获取图像数据的方法和布置与流程

本发明涉及依据独立权利要求的前序获取图像的方法和布置。

背景技术：

对于逐个像素获取图像数据，例如使用动态图像记录的方法，其中用不同的照明强度常规地照明样品或样品区域的多个记录、检测自样品发出的检测光并且以这种方法所获取的图像数据相互抵消。

通过具有不同曝光时间的多个单图像记录，可以用良好的信噪比分别测量暗图像区域和亮图像区域二者。然后可以计算所述的图像区域以形成具有增强的动态的整个图像，其中亮区域和暗区域二者以高对比度渲染(称为高动态范围成像；hdri；a.贝尔等：“高动态范围图像作为在变化的染色强度下检测嗜银核仁组织区域的基础(highdynamicrangeimagesasabasisfordetectionofargyrophilicnucleolarorganizerregionsundervaryingstainlntensities)”，图像处理的ieee国际会议的论文集，icip2006，2514-2544)。代替不同的曝光时间，在所激发的荧光作为检测光的情况下可以使用不同激发强度。在顺序的单图像记录或多个单图像记录的情况下，照明间隔(也就是说在像素区域被照明的期间的总时间)由彼此分离的照明事件构成。在像素区域的单独照明事件之间获取其他像素区域的图像数据。

在其他已知的方法中，根据检测光的所检测的信号强度调节曝光强度。当使用所谓的clem方法(受控制的光曝光显微术)时，根据检测光的所捕获的信号强度进行消隐。

尽管使用顺序记录的方法使得以良好的信噪比分别测量暗图像区域和亮图像区域二者并且可以计算所述图像区域以形成具有增强动态的整个图像成为可能，但是这些方法是复杂且缓慢的。

作为顺序记录单独图像的替代例，ep1761071a1例如公开了通过不对称的光束分离同时记录不同对比度范围的单个图像。然而不可避免地，这需要在多个通道和多个光电检测器之上分割光信号，这表示附加的噪声源。通过单独通道中的信号强度进一步降低信噪比(snr)，信号强度由于分割而减弱。

在wo2011/038815a1中描述了其他方法。为了提出复杂且缓慢的顺序记录的替代例、为了产生各种样品区域的整个图像，根据结果信号和/或根据多个平行评估通道中的一个的中间结果信号来选择多个评估方法(spciadc、2d-pc)中的一个。来自各种信号评估的指定区域选择使得使用具有相关的样品区域的最佳动态范围的相应信号评估成为可能。得到的图像由此获得增强动态范围，起因于单独图像元素的动态范围的合并。

us2010/0208339a1公开了操作显微镜的方法，其中将激发光指引到样品的不同点上。在这种情况下，在这些点的每一点中的激发光的强度改变，并且针对每一点量化地检测至少一个光谱范围中的检测光的强度。通过调节系统自动调节激发光的强度和/或激发光的光谱构成。检测光的强度的先前编译的测量数据充当调节的基数据，其中曝光事件的持续时间之上所积分的强度不会超过规定值。在还被称为dim的该进程中，在曝光周期期间调节曝光强度。

技术实现要素：

本发明基于提出获取图像数据的替代方法的目的，该替代方法还是易于实施的。本发明还基于提出获取图像数据的替代布置的目的。

该目的由通过权利要求1中的特征的方法来实现。该目的由通过权利要求7中的特征的布置来实现。本发明的有利的配置是从属权利要求的主题。

在所提出的获取图像数据的方法中，用各自不同强度的照明光反复地(至少两次)照明将要成像的样品的像素区域。因为照明，对于每个照明事件获取从像素区域发出的检测光作为子像素的图像数据。从相关的像素区域的子像素的所获取的图像数据的数目确定像素区域的产生的图像数据。

该方法的特征在于像素区域的照明事件被连续触发的事实，并且在于在照明其他像素区域之前获取像素区域的所有子像素的图像数据。

像素(图像元素)被认为是图像由其构成的最小单元。在本说明书中，将要成像的样品的像素区域旨在是像素(也就是说对应于图像的像素)中以指定的放大率成像的样品的区域。

因为在从相应照明事件期间所获取的图像数据确定(例如计算出)相关的像素区域的以及因此相关像素的产生的图像数据之前反复地照明每个像素区域，而出现与相应强度的每个像素区域关联的图像数据。

以所选择的强度之一的照明光对像素区域的任何照明构成照明事件。以相应选择的强度所照明的像素区域被称为子像素。照明间隔(称为像素驻留时间)分别由至少两个照明事件以及它们相应的时间周期构成。为了简化，子像素随后等同于照明事件。照明间隔因此分别由至少两个子像素以及它们相应的时间周期构成。

用作照明光的是至少成比例地由样品反射且作为检测光的光和/或通过其位于样品中的分子被激发以发射例如荧光的光且作为检测光的光。特别地当以点状的方式(扫描)采样像素区域时，有利地，照明光是激光。

