3轴侧视共聚焦荧光显微内镜的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35u.s.c.§119(e)要求2017年7月24日提交的题为“3轴侧视共聚焦荧光显微内镜(3-axisside-viewconfocalfluorescenceendomicroscope)”的美国临时专利申请第62/536,285号的优先权，其公开内容通过引用以整体并入本文。

政府利益的声明

本发明是在美国国家卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)授予的授权第ca142750号的政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。

本公开总体上涉及使用光学仪器对组织成像的技术，并且更具体地，涉及用于允许使用侧视光学仪器进行二维(2d)和三维(3d)成像的技术。

背景技术：

本文所提供的背景描述是出于总体上呈现本公开背景的目的。在此背景技术部分中所描述的程度范围内，当前署名的发明人的工作以及在申请时以其它方式可能未视为现有技术的描述方面，均不明确或暗示地承认为反对本发明的现有技术。

大部分内部和外部体表被上皮覆盖，其为几百微米大小的薄组织层，并起着强烈生物活性的来源的作用。上皮用作电解质传输的底物，以及组织再生的来源。上皮还用作肿瘤形成的起源。

由于上皮的多种不同的生物学功能，研究人员以各种方式对其进行研究。例如，研究人员对小鼠进行基因工程改造来表达光报告基因，这些报告基因被用于研究上皮对传输效应、屏障效应和增殖的调节。这些研究通常通过对离体组织进行组织学分析来验证。然而，这种方法有很多局限性，包括其仅在有限的时间点提供静态信息。相比而言，实时活体显微镜已经被开发用来跟踪先天宿主环境中细胞随时间的运动。特别地，共聚焦显微镜已成为一种上皮光学成像的有效方法。共聚焦显微镜允许进行切片，切片可以穿透到组织内数百微米，这意味着具有适当尺寸和几何形状的仪器可以重复用于监测上皮过程。遗憾的是，常规的共聚焦显微镜设备大且笨重，并且需要大范围的外科手术暴露，这可能会引起显著的创伤。

迄今为止，用于研究上皮中细胞行为的共聚焦技术一直受到缺乏可以容易地操纵并准确定位以可视化个体细胞的仪器的限制。通常，共聚焦显微内镜检查使用柔性光纤以最小化侵入性。当前的共聚焦仪器使用仅在水平平面中采集图像的前视光学器件。因为需要与组织牢固接触才能耦合光，所以这种方向限制了其在多种应用中的可用性，包括在检查小动物的上皮时。希望有一种能够以更准确和更灵活的方式检查上皮的改进的共聚焦显微镜仪器。

技术实现要素：

本申请描述一种手持式光学设备，其可以用作用于实时三维(3d)光学成像的显微镜系统。更具体地，本申请描述具有侧视光学器件的共聚焦显微内镜，所述侧视光学器件允许将显微内镜精确地定位以对组织进行成像。配置有侧视光学器件的共聚焦显微内镜可以从显微内镜侧面照亮血管，而不是通过在常规设备情况下的端视。结果是可以使用侧面照明成像束对组织成像。此外，由组织中的生物目标产生的荧光也通过侧视来采集。所述侧视配置提供了更小的设计，而没有可能伴随前视显微内镜的对组织进入或组织成像的限制。作为这种组合的侧面照明和侧视的结果，本技术首次提供了对小动物上皮中体内个体细胞的精确可视化，包括例如表达荧光团tdtomato的细胞。

而且，具有侧视光学器件的共聚焦显微内镜可以在受检者的更狭窄、更有限的管腔中成像，该管腔迄今为止通过显微内镜成像无法进入。例如，上皮细胞在垂直平面内迁移和分化；并且根据本文教导的侧视共聚焦显微内镜能够在垂直方向上执行光学切片，以通过从显微内镜的侧视照亮并检查组织来研究细胞功能。

在示例性实施例中，一种共聚焦显微内镜使用具有侧视光学器件的小型、快速的3轴扫描仪来采集水平或垂直平面中的荧光图像，以使例如体内的个体细胞可视化。

根据一实例，一种光学探针扫描组件包括：壳体，其具有被配置为接收光纤束源的近端和用于定位在样本处的远端，所述壳体具有沿从近端到远端延伸的纵向轴线延伸的长度；光学聚焦组件，其被配置为沿轴向光束路径聚焦来自光纤束源的输出光束；以及反射镜扫描组件，其位于物镜后位置处的光学聚焦组件的下游，所述反射镜组件相对于轴向光束路径成一定角度定位，从而使输出光束偏转到横向轴线以从壳体的侧面发射输出光束，反射镜组件被进一步配置为沿第一轴线和第二轴线旋转以沿横向平面扫描输出光束，并且被配置为在第一轴线和第二轴线的平面外平移以沿倾斜平面扫描输出光束。

