一种用于平面样本快速对焦拍照的方法与流程

本发明属于样本成像技术领域，具体涉及一种用于平面样本快速对焦拍照的方法。

背景技术

在生物医药领域，往往需要对各类样本进行显微扫描成像，如单细胞生物、小型藻类、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药、血液、脓液、皮肤组织液、咽壁等；各种样本往往是先固定在医学载玻片上，再将载玻片对应放置及固定在显微扫描成像装置的载物台上，通过载物台在扫描成像平面上沿x轴、y轴方向的移动，使得样本依次通过镜头的对焦平面，通过镜头对样本上各点分别成像，然后把各点的成像经过拼合形成整个医学样本的像。

目前，运用显微扫描成像装置对样本进行扫描时，往往需要将载玻片上的样本待扫描平面分为多个等分的区域，如附图5中所示的m×n个区域，即样本扫描平面的长度方向和宽度方向分别均分为n个等份和m个等份，形成m×n个尺寸相同的扫描区域，继而对每个扫描区域进行拍照，并最终将各个扫描区域拍照的结果依次进行拼合，形成样本最终的扫描图像。

在现有技术中，为保证扫描成像图片能够满足软件识别的要求，其清晰度往往要求较高，并且样本的扫描时间也不能太长，必须在某一规定的时间内完成整个样本平面的拍照。但是，运用现有的显微扫描成像方法去实现样本的高清晰度成像时，往往需要装置的镜头对样本平面划分的每个区域进行自动精确对焦，继而再完成每个区域的对应拍照，而目前镜头对每个区域的自动精确对焦往往至少需要3秒时间，且m×n个区域往往不少于800个，即用于样本平面对焦的时间就会不少于40分钟，这使得样本扫描的时间太长，即使一天工作8个小时也仅能扫描成像12个样本左右，这比人工操作的效率(约25个/天)还低，极大地制约了样本扫描成像的效率，提升了样本高清晰度扫描的扫描成本，制约了样本的快速扫描成像，无法充分满足样本快速、精确成像的需求，具有较大的应用局限性。

技术实现要素：

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种用于平面样本快速对焦拍照的方法，其通过将平面样本的待对焦拍照平面均分为多个单元区域，并在待对焦拍照平面上优选三个离散点，进而分别准确计算得到各离散点的对焦距离，再以插值法计算各单元区域的对焦距离，继而结合各单元区域的对焦距离来控制镜头快速移动，有效实现了镜头与样本区域的快速对焦，从而无需每次调整镜头的焦距，便可完成各单元区域的准确拍照，大大提升平面样本成像过程中的对焦速度，缩短样本扫描成像的时间，提升样本扫描成像的效率和准确性，充分满足平面样本快速、精确成像的需求。

为实现上述目的，本发明提供一种用于平面样本快速对焦拍照的方法，其步骤如下：

s1：将平面样本的待对焦拍照区域分别沿长度方向和宽度方向划分为n个等份和m个等份，形成m×n个单元区域；

s2：在待对焦拍照区域中选取a、b、c三个离散点，即a、b、c三个离散点形成的平面为所述平面样本所处的样本平面；

s3：保持镜头的焦距不变，分别调节镜头与三个所述离散点之间的距离，依次实现所述镜头对各所述离散点的对焦，得到各所述离散点的对焦距离；

s4：根据各所述离散点的对焦距离，采用插值法分别计算出各所述单元区域的对焦距离；

s5：根据各所述单元区域的对焦距离依次完成各所述单元区域的对焦拍照，从而完成所述平面样本的快速对焦拍照。

作为本发明的进一步改进，步骤s4中还包括各所述单元区域对焦距离的修正步骤，其步骤如下：

通过对两相邻所述单元区域的重合区域进行清晰度值对比，当两者清晰度值之差大于设定的阈值时，所述镜头采用清晰度值高的单元区域的对焦距离对清晰度值低的单元区域进行重新对焦拍照。

作为本发明的进一步改进，各所述离散点的对焦距离通过如下步骤来确定：

s31：控制所述镜头与任意所述离散点对正，两者的距离为h1，并根据清晰度计算函数计算得到此时的清晰度值f1；

s32：控制所述镜头相对所述离散点沿轴向移动一个较小的距离h，计算得到此时的清晰度值f2，对比f2与f1值的大小，当f2大于f1时，表明所述镜头的移动方向为对焦方向，反之，所述镜头移动方向的相反方向为对焦方向；

s33：控制所述镜头依次沿所述对焦方向移动i次距离h，i为整数且不小于2，并分别计算得到每次移动后的清晰度值，直至第i次的清晰度值小于第(i-1)次时的清晰度值，即fi小于f(i-1)，完成所述镜头的粗对焦；

s34：控制所述镜头依次沿所述对焦方向的相反方向移动j次距离l，j为不小于2的整数，且0.001h≤l≤0.1h，并分别计算得到每次移动后的清晰度值，直至第j次的清晰度值小于第(j-1)次时的清晰度值，即fj小于f(j-1)，继而所述镜头回退距离l后停止移动，完成所述镜头的精对焦，即此时所述镜头与对应离散点的距离为该离散点的对焦距离。

