专利名称：使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实现暗场显微及荧光显微的方法及装置。
技术背景光学显微镜是研究微观世界的重要工具。根据观测方法和观测对象的不 同，光学显微镜可以分为明场显微镜、暗场显微镜、荧光显微镜等种类。大部 分研究对象都可以使用明场显微镜来观测，但是有一些样品因为其折射率与周 围环境非常接近，使用普通明场显微方法很难观察，这时使用暗场显微或荧光 显微方法则可以解决这个问题。暗场显微的原理是挡住照明光源的中间部分， 仅让照明光束边缘部分的光线以一定的角度斜照明样品，这样一来，照明光束 不直接进入显微物镜，而只有样品的散射光进入物镜成像，其效果就好像夜晚 的星空，在大片的暗背景下呈现出明亮的样品结构，这种显微方法极大地增加 了图像的对比度。作为一种非常简单有效的微观样品边缘检测的手段，暗场显 微技术被广泛应用于各个领域。暗场显微与明场显微的主要区别在于它们的聚光镜设计不同。普通的明场 显微聚光镜产生的是一个锥形聚焦光束照明样品，而暗场显微聚光镜则使用一 个圆形挡光板遮住照明光束的中间部分，形成了一个空心的锥形聚焦光束。锥 形光束的顶点被聚焦到样品表面，光束穿过样品后形成一个倒置的锥形空心光 束。显微物镜位于光束的空心位置处，如果照明光束的发散角大于显微物镜的 孔径角，则照明光将不会直接进入物镜，而只有被样品散射的光才会通过物镜 成像。这种暗场聚光镜的优点是简单易行，但缺点是挡光板挡住了大部分照明光，所以透过率很低。专利CN200410017069. l设计了一种暗场显微聚光装置， 具有照明光利用效率高的优点，但是需要使用圆锥形反射器和梯形桶反射器以 及在透镜中心打孔等复杂的制作工艺，而且该聚光器只能用于暗场照明。专利 CN200480020826. 9设计了一种更为复杂的聚光镜系统，需要使用一系列互相配 合的光阑来实现，所以整个系统的光透过率不高。荧光显微方法是先用特殊的染料对待测样品进行处理，然后在观测时使用 特定波长的光去照射样品，其中染料受到激发会发出另一波长的荧光，通过该 荧光成像而观测样品。随着各种荧光染料的出现，使用不同的荧光染料可以标 记不同类型的样品或者标记样品内部不同的构件，从而可以观测样品的精细构 成。荧光显微镜己经成为化学和生物样品成像的有力工具。但通常的荧光显微 镜要针对不同的荧光波长，在探测器前设置不同的窄带滤光片，以选择使荧光 透过而阻挡激发光和其它波长的光进入探测器，这就使得对不同的荧光染料要 使用不同的滤光片，而且普通荧光显微镜不同时具有暗场显微的功能。 发明内容本发明目的是提出一种可实现暗场显微及荧光显微的方法及装置，使用锥 镜和一组透镜匹配作为聚光装置，可以同时实现暗场显微、荧光显微及明场显 微，解决了现有暗场显微的照明光透过率不高以及现有荧光显微对不同的荧光 染料要使用不同滤光片且不能同时具有暗场显微的技术问题。本发明的技术解决方案是一种使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的方法，包括以下步骤 1]产生一平行光束；2]该平行光束通过锥镜8，发散形成空心光束；3]调节空心光束的发散角，使出射光线的发散角大于显微物镜14的孔径角；4]将样品13放置在空心光束的中心，用显微物镜14观察样品13。 上述平行光束为照明光或荧光激发光；所述荧光激发光光源4采用高压荥 灯或采用特定波长的激光器；所述调节空心光束的发散角的方法是将空心光 束依次通过透镜I 9和透镜I111，使透镜IIll出射光线的发散角大于显微物镜 14的孔径角；所述锥镜8、透镜19、透镜II11之间应满足如下关系<formula>formula see original document page 5</formula>其中w。一入射平行光束的半径；r一锥镜8的底角；77 —锥镜8材料的折射率；U,—入射平行光束通过锥镜8后的发散角；112—从透镜IIll出射光线的发散角；t一透镜I9的焦距；f「透镜IIll的焦距；山一锥镜8和透镜I9 之间的距离；d2—透镜I 9和透镜II 11之间的距离；h—光束入射到透镜I 9上的半径。一种使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，包括光源系统、设置在光源系统前方的光学系统、设置在光学系统前方的可放置样品的载物台12、设置 在样品前方的成像系统；其特殊之处是，所述光学系统包括依次设置在光源系 统前方的准直透镜2、锥镜8、透镜I9和透镜II11;所述成像系统包括显微物镜14。上述光源系统包括白光照明光源1或荧光激发光光源4;所述荧光激发光光源4是激光器。上述光源系统包括荧光激发光光源4和设置在荧光激发光光源4前方的滤 光片5;所述荧光激发光光源4是高压汞灯。