附图说明

为了更完整地理解本公开，应当参考以下详细描述和附图，其中，相同的附图标记表示图中的相同元件，并且其中：

图1示出根据一实例的示例性光学探针扫描系统的示意图。

图2a是根据一实例的经由smf传递且在轴线上穿过用于聚焦的透镜l2-l3的激发光束的示意图。3轴反射镜m2位于物镜后位置，并以90°反射光束。图2b是示出在一实例中当(图2a的)m2围绕x轴和y轴旋转时焦点横向移动的示意图。图2c是示出在一实例中当m2在z轴上平移时焦点沿倾斜平面同时在轴向和横向上移动的示意图。

图2d至图2f示出了当m2在z轴上位于+105μm、0μm和-105μm时光线轨迹模拟分别产生1.51μm、1.12μm和1.53μm的光斑大小。焦点轴向移动到+90μm、0μm和-110μm(200μm)的深度，且横向移动到-101μm、0μm和112μm(213μm)处，从而导致在倾斜平面上292μm的总位移。图2g是根据多个实例的通过像m2的反射镜的不同位置线性移动，焦点的横向和z轴变化的示意图。

图2h是表示光线轨迹模拟的图示，其显示出水平平面中的预期视场(fov)为700×600μm²，同时x和y轴的镜面偏转分别为±10°和±8°。

图2i是在600×213μm²的水平平面上的倾斜投影的图示，其中在x轴上的横向镜面偏转为±8°并结合了在z轴上±100μm的轴向位移。

图3a示出根据一实例的光线轨迹模拟，其示出了当m2轴向平移时，入射光束在反射器表面上跨越的椭圆区域，其长轴和短轴分别为1800μm和1200μm。

图3b是根据一实例的附接到由静电梳状驱动致动器驱动的万向架框架的反射器的图示。如图3c至图3e的示意图所示，根据一实例，图3b的万向架联接至内部(图3c)和外部(图3d)多梁扭转弹簧并分别围绕x轴和y轴旋转。如图3e所示，根据一实例，图3b的万向架还联接至u形悬挂件，该u形悬挂件用作杠杆以使反射器在z轴上向平面外移位。

图3f是示出根据一实例的用于机械支撑和电连接的芯片上的扫描仪的照片。

图3g示出根据一实例的附接到保持器的芯片(厚度为550μm)。根据一实例，芯片的上下边缘(箭头)显示出预期有100μm的间隙以使内径(id)为3.8mm的不锈钢管穿过。图3h示出根据一实例的图3g的芯片的横向尺寸。

图3i示出根据一实例的光学探针扫描组件。图3j示出根据一实例图3的光学探针扫描组件被封装为4.2mm直径的侧视显微内镜，其中l4的平坦表面可以被放置成与组织接触以进行成像。

图4a至4c是3轴扫描仪的性能曲线图。对于所示的曲线图，在x轴(图4a)、y轴(图4b)和z轴(图4c)上使用驱动信号，其利用上扫描(低频到高频)或下扫描(高频到低频)来表征扫描仪的频率响应。分别针对x轴和y轴使用fx＝9.100和fy＝1.484khz的工作频率以在水平平面中成像，而针对x轴和z轴使用fx＝9.120和fz＝1.100hz的工作频率以在倾斜平面中成像。分别实现了±10°和±8°的横向偏转以及±105μm的轴向位移。当以xz模式驱动m2时，实现了200μm和213μm的轴向和横向位移，从而在倾斜平面中产生尺寸为292μm的图像。

图5a至图5e示出根据本文实例的光学探针组件的成像性能。图5a示出从网格目标采集的反射率图像，该反射率图像在水平平面中显示出700×600μm²的fov。图5b示出l4的平坦表面上水平平面中的扫描图案。图5c示出在倾斜平面中具有尺寸为292μm的微沟槽幻想的反射图像，其具有深度为200μm的之字形图案。图5d示出投影到l4上的倾斜平面的扫描图案。图5e示出在水平平面中的标准分辨率目标(usaf1951)的反射率图像，定性地显示了小于2μm的横向分辨率。可以清楚地看到(小图)第7组元素6的垂直和水平条。图5f示出通过跨刀刃目标的轮廓从最大强度的10％到90％的过渡宽度测量的在水平平面上的分辨率为1.19μm。图5g示出使用相同度量测量的在倾斜平面上的分辨率为3.46μm。