因此检测光可以是荧光和/或照明光的反射的光谱部分。

根据本发明的方法区别于已知的方法在于，在最短可能的时间内完全得到像素区域的图像数据的获取。这有利地防止像素区域被精确地打击，例如在更新的照明的情况下对其顺序记录的情况下和/或在更新的照明和图像数据的获取发生之前基于时间已经改变像素区域的性质的情况下。后者特别是在生物样品中是相关的。有利地，保护了用于检测检测光的检测器并且通过根据本发明的方法显著地降低了样品上的负载。此外，在对样品的准调制的照明的情况下，有利地影响可能出现在样品中和/或样品上的荧光团。

在照明其他像素区域之前获取像素区域的所有子像素的图像数据的陈述是指所用的照明装置或照明束路径。在方法的可能的配置中，如果多个照明装置和/或多个照明束路径例如用于样品的多点采样，则在照明下一个像素区域之前通过每个照明装置或每个照明束路径照明并且获取像素区域的所有子像素。

在方法的可能的配置中，以持续递增的强度或者以持续递减的强度产生连续照明事件。通过方法的这个配置，借助于基于开关元件的已知的暂时上升响应来选择递增或递减强度，可以有利地利用用于执行方法的开关元件的暂时上升响应。

在方法的可能的配置中，借助于选择阶梯函数的函数值，基于阶梯函数选择连续照明事件的强度或像素区域的子像素。在这种情况下，可以针对阶梯函数的阶梯中的每一个有利地选择函数值，因为这些在时间周期内是恒定的。

基于阶梯函数的所选择的函数值产生控制命令，所述控制命令用于致动照明装置。

在此，如果阶梯函数的阶梯在它们的时间顺序和持续时间方面对应于照明事件或子像素，则是非常有利的。特别是当动态地(也就是说周期地或持续地)选择函数值时这是显著的。在这种情况下，如果选择的函数值在容许的公差极限内，则可以周期地或持续地产生控制命令和/或周期地或持续地检查控制命令。

如果照明事件具有非常短的持续时间，即实现短像素驻留时间，则阶梯相应地渐小。在这样的情况下，可以使用正弦函数，其中必须考虑在图像数据的随后评估中在照明事件或子像素期间产生的照明和强度的非线性。

因此，在方法的其他配置中，借助于选择正弦函数的函数值、基于正弦函数的所选择的函数值产生控制命令以及通过产生的控制命令致动照明装置，基于正弦函数，可选择像素区域的连续照明事件的强度。当例如atof或aotf晶体用作调制开关元件时，方法的这个配置使得例如对于1μs(微秒)的照明间隔的调制频率为500khz成为可能。

如果在该方法的其他配置中选择其他方法，则可以是高于或低于500khz的其他调制频率也是可能的。其他方法例如采用直接调制光源，特别是激光、声光调制器(aom)、电光调制器(eom)或声光分束器(aobs)。

阶梯函数或正弦函数表示致动曲线或致动函数。控制命令是用合适的机器语言的命令。

为了执行方法，开关元件有利地用于控制照明事件，所述开关元件的暂时上升响应能够由阶梯函数或正弦函数来表示。

这样的开关元件可以例如是aotf(声光滤波器)、eom、aobs或直接调制的激光器。

在获取图像数据的布置方面通过布置实现目的，该布置包括以各自不同的强度的照明光反复照明将要成像的样品的像素区域的照明装置。此外，该布置具有检测器和控制单元：该检测器针对每个照明事件检测随后从像素区域发出的检测光作为子像素的图像数据，并且该控制单元致动照明装置。控制单元用来并且设计为，在照明事件或子像素期间以照明光的相应选择强度来照明相应像素区域。

该布置的特征在于，控制单元配置为使得借助于选择函数的函数值、基于函数的所选择的函数值产生控制命令以及提供所产生的控制命令以致动照明装置，基于规定的函数来选择相应选择且所用的强度。

可以由发生器来产生控制命令，该发生器是控制单元的部件或者以适合于数据交换的方式加入到控制单元。

在布置的其他配置中，控制单元包括开关元件，可以由阶梯函数或由正弦函数来表示该开关元件的暂时上升响应。例如可以图形化或通过数学计算规范来表示函数。开关元件有利地是aotf。

在激光扫描显微镜中可以有利地出现根据本发明的布置。

附图说明

下面基于示例性实施例和附图更详细地解释本发明。附图中：

图1示出了三个连续照明事件、其子像素以及两个阶梯函数和正弦函数的示例的示意图；以及

图2示出了具有获取图像数据的布置的显微镜的示例性实施例的示意图。

具体实施方式

图1以x轴为时间轴线的曲线图示意性示出了三个连续照明间隔b1至b3。在每个照明间隔b1至b3(还称为像素驻留时间)期间，在相同持续时间之上以具有四个各自不同强度的照明光bl照明像素区域pb(参见图2)，对于第一照明间隔b1表示为第一至第四子像素sp1至sp4。