上述光源系统包括白光照明光源1和荧光激发光光源4;所述荧光激发光 光源4是激光器；所述准直透镜包括设置在白光照明光源1前方的白光准直透镜2和设置在荧光激发光光源4前方的准直透镜6;所述光学系统还包括分束 器3;所述分束器3用于将白光照明光源1和荧光激发光光源4发出的光束同 时入射到锥镜8上。上述光源系统包括白光照明光源1和荧光激发光光源4;所述荧光激发光 光源4是高压汞灯；所述准直透镜包括设置在白光照明光源1前方的白光准直透镜2和设置在荧光激发光光源4前方的准直透镜6; 所述光学系统还包 括分束器3以及设置在荧光激发光光源4前方的滤光片5;所述分束器3用于将白光照明光源1和荧光激发光光源4发出的光束同时入射到锥镜8上；所述滤光片5用于从荧光激发光光源4发出的光中选择合适的激发波长。 上述成像系统还包括设置在显微物镜14前方的CCD摄像机16。 上述光学系统还包括设置在锥镜8后方的起偏器7以及设置在显微物镜14和CCD摄像机16之间的检偏器15。上述成像系统还包括与CCD摄像机16相连的监视屏或计算机17。本发明的优点是1、 系统透过率高。本发明采用锥镜和一组透镜的组合作为聚光装置，系 统透过率很高，接近100%。2、 可以方便地实现明场显微与暗场显微的切换。通过调整照明光路中透镜组之间的间隔，可以改变照明光线的发散角度，从而实现明场与暗场之间的转换。3、 本发明使用锥镜同时实现了暗场显微和荧光显微的功能，明场照明与 暗场照明之间可以相互转换，并且省去了在探测器前设置荧光窄带滤光片。
图1是本发明使用锥镜分光的原理示意图；图2是本发明使用锥镜和透镜组实现暗场和明场显微照明的原理图； 图3是本发明装置结构示意图及光路图；其中1-白光照明光源，2-准直透镜，3-分束器，4-荧光激发光光源(高 压汞灯或激光器)，5-滤光片，6-准直透镜，7-起偏器，8-锥镜，9-透镜I， 10-全反射镜，ll-透镜II， 12-载物台，13-样品，14-显微物镜，15-检偏器， 16-CCD摄像机，17-计算机；图4是本发明装置拍摄的A1A微粒的明场和暗场显微照片； 其中图4a是Al刀3粒子的明场显微图像；图4b是Al^粒子的暗场显微 图像；图5是本发明装置拍摄的ZnS: Cu粒子的荧光显微照片。
具体实施方式
一种使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的方法，包括以下步骤 1]产生一平行光束，该平行光束为照明光或荧光激发光，其中荧光激发 光光源采用高压汞灯或采用特定波长的激光器；2]将该平行光束通过锥镜，发散形成空心光束；3]将空心光束依次通过透镜I和透镜II，使透镜II出射光线的发散角大 于显微物镜的孔径角；其中锥镜、透镜I、透镜n之间应满足如下关系<formula>formula see original document page 8</formula>其中W。一入射平行光束的半径；r一锥镜8的底角；r锥镜8材料的折 射率；1h—入射平行光束通过锥镜8后的发散角；U2—从透镜I111出射光线的 发散角；f厂透镜I9的焦距；f2—透镜IIll的焦距；d,—锥镜8和透镜I9之 间的距离；4一透镜I 9和透镜IIll之间的距离；h—光束入射到透镜I 9上的 半径；4]将样品放置在空心光束的中心，用显微物镜观察样品。 如图l所示，半径为w。的平行光束通过锥镜后由于折射会发散成空心光束， 当锥镜的底角r较小时(小于10度)，发散角近似为<formula>formula see original document page 8</formula>其中/7是锥镜材料的折射率。在暗场照明中，照明光束的发散角必须大于显微物镜的孔径角，以确保照 明光不进入物镜，而只有散射光进入物镜。但为了保证照明光的透过率，锥镜 的底角Y不能太大，否则会有很大一部分光会被反射回去。所以，使用单个锥 镜不能得到足够大的光束发散角U。为了扩大照明光束的发散角，我们在锥镜后放置了透镜i和透镜n，如图2所示。根据图2中的几何关系，可以得到如下公式<formula>formula see original document page 8</formula>(2)最后出射光线的发散角用U2表示。通过选择适当的透镜焦距(f,、 f2)和调节各元件之间的距离(d1、d2)可以改变U2。当U2大于显微物镜的孔径角时，照明(或激发)光不会进入显微物镜，只有散射光(或荧光)能进入物镜，从 而可实现暗场显微(或荧光显微)。当U2小于物镜的孔径角时，照明光线会直接进入物镜，从而可以实现明场显微照明。