图6a至图6f是根据一实例的由光学探针组件捕获的表达tdtomato的小鼠结肠上皮的图像。使用lex＝561nm在水平平面中以z＝100μm的深度在体内从正常(图6a)和发育异常(图6b)小鼠结肠上皮采集光学切片。隐窝结构(箭头)的大小和形态上的差异是可以理解的。示出了来自正常(图6c)和发育异常(图6d)结肠上皮的倾斜表面图像。可以电子放大尺寸为80×80μm²的roi(小图)以区分个体细胞。以z＝20μm(图6e)和60μm(图6a)的深度体外验证了上皮隐窝结构的差异。关键词：隐窝(箭头)，管腔(l)，杯状细胞(g)，细胞质(c)，炎性细胞(箭镞)，固有层(lp)。

图7a是根据一实例的用于组装光学探针组件的组装台的透视图。图7b是组装台的照片，其示出了用于精确调节侧视光学器件中smf与l2之间以及l3与l4之间距离的固定装置。

图8a和图8b是使用光学探针组件成像的荧光幻象的图像，并且对于各个光学切片，是使用lex＝660nm在倾斜平面中从嵌入的15μm直径荧光珠(箭头)采集的。图8c是采集的堆叠倾斜图像的荧光幻象的三维(3d)体积图像，其被组合来构造3d体积图像。

图9a至图9d是根据一实例的由光学探针组件捕获的小鼠微解剖结构的近红外(nir)荧光图像。通过十二指肠上皮显示在水平平面中体外采集的nir荧光图像(图9a)，其中可见个体杯状细胞(g)围绕由固有层(lp)分隔的隐窝(箭头)结构内的中心管腔(l)。在回肠中(图9b)，在褶状圆形的管腔(l)内可见个体上皮细胞(e)和杯状细胞(g)。在图9c中，肝小叶显示了被肝三联(t)围绕并且被窦状隙(s)灌注的中央静脉(箭头)，并且在图9d中，肾脏显示了在肾皮质中收集肾小管(箭头)。

图10a至图10e是估计的肾小球滤过率(egfr)表达的近红外(nir)荧光图像。在系统注射cy5.5标记的egfr肽后，从小鼠结肠上皮采集荧光图像。显示了正常(图10a)和发育异常(图10b)的水平图像。显示了正常(图10c)和发育异常(图10d)的倾斜图像。在图10d中示出了通过组合从发育异常采集的倾斜图像堆叠而生成的3d体积图像。

图11示出示例性框图，该框图示出了根据各种实施例的在实施侧视共聚焦显微内镜的示例性实施例中使用的各种组件。

图12a至图12d是在以wd＝100μm注射rts*-cy5.5后1小时，来自正常(图12a)结肠粘膜和腺瘤(图12b)小鼠结肠上皮的体内图像。可以识别出隐窝结构和个体细胞。显示了在注射spt*-cy5.5之后正常(图12c)和腺瘤(图12c)的图像(对照)。图12e示出定量结果，其通过配对t检验显示出，在rts*-cy5.5情况下来自n＝9只小鼠的腺瘤的平均(±sd)荧光强度显著高于正常腺瘤。每个数据点代表来自一个腺瘤或邻近正常组织的3个独立roi的平均荧光值。图12f示出来自图12e的五只小鼠用于配对的spt*-cy5.5成像。通过对数转换后的两次样本t检验，腺瘤中rts*-cy5.5的平均(±sd)t/b比显著大于spt*-cy5.5。关键词：隐窝(箭头)，紧密连接部(箭镞)，管腔(l)，结肠细胞(c)，杯状细胞(g)，固有层(lp)。

图13a至图13c是在注射rts*-cy5.5后1小时拍摄的体内图像，显示为正常隐窝(图13a)，在急性炎症后肽渗入固有层(lp)(图13b)，以及在慢性炎症后隐窝再生(图13c)。图13d0至图13f示出相应的组织学染色的h&e(苏木精和曙红染色)。