作为本发明的进一步改进，所述插值法为线性插值法、抛物线插值法和样条插值法中的一种或者多种。

作为本发明的进一步改进，所述单元区域为正方形区域。

作为本发明的进一步改进，步骤s5中各所述单元区域的依次对焦拍照的步骤如下：

控制所述镜头沿所述平面样本的长度方向自一端移动到另一端，完成一行所述单元区域的对焦拍照，继而控制所述镜头沿宽度方向移动至相邻一行，并沿所述平面样本的长度方向依次完成该行中各所述单元区域的对焦拍照，以此类推，依次完成m×n个所述单元区域的对焦成像。

作为本发明的进一步改进，步骤s5中各所述单元区域的依次对焦拍照的步骤如下：

控制所述镜头沿所述平面样本的宽度方向自一端移动到另一端，完成一列所述单元区域的对焦拍照，继而控制所述镜头沿长度方向移动至相邻一列，并沿所述平面样本的宽度方向依次完成该列中各所述单元区域的对焦拍照，以此类推，依次完成m×n个所述单元区域的对焦成像。

作为本发明的进一步改进，m的值等于n的值，且所述单元区域为正方形。

作为本发明的进一步改进，h等于100μm。

作为本发明的进一步改进，l等于1μm。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

(1)本发明的用于平面样本快速对焦拍照的方法，其通过将平面样本的待对焦拍照平面均分为多个单元区域，并在待对焦拍照平面上优选三个离散点，进而分别准确计算得到各离散点的对焦距离，再以插值法计算各单元区域的对焦距离，继而结合各单元区域的对焦距离来控制镜头快速移动，有效实现了镜头与样本区域的快速对焦，从而无需每次调整镜头的焦距，便可完成各单元区域的准确拍照，大大提升了平面样本成像过程中的对焦速度，缩短了样本扫描成像的时间，提升了样本扫描成像的效率和准确性，充分满足了平面样本快速、精确成像的需求；

(2)本发明的用于平面样本快速对焦拍照的方法，其通过对焦距离的测试步骤来对应完成各离散点对焦距离的准确获取，且通过粗对焦和精对焦的配合调整，可有效保证对焦距离测试的准确性，提升对焦距离获取的效率和对焦拍照的清晰度；

(3)本发明的用于平面样本快速对焦拍照的方法，其通过对应设置对焦距离的修整步骤，有效避免了当相邻两单元区域的平面度存在一定差异时所引入的对焦距离误差，充分保证了平面样本各位置对焦拍照的清晰度；

(4)本发明的用于平面样本快速对焦拍照的方法，其通过计算各离散点的对焦距离并运用插值法计算各单元区域的对焦距离，对焦距离的确定便捷可靠，可进一步提升平面样本的对焦拍照效率，缩短平面样本对焦拍照的时间；

(5)本发明的用于平面样本快速对焦拍照的方法，其步骤简单，操作简便，能通过镜头的快速移动实现平面样本各单元区域的快速对焦，从而无需通过每次调整镜头的焦距来实现平面样本对应区域的对焦拍照，有效减少了镜头对焦的时间，提升了平面样本对焦拍照的效率，保证了平面样本对焦拍照的清晰度，降低了样本对焦拍照的成本，具有较好的推广应用价值。

附图说明

图1是本发明实施例中用于平面样本快速对焦拍照的方法步骤示意图；

图2是本发明实施例中用于平面样本快速对焦拍照的方法中离散点对焦的方法步骤示意图；

图3是本发明实施例中离散点a、b、c的位置关系示意图；

图4是本发明实施例中显微扫描成像装置的镜头与样本平面的位置示意图；

图5是本发明实施例中平面样本待对焦拍照平面的划分及拍照路线示意图；

在所有附图中，同样的附图标记表示相同的技术特征，具体为：m.样本平面沿宽度方向等分的数量；n.样本平面沿长度方向等分的数量；a.样本平面；b.镜头；h.镜头距样本平面的距离；a.离散点；b.离散点；c.离散点。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明优选实施例中用于平面样本快速对焦拍照的方法，其步骤如图1和图2中所示，其通过显微成像装置来完成样本的各待对焦拍照区域的快速对焦拍照；具体地，优选实施例中通过如下步骤来完成镜头b对样本平面a上平面样本的快速对焦拍照：

s1：如图5中所示，将平面样本待对焦拍照区域分别沿长度方向和宽度方向划分为n个等份和m个等份，继而形成m×n个相同的单元区域，优选实施例中的m、n分别优选为不小于2的整数；进一步地，如图3所示，在划分好的区域内选取a、b、c三个离散点，继而a、b、c三个离散点形成的平面即为平面样本所处的样本平面a；进一步优选地，a、b、c三个离散点分别设置在四个相邻单元区域的相交点上，三个离散点的对应连线可组成如图3中所示的三角形abc，该三角形所处的平面即为平面样本所处的平面。

s2：保持镜头b的焦距不变，分别调节显微成像装置(如相机)与a、b、c点之间的距离，即调节显微成像装置的高度，依次实现对a、b、c点的对焦，得到该三个点的对焦距离；