参见图3， 一种使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，包括光源系统、 设置在光源系统前方的光学系统、设置在光学系统前方的可放置样品的载物 台、设置在样品前方的成像系统；光源系统包括白光照明光源和荧光激发光光 源；荧光激发光光源是激光器或高压汞灯；光学系统包括设置在白光照明光源 前方的白光准直透镜、设置在荧光激发光光源前方的准直透镜、可将白光照明 光源和荧光激发光光源发出的光束同时入射到锥镜上的分束器、锥镜、透镜I 和透镜II;成像系统包括显微物镜、设置在显微物镜前方的CCD摄像机、与CCD 摄像机相连的监视屏或计算机；载物台为电控载物台或手动载物台，CCD摄像 机为模拟CCD摄像机或数字CCD摄像机。如果使用高压汞灯作为荧光激发光光源，则需要在荧光激发光光源前放置 一个滤光片，滤光片用来选择合适的荧光激发波长；如果使用激光器作为荧光 激发光光源，则不需要滤光片。为了调节散射光进入CCD摄像机的亮度，可以在分束器和锥镜之间设置一 个起偏器，同时在显微物镜和CCD摄像机之间设置一个检偏器，调节CCD摄像 机前的检偏器的偏振方向，使其与起偏器的偏振方向垂直，这样可达到提高荧 光显微图像信噪比的目的。为了降低本发明装置的体积，可以在透镜II前设置一个全反射镜，降低显 微物镜下方的设备高度。本发明装置的工作过程1、暗场显微与明场显微操作在暗场和明场显微工作方式下，关掉荧光激发光光源。白光照明光源经白 光准直透镜变为平行光束后，经过起偏器、锥镜、透镜I、全反射镜、透镜II 变成空心的锥形光束照射样品。通过选择适当的透镜焦距(f,、 f2)和调节各 元件之间的距离(d,、 d2)可以改变出射光束与光轴的夹角u2。当U2大于显微物镜的孔径角时，照明光不会进入显微物镜，只有散射光能进入物镜，实现暗 场显微；当U2小于物镜的孔径角时，照明光线会直接进入物镜，从而可以实现 明场显微。调节CCD摄像机前的检偏器的偏振方向，可以改变视场的亮度和图 像的信噪比。实施例中，锥镜的底角Y=5"，透镜I和透镜II的焦距分别为t二150mm和f^二18腿，锥镜8与透镜I的间距d,二100mm，透镜I和透镜II的间 距d2二300mm，入射光半径w = 10mm。在此参数下可以得到u2=43. 8"，这个角度 大于大部分显微物镜的孔径角(如25X/NA0.4物镜的孔径角为23.6°， 40X/NA0.65物镜的孔径角为40.5")，可以实现暗场显微照明。在此配置下， 通过调节透镜I在锥镜8和透镜II之间的位置，可以同时改变d,和d2，用以改 变照明光出射光线的发散角u2，当U2小于物镜14的孔径角时，照明光会直接 进入物镜，从而可以实现明场显微照明。图4是本发明装置对八1203微粒明场 显微和暗场显微图像的对比，图4(a)是明场显微照片，粒子表面的细节部分不 明显；图4(b)是暗场显微照片，可以清楚地观察到粒子表面凹凸不平的细节部 分，对比度和立体感比较强。 2、荧光显微操作在荧光显微工作方式下，关掉白光照明光源。荧光激发光光源可以使用高 压汞灯或特定波长激光器。激发光源经过滤光片后(如果使用激光器作为荧光 激发光光源，则不需要滤光片)，再经过准直镜、分束器、起偏器、锥镜、透 镜I 、全反射镜、透镜II后聚焦到样品上。通过选择适当的透镜焦距(f,、 f2) 和调节各元件之间的距离(d,、 d2)可以改变荧光激发光出射光束与光轴的夹 角山。当U2大于显微物镜的孔径角时，激发不会进入显微物镜，只有样品发出 的荧光能进入物镜成像，达到荧光显微的目的。调节CCD摄像机前的检偏器的 偏振方向，使其与起偏器的偏振方向垂直，这样可以减弱激发光的散射光进入 CCD摄像机，达到提高荧光显微图像信噪比的目的。实施例中，使用波长405nm 的半导体激光器作为荧光激发光光源，去掉滤光片，锥镜的底角Y=5"，透镜 I和透镜II的焦距分别为& = 150腿和f2=18mm，锥镜与透镜I的间距山= 100mm，透镜I和透镜n的间距d2二300mra。图5是本发明装置拍摄的ZnS: Cu 粒子的荧光显微图像，ZnS: Cu粒子在405nm激光激发下发出绿色的荧光，拍 摄效果很好。
权利要求
1、一种使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤1]产生一平行光束；2]该平行光束通过锥镜(8)，发散形成空心光束；3]调节空心光束的发散角，使出射光线的发散角大于显微物镜(14)的孔径角；4]将样品(13)放置在空心光束的中心，用显微物镜(14)观察样品(13)。