具体实施方式

根据这些各种实施例，提供一种光学探针扫描组件。光学探针扫描组件包括壳体，其具有被配置为接收光纤束源的近端和用于定位在样本处的远端。壳体具有沿从近端到远端延伸的纵向轴线延伸的长度。包括光学聚焦组件，以沿轴向光束路径聚焦来自光纤束源的输出光束。光学聚焦组件的下游(其中下游是指在输出光束方向上的远侧或之后的位置)为3轴反射镜扫描组件。反射镜组件相对于轴向光束路径成一定角度定位，从而使输出光束偏转到横向轴线以从壳体的侧面发射输出光束。例如，横向光束路径可以正交于轴向光束路径，以用于从光学探针的侧视而不是从远端来发射输出光束。此外，反射镜组件可以被配置为沿第一轴线和第二轴线(例如，x轴和y轴)旋转，以沿横向平面(例如由侧视限定的水平平面)扫描输出光束。反射镜组件可以被进一步配置为沿第三轴线平移，以沿倾斜平面扫描输出光束。

本技术可以在共聚焦显微内镜设备中实施。共聚焦显微内镜是一种微创成像技术，用于研究例如活体动物的上皮生物学。利用本技术，开发出同时具有高数值孔径(na)光学器件和物镜后扫描功能的共聚焦显微内镜。共聚焦显微内镜使得能够以大视场(fov)实现亚细胞分辨率。通过利用这些设备，在由小鼠结肠上皮中采集的图像中可视化了体内的个体结肠细胞、杯状细胞和炎性细胞。其它成像方法(包括x射线、超声、计算机断层扫描(ct)和磁共振成像(mri))提供结构信息而不是功能信息，并且正电子发射断层扫描(pet)并不具有能够可视化单个细胞的适当速度或分辨率。

在示例性实施例中，本技术使用具有侧视操作的共聚焦显微内镜。与前视内窥镜设备相比，侧视允许用户对显微内镜进行旋转和平移操纵。用户可以沿血管的轴向长度并可旋转地围绕血管轴线移动侧视显微内镜。这意味着用户可以将侧视光学器件准确地定位在血管中的任意目标区域(roi)上。用户可以首先例如使用宽视野内窥镜识别roi，然后使用侧视共聚焦显微内镜对精确的位置成像。当试图在小血管(包括在小动物中找到的小血管)中对roi进行成像时，前视设备比较麻烦，因为难以实现与上皮的充分接触。这些显微内镜可能足够小到穿过血管并进入血管内，但前端未接触到人们期望检查的组织。此外，没有旋转相关的成像。

先前，展示了一种侧视显微内镜，其利用能够在水平平面中且仅在～100μm的固定深度上成像的二维(2d)扫描仪。

然而，本技术通过使用一种完全不同的配置提供了出乎意料的图像性能改进，这种不同的配置在显微内镜内配置了快速的整体式3轴反射镜。该配置首次提供了能够在垂直方向扫描的侧视光学器件。此外，通过调节对显微内镜的驱动频率，显微内镜可以可控制地在倾斜模式或活塞模式之间“切换”，即在水平平面和倾斜平面之间成像。更进一步，通过将扫描仪放置在物镜后位置，激发光束(来自侧面)在轴线上穿过聚焦透镜，使得可以在横向尺寸上扫描受衍射限制的光斑，从而增大fov。

作为本技术的结果，当成像时，降低了对像差的灵敏度，并且重要的是，可以缩小显微内镜的尺寸。例如，在一个示例性布置中，优化扫描器元件上的多光束扭转弹簧的尺寸(从而增大反射镜偏转角)使得能够实现700×600μm²的fov，该参数远大于任何先前报告的配置。此外，已经展示通过光学器件的缩放和控制运动引起的效果，可以实现低于10μm、低于5μm、低于2μm和低于1μm的成像分辨率。这些分辨率在水平和倾斜平面上可实现，并且由于以上原因在垂直平面上也可以实现。在示例性布置中，共聚焦显微内镜在水平和倾斜平面上分别获得1.19和3.46μm的分辨率，其横向fov为700×600μm²或垂直深度为200μm。如图所示，通过调整扫描仪的驱动信号并突出显示目标个体细胞，可以快速识别并以电子方式放大roi。如进一步示出的，通过利用本文所述的示例性侧视配置，可以使焦点在横向和轴向两个方向上移动来成像，并且在倾斜平面而不是在纯垂直平面上成像。随后可以从采集的3d体积图像中提取垂直平面。

