaatgtgtaatgaggttcggattcatct7560

atgggaggcaagtgatgaaggctggcgctctcgtagtaatgattcaccggtttgtacagg7620

tgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgccgcattgaagtagagggaattgatga7680

attatatcaacatattaagcctttgggcattttgcaccccaatacatcattaaaagatca7740

gtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccgacaacaatttgattagcttttt7800

tcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatctgttcagcaatcgggcgcgattgctg7860

aataaaagatacgagagacctctcttgtatcttttttattttgagtggttttgtccgtta7920

cactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattcttgctgagtctggctttcggtaagc7980

tagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaaaggtggagattttttgagtga8040

tcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgatttttaaacgagcacgagagcaaaacc8100

cccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgtttcttttttctcgtaaaaaaaag8160

aaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgccgacagcctcgcagagcacaca8220

ctttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttggaagtggttgccggaaagagc8280

gaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgattta8322

<210>2

<211>8403

<212>dna

<213>pma5-ywbn-trsox

<400>2

catatgagttatgcagtttgtagaatgcaaaaagtgaaatcagggggatccatgagcgat60

gaacaaaaaaagccagaacaaattcacagacgggacattttaaaatggggagcgatggcg120

ggggcagccgttgcgcgtggctctcatcatcatcatcatcatggctctcgtgaagaacgt180

gctacagttatcgttgttggccttggcatcatgggctctgctacagcttgggctcttgct240

cgtcgtggcgttcgtgttgttggccttgaacaatacgctcctttccatgctcttggctct300

tctcatggcaaaacacgtatcatccgtgaagcttacttcgaatctcctgaatacgttcct360

cttgttcaacgtgcttacgaactttgggatgaacttggcgaacgtacaggccgtcgtctt420

cttcgtgttacaggcggcgtttctatcggccgtcttgattctcctttcatcgttggcgct480

cgtgaatctgctcaacgtcatggccttgctcatgaacttcttgatgctcaagaagctcgt540

aaacgtttccctgttcttgctcttcctgatgatttcgttgctcttgttgaaggccgtgct600

ggcatccttttcgctgaagaatgctggcgtgctttctgcgaagatgctgttcgtcatggc660

gctgaacttcgtttcggcgttcgtgttcatggcttcgctcctgatggcgaaggcatgaca720

gttgaaacagaatctggccgtcttcgtgctgatcgtgttgttgttacagctggcccttgg780

tctacaacacttcttgctgatcttggccttcctcttgaagttcgtcgtgttcttgttgtt840

catgttcaacctgatgatcctacacgtttccgtcctgaagttcttcctatcttcatcatg900

gatgttcctgaaggcgaatactacggcttccctttccttcctgatcaaggcgttaaattc960

ggccgtcatgatgatggcgaagtttgcacacctgaatctgttcgtcgtacagttacagat1020

gatgaagttcgttggatgacaggcgttcttcaacgttaccttcctggcgctgctcgtgaa1080

gttcttatgacagttacatgcctttacacaatgacacctgattctcatttcatgatcgat1140

cgtcatcctgaatggcctcaagttgttttcgctgctggcttctctggccatggcttcaaa1200

ttcgcttctgttatgggcgaagctcttgctgatcttgctcttgaaggcgcttctcgtctt1260

cctatcggcttcctttctttccgtcgtcttgctaaatgaacgcgttctagaggtcgaaat1320

tcacctcgaaagcaagctgataaaccgatacaattaaaggctccttttggagcctttttt1380

tttggagattttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattccaagctaattcacctcgaa1440

agcaagctgataaaccgatacaattaaaggctccttttggagcctttttttttggagatt1500

ttcaacgtgaaaaaattattattcgcaattccaagctctgcctcgcgcgtttcggtgatg1560

acggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcgg1620

atgcagatcacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca1680

gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcct1740

ttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggt1800

tccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcac1860

gtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttct1920

ttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattctt1980

ttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaac2040

aaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttgatctgcgctcggtc2100

gttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaagcggtaatacggttatcccagaatc2160

cggggataacgcaggaaagacaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctat2220

ttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgata2280

aatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgccct2340

tattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaa2400

agtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaa2460

cagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttt2520

taaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtgttgacgccgggcaagagcaactcgg2580

tcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagca2640

tcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataa2700

cactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgctttttt2760

gcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagc2820

cataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaa2880

actattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatgga2940

ggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgc3000

tgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccaga3060

tggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatga3120

acgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcaga3180

ccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggat3240

ctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgtt3300

ccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttct3360

gcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgcc3420

ggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagatacc3480

aaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcacc3540

gcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtc3600

gtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctg3660

aacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaagtactgag3720

atacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacag3780

gtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaa3840

cgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgattttt3900

gtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacg3960

gttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattc4020

tgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgac4080

cgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctct4140

ccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagc4200

gggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggcttt4260

acactttatgcttccggcatattctcaataaaccctttagggaaataggccaggttttca4320

ccgtaacacgccacatcttgcgaatatatgtgtagaaactgccggaaatcgtcgtggtat4380

tcactccagagcgatgaaaacgtttcagtttgctcatggaaaacggtgtaacaagggtga4440

acactatcccatatcaccagctcaccgtctttcattgccatacgaaattccggatgagca4500

ttcatcaggcgggcaagaatgtgaataaaggccggataaaacttgtgcttatttttcttt4560

acggtctttaaaaaggccgtaatatccagctaaacggtctggttataggtacattgagca4620

actgactgaaatgcctcaaaatgttctttacgatgccattgggatatatcaacggtggta4680

tatccagtgatttttttctccattttagcttccttagctcctgaaaatctcgataactca4740

aaaaatacgcccggtagtgatcttatttcattatggtgaaagttggaacctcttacgtgc4800

cgatcaacgtctcattttcgccaaaagttggcccagggcttcccggtatcaacagggaca4860

ccaggatttatttattctgcgaagtgatcttccgtcacaggtatttattcgaagacgaaa4920

gggcatcgcgcgcggggaattcccgggagagctcgatatcgcatgcggtacctctagaag4980

aagcttggagacaaggtaaaggataaaacagcacaattccaagaaaaacacgatttagaa5040

cctaaaaagaacgaatttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcga5100

gatcagggaatgagtttataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatgg5160

ttttgaacttgttctttcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagt5220

tgctgaaaggtgcgttgaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaa5280

aattggttgcacagaaaaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaa5340

atagatgggggtttcttttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaa5400

atcaagggttttagtggacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaa5460

aatcgctaatgttgattactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaag5520

agtaaaagattgtgctgaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaa5580

gttgtatcgagtgtggttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagc5640

aatgaaacatggcattcagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaac5700

agttcgttggttgtttctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaa5760

taagagtttgtcagatatggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaa5820

taaaaatcttgttggttttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattc5880

ttataatcagcacatgcatgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacaga5940

aaactacgtgaatcaaaaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagacta6000

tgatccaaatgtaaaagttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatataca6060

atcggcaattgacgaaactgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatga6120

tgaagaaaagaatttgaaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggtt6180

aatctcctatggtggtttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacaga6240

agaaggcgatttgattcatacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctat6300

tattgcaatgtggaattgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacg6360

ggccagtttgttgaagattagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttag6420

gaagacgagttattaatagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaa6480

agcaaatctaaaattatctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgac6540

tagagaagaaagaatgaagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatgg6600

ggatgatgttaaggctattggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggcccta6660

ttcggatattgagatgatgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatg6720

gacaaccggtgagtggaaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagatta6780

tgcatctcaggtggaatcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgcc6840

gatttatgattcaggtggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagc6900

ccaaacgttccacgatgcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcagg6960

caaatggcgtaatattcgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtaca7020

ggtagcaatggcaggtgccatgttgattggtctgcatcatcgcatctgttatacgacgag7080

cgcttcggtcttaactgaagcagttaagcaatcagatcttccttcaggttatgaccatct7140

gtgccagttcgtaatgtctggtcaactttccgactctgagaaacttctggaatcgctaga7200

gaatttctggaatgggattcaggagtggacagaacgacacggatatatagtggatgtgtc7260

aaaacgcataccattttgaacgatgacctctaataattgttaatcatgttggttacgtat7320

ttattaacttctcctagtattagtaattatcatggctgtcatggcgcattaacggaataa7380

agggtgtgcttaaatcgggccattttgcgtaataagaaaaaggattaattatgagcgaat7440

tgaattaataataaggtaatagatttacattagaaaatgaaaggggattttatgcgtgag7500

aatgttacagtctatcccggcattgccagtcggggatattaaaaagagtataggttttta7560

ttgcgataaactaggtttcactttggttcaccatgaagatggattcgcagttctaatgtg7620

taatgaggttcggattcatctatgggaggcaagtgatgaaggctggcgctctcgtagtaa7680

tgattcaccggtttgtacaggtgcggagtcgtttattgctggtactgctagttgccgcat7740

tgaagtagagggaattgatgaattatatcaacatattaagcctttgggcattttgcaccc7800

caatacatcattaaaagatcagtggtgggatgaacgagactttgcagtaattgatcccga7860

caacaatttgattagcttttttcaacaaataaaaagctaaaatctattattaatctgttc7920

agcaatcgggcgcgattgctgaataaaagatacgagagacctctcttgtatcttttttat7980

tttgagtggttttgtccgttacactagaaaaccgaaagacaataaaaattttattcttgc8040

tgagtctggctttcggtaagctagacaaaacggacaaaataaaaattggcaagggtttaa8100

aggtggagattttttgagtgatcttctcaaaaaatactacctgtcccttgctgattttta8160

aacgagcacgagagcaaaacccccctttgctgaggtggcagagggcaggtttttttgttt8220

cttttttctcgtaaaaaaaagaaaggtcttaaaggttttatggttttggtcggcactgcc8280

gacagcctcgcagagcacacactttatgaatataaagtatagtgtgttatactttacttg8340

gaagtggttgccggaaagagcgaaaatgcctcacatttgtgccacctaaaaaggagcgat8400

tta8403