进一步地，优选实施例中对a、b、c点的对焦优选通过如下步骤来确定，如图2中所示。

s21：如图4中所示，控制镜头b运动到与a、b或者c点竖向对正的位置，此时镜头b与对应点(如a离散点)的距离为h1，该h1即为对焦距离的初始值，运用清晰度计算函数对应计算出此时的清晰度值f1；需要说明的是，优选实施例中的清晰度计算函数为现有技术中运用较为成熟的技术，故而在此不做赘述，且清晰度值越大，表明对焦点越趋近于正确位置，即图片越清晰；

s22：将镜头b沿轴向竖向移动一个较小的距离h，使得镜头b进一步靠近对应的离散点(如a离散点)，即镜头b向下移动一定距离h，由清晰度计算函数计算得到此时的清晰度值f2，当f2大于f1时，表明f2对应的图片清晰度高于f1对应的图片清晰度，即调焦方向向下；反之，当f2小于f1时，调焦方向向上，从而确定镜头b的调焦方向；

s23：控制镜头b沿调焦方向继续移动距离h，并由清晰度计算函数计算得到清晰度值f3，当f3大于f2时，镜头b继续沿调焦方向移动距离h，继而得到清晰度值f4，通过f4与f3进行比较，如此重复进行，直到当fi小于f(i-1)时，镜头b的移动停止，即可完成镜头b的粗对焦，此处所记载的i优选为不小于2的整数；

s24：控制镜头b沿与步骤s23中调焦方向相反的方向移动距离l，其中，0.001h≤l≤0.1h，继而得到清晰度值k1，通过k1与fi比较，当k1大于fi时，镜头b继续移动距离l，得到清晰度值k2，对比k1与k2，当k2大于k1时，镜头b继续移动距离l，如此重复进行，直至当kj小于k(j-1)时，镜头b回退距离l后停止移动，即可完成镜头b的精对焦，此处所记载的j优选为不小于2的整数。

通过上述步骤的调整，使得镜头b与a、b或者c点的竖向距离为h2，该h2即为a、b或者c点的对焦距离。

s3：通过步骤s2分别完成三个离散点a、b、c对焦距离的确定后，采用插值法分别计算出样本平面a中m×n个单元区域拍照成像时的对焦距离；且优选实施例中的插值法可进一步优选为线性插值法、抛物线插值法和样条插值法中的一种或者多种，从而得到各单元区域拍照时的对焦距离。

s4：控制镜头b按一定顺序依次完成样本平面a上m×n个单元区域的拍照成像，每次拍照前，均根据步骤s3中计算得到的对焦距离沿竖向快速调整相机的高度，即快速调节镜头b与样本平面a之间的距离，实现对m×n个单元区域的快速对焦拍照。

进一步优选地，步骤s4中镜头b的拍照顺序优选如图5中的箭头方向所示，即先在左侧第一列区域沿纵向依次拍照，再横向向右移动至相邻一列，沿相反方向依次拍照；再横向向右移动至相邻一列，沿相反方向依次拍照，如此往复，直至完成所有单元区域的拍照。

此外，由于样本平面a的平面度存在一定的偏差，使得个别单元区域的对焦距离可能会略微有所偏差；因此，为提高图片的清晰度，优选实施例中提供有对焦距离的修复步骤，如下所示：

s5：镜头b在进行拍照时，相邻单元区域的两张图片在边缘处存在重合区域，对这两张图片的重合区域进行清晰度值对比，当两者清晰度值之差大于某一阈值δf时，相机采用清晰度值高的单元区域的对焦距离对清晰度值低的单元区域进行重新对焦拍照。

通过步骤s1～s5，可快速、准确地实现载玻片上平面样本的清晰拍照，缩短镜头调焦的时间，提升样本的扫描成像效率。

在一个具体实施例中，平面样本的待对焦拍照区域为10×10mm的正方形平面，且步骤s1中的m＝n＝10，即将平面样本的待对焦拍照区域划分为100个大小均等并呈正方形的单元区域；进一步地，该优选实施例中的距离h等于100μm，且l优选等于1μm。当然，优选实施例中的m、n、h、l等值也不局限于上述所优选的数值，其可根据实际需要进行优选，在此不作具体限定。

本发明优选实施例中用于平面样本快速对焦拍照的方法，其步骤简单，操作简便，通过将平面样本的待对焦拍照平面均分为多个单元区域，并在待对焦拍照平面上优选三个离散点，进而分别准确计算得到各离散点的对焦距离，再以插值法计算各单元区域的对焦距离，从而无需每次调整镜头的焦距，便可完成各单元区域的准确拍照，大大提升样本成像过程中的对焦速度，缩短样本扫描成像的时间，提升样本扫描成像的效率和准确性，充分满足样本快速、精确成像的需求，保证平面样本成像的清晰度，具有较好的应用推广价值。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。