本文所述的共聚焦显微内镜的快速3轴光束扫描能力为上皮的体内成像提供了若干技术进步。先前，已经展示了在桌面设置中使用附接到棱镜的渐变折射率(grin)透镜的侧视微探针。使用近端的振镜进行光栅扫描，该设计能够实现250×250μm²的fov，其中横向和轴向分辨率分别为1μm和10μm。机械旋转物镜以产生大范围的小鼠上皮图，并展示对结肠的重复成像。该设备无法进行垂直扫描。另一种设计，特别是基于谐振光纤的手持式前视共聚焦探针，展示了水平平面中光学切片的深度最大为250μm。对于前视共聚焦探针，扫描在远端进行，获得的fov为475×475μm²，其中横向和轴向分辨率分别为0.7μm和7μm。例如，使用alexa-fluor488标记的vegf特异性抗体在apc^min小鼠结肠中进行对vegf的体内成像。这种直径为5mm的刚性仪器需要对腹部进行宽范围的手术暴露，手术暴露的范围如此之大，以至于可能引起免疫介质的损伤反应。在又另一实例中，具有基于光线束的前视光学器件的柔性探针在水平平面中以范围在30μm至100μm之间的固定深度展示光学切片。此时，扫描利用振镜在近端进行，分别获得160×120μm²的fov以及2.5μm和20μm的横向和轴向分辨率。光纤束限制了图像分辨率，并且需要单独的微型探针来在不同的水平平面中成像。所有这些传统的共聚焦探针设计都显示出明显低于本技术所能实现的性能。

图1示出了根据示例性布置的成像系统的示意图，并且其命名如下：dm-二向色镜，m-反射镜，fm-回转镜，smf-单模光纤，l-透镜，bpf-带通滤光片，pmt-光电倍增管。根据一示例性实施例，侧视光学器件标记了光学探针扫描组件。如特定实例中所示，使用两个固态二极管激光器提供在lex＝561和660nm上的荧光激发。可见光束(例如，在561nm上)穿过二向色镜(dm1)，并被静态反射镜m1以90°反射。nir光束(例如，在660nom上)穿过第二二向色镜(dm2)。回转镜(fm)用于在两个光源之间切换。光束由透镜l1聚焦到纤芯为3μm的2m单模光纤(smf)中。离开smf的光束由侧视光学器件(l2-l4)聚焦，并由微型3轴反射镜m2扫描，以在水平或垂直平面中生成图像。在一示例性实施例中，反射镜m2可被实现为反射镜扫描组件的一部分。

荧光由相同的光学器件(l2-l4)采集，由m2去扫描，然后聚焦回smf。透射后，荧光通过l1准直，从m1、dm1和m3或fm、dm2和m4反射。光电倍增管(pmt1)和(pmt2)分别检测通过带通滤光片(bpf1)或(bpf2)的可见光或近红外荧光。可以使用高速电流放大器来增强信号，该信号由多功能数据采集板进行数字化，该多功能数据采集板还生成驱动扫描仪的控制信号，并由定制软件进行控制。

在侧视光学器件和设计方面，在一示例性实施例中，离开smf的光由透镜l2准直并由l3(na＝0.25)聚焦，如图2a所示。聚焦光束被m2反射90°进入l4(na＝0.375)，导致总的na＝0.38。当m2围绕x轴和y轴旋转时，焦点将横向移动，如图2b所示。当m2沿z轴平移时，焦点沿倾斜方向移动，如图2c所示。当m2在z轴上的位置为+105μm、0μm和-105μm时，艾里斑的光斑大小分别为1.51μm、1.12μm和1.53μm，如图2d-f所示。m2在z＝0μm时达到1.19μm的衍射极限。焦点在+90μm到-110μm(总共200μm)之间的深度垂直移动，并从-101μm到+112μm(总共213μm)侧向移动，如图2g所示，由此在倾斜平面中扫描。在倾斜平面中越过的总尺寸为292μm。沿x轴和y轴的横向镜面偏转分别为±10°和±8°，在水平平面中产生700×600μm²的fov(参见图2h)，而沿x轴的±8°的横向偏转与沿z轴的±105μm的轴向位移相结合，在倾斜平面中产生600×292μm²的fov(如图2i所示)。所有透镜均安装在内径(id)小于3.8mm的管内。