图1作为示例示出了可以用在根据本发明的方法中的三种可能的函数类型的概览。函数的函数值被绘制在y轴y的方向上。

第一阶梯函数sf1随着照明间隔b1至b3的持续时间逐步升高，其中关于暂时的位置及其持续时间每一阶梯对应于相关照明间隔b1至b3中的相应的子像素sp1至sp4。在每个照明间隔b1至b3的结束时，第一阶梯函数sf1跳回至起始值。第一阶梯函数sf1因此在每个照明间隔b1至b3期间以离散的阶梯增加。

第二阶梯函数sf2随着第一照明间隔b1的持续时间逐步升高，随着第二照明间隔b2的持续时间逐步降低，再次随着第三照明间隔b3的持续时间逐步升高。

对于每个照明间隔b1至b3，正弦函数fsin通过半个振荡周期。

图2中示意性示出了图像获取的布置1的示例性实施例。布置1是显微镜0(未更详细示出)的部分并且包括以各自不同的强度的照明光bl反复照明将要成像的样品6的像素区域pb的照明装置2。照明装置2包括激光的光源2.1以及对照明光bl的强度进行受控制的影响的开关元件3。在开关元件2(在这种情况下形式为aotf)中调制照明光bl的强度。调制的照明光bl入射在形式为半透明反射镜4的分色器上，并且通过半透明反射镜4穿过物镜5在像素区域pb中反射到样品6上。在照明的像素区域pb中，由照明光bl的效应产生检测光dl。例如，样品6的分子被激发以产生荧光辐射作为检测光dl。检测光dl穿过物镜5行进至半透明反射镜4，其对于检测光dl的波长是透射式的。通过检测器7检测透射的检测光dl。

开关元件3和检测器7通过数据通道(示意性示出的)被连接到控制单元8并且由此可以被致动。此外，可以由控制单元8读出检测器7。

为了能够在计算和储存单元9上传输由检测器7读出的数据，将控制单元8连接到计算和储存单元9。

在其他可能的实施例中，以适合于数据和控制命令的传输的方式将控制单元8附加地或替代地连接到光源2.1。

例如通过线缆、导体、无线电和/或光传输路径实现这样的连接或数据通道。

为了实行根据本发明的方法，选择图1所示的函数sf1、sf2和fsin之一并且使其可用于控制单元8。此外，预先设定以下事实：针对每个照明间隔b1至b3旨在确定相等长度的四个子像素sp1至sp4的图像数据。

作为示例，其他解释参考第一阶梯函数sf1。

控制单元8配置为，使得借助于选择第一阶梯函数sf1的函数值、基于规定的第一阶梯函数sf1选择强度。随着时间(x轴x)绘制的函数值(y轴y)表示与时间点关联的照明光bl的强度。

在示例性实施例中，动态选择第一阶梯函数sf1的所有函数值，也就是说基于第一阶梯函数sf1随时间持续地确定(例如计算出或读出)函数值。将所选择的函数值中的每一个翻译成命令，该命令适合于致动开关元件3。提供产生的控制命令以致动照明装置2，在示例性实施例中特别地致动开关元件3，并且使用所述控制命令致动照明装置2。

在第一照明间隔b1期间，用第一强度的照明光bl在第一子像素sp1的周期上照明像素区域pb，其中由在时间方面与第一子像素sp1对应的第一阶梯函数sf1的阶梯的函数值给定第一强度。通过物镜5收集像素区域pb中由于具有第一强度的照明光bl所引起的检测光dl并且将该检测光dl偏转到检测器7上，通过该检测器7以至少一个测量值(图像数据)的形式检测该检测光dl并且以与像素区域pb和第一子像素sp1关联的方式储存该检测光。

还如上所述针对子像素sp2至sp4中的每一个执行该方法。在第一照明事件b1的结束时，确定从子像素sp1至sp4的图像数据所产生的像素区域pb的图像数据。

储存子像素sp1至sp4的图像数据还可以被执行在控制单元8中，该控制单元8还可以配置为评估单元。

然后，通过根据本发明的方法，关于作为示例示出的照明间隔b2和b3，针对其他像素区域pb确定产生的图像数据。因此，可以从大量的图像区域pb的产生的图像数据编译样品6的图像文件。还可以通过控制单元8执行这些步骤。

为了使例如传输到计算和储存单元9的图像文件中的数据量最小化，根据本发明的方法尽可能是局部的，特别是通过出于该目的配置且装备的控制单元9。

附图标记

0显微镜

1布置

2照明装置

2.1光源

3开关元件

4半透明反射镜

5物镜

6样品

7检测器

8控制单元

9计算和储存单元

sf1第一函数

sf2第二函数

fsin正弦函数

bl照明光

dl检测光

pb像素区域

sp1第一子像素

sp2第二子像素

sp3第三子像素

sp4第四子像素

b1至b3第一至第三照明间隔

xx轴

y轴