2、 根据权利要求1所述的使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的方法，其 特征在于所述平行光束为照明光或荧光激发光；所述荧光激发光光源(4)采 用高压汞灯或采用特定波长的激光器；所述调节空心光束的发散角的方法是 将空心光束依次通过透镜I (9)和透镜I1 (11)，使透镜II (11)出射光线的发散 角大于显微物镜(14)的孔径角；所述锥镜(8)、透镜I (9)、透镜II(11)之间应满足如下关系<formula>formula see original document page 2</formula>其中W。一入射平行光束的半径；r一锥镜(8)的底角；/7—锥镜(8)材料 的折射率；U,—入射平行光束通过锥镜(8)后的发散角；U2—从透镜II(11)出射 光线的发散角；f,一透镜I (9)的焦距；f2—透镜II(ll)的焦距；d,—锥镜(8) 和透镜I (9)之间的距离;d「透镜I (9)和透镜n (ll)之间的距离;h—光束入 射到透镜I (9)上的半径。
3、 一种使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，包括光源系统、设置在光源系统前方的光学系统、设置在光学系统前方的可放置样品的载物台(12)、设置在样品前方的成像系统；其特征在于所述光学系统包括依次设置 在光源系统前方的准直透镜(2)、锥镜(8)、透镜I (9)和透镜II(11);所述成像系统包括显微物镜(14)。
4、 根据权利要求3所述的使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，其 特征在于所述光源系统包括白光照明光源(1)或荧光激发光光源(4);所述荧 光激发光光源(4)是激光器。
5、 根据权利要求3所述的使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，其特征在于所述光源系统包括荧光激发光光源(4)和设置在荧光激发光光源(4)前方的滤光片(5);所述荧光激发光光源(4)是高压汞灯。
6、 根据权利要求3所述的实现暗场显微及荧光显微的装置，其特征在于所述光源系统包括白光照明光源(1)和荧光激发光光源(4);所述荧光激发光光 源(4)是激光器；所述准直透镜包括设置在白光照明光源(l)前方的白光准直透镜(2)和设置在荧光激发光光源(4)前方的准直透镜(6);所述光学系统还包括 分束器(3);所述分束器(3)用于将白光照明光源(1)和荧光激发光光源(4)发出 的光束同时入射到锥镜(8)上。
7、 根据权利要求3所述的使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，其特征在于所述光源系统包括白光照明光源(1)和荧光激发光光源(4);所述荧 光激发光光源(4)是高压汞灯；所述准直透镜包括设置在白光照明光源(1)前方的白光准直透镜(2)和设置在荧光激发光光源(4)前方的准直透镜(6);所述光 学系统还包括分束器(3)以及设置在荧光激发光光源(4)前方的滤光片(5);所 述分束器(3)用于将白光照明光源(1)和荧光激发光光源(4)发出的光束同时入 射到锥镜(8)上；所述滤光片(5)用于从荧光激发光光源(4)发出的光中选择合适的激发波长。
8、 根据权利要求3或4或5或6或7所述的使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，其特征在于所述成像系统还包括设置在显微物镜(14)前方的CCD摄像机(16)。
9、 根据权利要求8所述的使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，其 特征在于所述光学系统还包括设置在锥镜(8)后方的起偏器(7)以及设置在显 微物镜(14)和CCD摄像机(16)之间的检偏器(15)。
10、 根据权利要求9所述的使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的装置，其 特征在于所述成像系统包括与CCD摄像机(16)相连的监视屏或计算机(17)。
全文摘要
本发明涉及一种使用锥镜实现暗场显微及荧光显微的方法及装置，首先产生一个平行照明光光束或荧光激发光光束；使该平行光束通过锥镜发散形成空心光束；将空心光束依次通过透镜I和透镜II，使透镜II出射光线的发散角大于显微物镜的孔径角；将样品放置在空心光束的中心，用显微物镜观察样品，还可在显微物镜前方设置CCD摄像机。本发明系统透过率高、可以方便地实现明场显微与暗场显微的切换、能同时实现暗场显微和荧光显微功能，解决了现有暗场显微的照明光透过率不高以及现有荧光显微对不同的荧光染料要使用不同滤光片且不能同时具有暗场显微的技术问题。
文档编号G02B21/06GK101216601SQ20071030727
公开日2008年7月9日 申请日期2007年12月29日 优先权日2007年12月29日
发明者姚保利, 铭 雷 申请人:中国科学院西安光学精密机械研究所