在具有图1的构造并且如图3a-3j所示的光学探针组件的一示例性实施例中，反射镜m2可以形成为位于诸如透镜l2和l3的光学聚焦组件下游的反射镜扫描组件的一部分。透镜l4可以作为采集光学组件定位在反射镜的下游，并且具体地在“壳体”的侧面表面(参见图3i)上以用于侧面照射和侧面观察。来自聚焦组件的入射光束在m2反射器表面上形成椭圆形(参见图3b中标记为“反射器”的m2的示例性实施方式，能够在三个维度上进行扫描)。在一实例中，当m2在z轴上平移时，扫描区域可以以长轴和短轴分别为1800μm和1200μm的尺寸覆盖，如图3a中示意性所示。在一实例中，使用这种几何形状来设计整体式3轴扫描组件或显微内镜，如图3b所示。扫描组件包括反射入射辐射的内部反射器。扫描组件包括u形“悬挂件”和“致动器”，该致动器使反射器沿3个不同的移动轴移动以进行扫描。即，反射器可以相对于入射辐射的轴向光束路径成一定角度定位，以将该辐射偏转到横向轴线中，以发射到壳体的侧面。扫描组件可以被配置为沿第一轴线和第二轴线旋转，以沿横向平面扫描输出光束，并在第一轴线和第二轴线的平面外平移，以便也沿倾斜平面扫描输出光束。

反射镜扫描组件的频率响应可以由一组“内部”和“外部”多梁扭转弹簧确定。反射器安装在围绕x轴和y轴旋转的“万向架”上，如图3c和图3d所示。在其它示例中，万向架用于围绕这两个轴之一旋转。万向架附接至u形“悬挂件”，当在共振状态下驱动时，该悬挂件用作杠杆将反射镜向平面外提升(图3e)。

在示例性实施例中，壳体的尺寸被设计成在一端接收单模光纤(“smf”)，以用于向光学扫描组件提供照射光束和从光学扫描组件接收图像(例如，荧光图像)。在其它示例性实施例中，壳体的尺寸被设计成接收多模光纤作为照射光束源。在图3i的所示实例中，壳体包括与扫描头端相对的光纤接收器以用于接收光纤。

在一些实施例中，smf(或多模光纤)可以联接至一个或多个光电检测器，该光电检测器被配置为接收来自样本的辐射，如从光学扫描组件采集并用于构造样本的2d或3d图像的辐射。例如，响应于沿壳体的侧面发射的输出光束的照射而从样本发射的荧光可以被采集并且转换为如本文的实例中所描述的2d或3d图像。从样本发射的荧光可以包括可见光子和/或近红外光子。

在示例性实施例中，壳体的外径为10mm或以下，并且优选地为4mm或更小。

在示例性制造过程期间，使用对准固定装置来精确调整各个光学器件之间的距离，参见图7a和图7b。我们制造一种用来支撑m2的芯片，并使用连接到铝(al)线(小图)的铜(cu)引脚来传递驱动信号(图3f)。附图显示了附接到保持器的扫描仪芯片(图3g)，并提供了横向芯片尺寸的示意图(图3h)。在图3i和图3j中示出了组装好的仪器的图示和照片。

具有侧视共聚焦配置的光学扫描探针组件能够实现稳定的扫描，因此具有高成像分辨率。在实例中，成像分辨率为或等于10μm，等于或低于5μm，等于或低于2μm，或等于或低于1μm。

在检查图2和图3的示例性光学探针组件(例如共聚焦显微内镜)的操作时，我们将不同组的驱动信号应用于扫描仪以实现期望的图像尺寸和帧速率，参见表1。

在一实施例中，在驱动频率中使用向下扫描(从高到低)以在x或y轴上实现大于±10°的最大横向机械扫描角，如图4a和4b所示。还使用向下扫描以在z轴上产生大于300μm的最大平面外位移，如图4c所示。通过调节驱动频率以激活倾斜模式或活塞模式，可以将扫描仪“切换”到在水平或倾斜平面上成像。通过使用60vpp的正弦波，分别以fx＝9.100和fy＝1.480khz驱动x和y轴，以分别产生±10°和±8°的机械扫描角，从而在水平平面中实现600×600μm²的fov以用于体内成像。fov略微减小，以便以每秒10帧的速度更快地成像。在fx＝9.120khz上以60vpp的正弦波驱动x轴，在fz＝1.100khz上以35％占空比和60vpp的方波驱动z轴，从而在倾斜平面上实现600×292μm²的fov。

在光学探针扫描组件的示例性实施方式中，通过使用由100×100μm²的框组成的网格目标，在水平平面中对整个700×600μm²的fov验证了侧视共聚焦显微内镜的性能，如图5a所示。在图5b中可以在l4的平坦表面上看到扫描图案。如图5c所示，使用以之字形图案蚀刻的微沟槽幻象确认200μm的垂直成像深度。图5d示出了扫描图案在l4上的倾斜平面中的投影。从水平平面中的标准分辨率目标采集反射图像，以定性估计～2μm的横向分辨率(图5e)。第7组元素6的条清晰可见(小图)。从跨越刀刃目标的线轮廓的最大强度的10％到90％之间的过渡宽度量化1.19μm的横向分辨率(图5f)。使用类似的度量在倾斜平面中测量到3.46μm的分辨率(图5g)。使用该仪器从由嵌入的15μm直径的荧光珠组成的幻象在倾斜平面中采集荧光图像(图8a和图8b)。将倾斜图像的堆叠进行组合以形成3d体积图像(图8c)。

在光学探针扫描组件的示例性实施方式中，通过使用来自小鼠结肠上皮的可见激发，使用侧视共聚焦显微内镜来在体内采集共聚焦荧光图像，该小鼠结肠上皮组成性表达tdtomato并自发形成腺瘤。可以在小鼠结肠中轻松地操纵该仪器，以将成像光学器件准确地定位在上皮roi上。在水平平面中，将来自正常结肠的组织良好的隐窝结构(箭头)进行可视化，如图6a所示。相比而言，发育异常的隐窝(箭头)看起来尺寸增大且形状变形(图6b)。在倾斜平面中，正常隐窝呈椭圆形且大小均匀，如图6c所示，但发育异常的隐窝形状细长且尺寸多变，如图6d所示。将帧速率降低至每秒2个以进行体外成像，并增大扫描仪的驱动电压，以电子方式放大roi，其面积为80×80μm²(小图)，以使上皮特征清晰。我们验证了隐窝结构(箭头)，其包含杯状细胞(g)，该杯状细胞围绕正常结肠上皮表面附近(z＝20μm)的中央管腔(l)(图6e)。在个体结肠细胞的细胞质(c)中荧光均匀可见。在更大的深度(z＝60μm)，可以清楚地识别出单个隐窝与偶发的炎症细胞(箭镞)之间的间隙中的固有层(lp)(图6f)。还从其它小鼠上皮(包括十二指肠和回肠)体外采集图像，并识别个体细胞(图9a和9b)。还显示了肝脏和肾脏的图像以证明该仪器的广泛适用性(图9c和9d)。

在一实例中，在全身注射针对egfr的cy5.5标记的肽后，使用nir激发在体外采集荧光图像。在水平平面中，观察到正常结肠上皮的最小染色，发现隐窝呈圆形且尺寸均匀(图10a)。发育异常显示强染色，并且隐窝形状不规则且尺寸较大(图10b)。在倾斜平面中，看到均匀间隔开的椭圆形隐窝(图10c)，而发育异常的隐窝结构扭曲且尺寸较大(图10d)。组合来自发育异常的倾斜图像的堆叠，以生成3d体积图像(图10e)。

图9和图10的数据取自对小鼠上皮成像的光学探针扫描组件的另一实验实施方式。具体而言，使用侧视共聚焦显微内镜通过可见光和近红外激发在活体动物结肠上皮中进行光学切片，以证明该仪器的广泛用途。使用cdx2启动子对cpc；apc小鼠进行基因工程改造，以驱动cre重组酶，该酶偶发地删除apc基因，从而导致远端结肠中腺瘤的自发形成。apc基因在超过80％的人类结直肠癌中突变。将此小鼠与具有loxp侧翼stop盒的野生型(wt)小鼠杂交，以防止下游tdtomato基因的转录。删除stop盒带后，tdtomato被组成性地表达。所有实验程序均按照密歇根大学的指导方针进行，并经大学动物使用和护理委员会(ucuca)批准进行。

在此示例性实验中，首先使用可见激光激发通过tdtomato在小鼠结肠上皮细胞中产生内源性荧光。该荧光蛋白在约554nm处上具有峰值吸光度。然后，使用nir激发，由被发现对egfr特异的cy5.5标记的肽qrhkpre检测外源对照。通过cpc；apc小鼠的尾静脉进行300μm溶于200mlpbs的肽的腹膜内注射。肽注射后1小时进行成像以达到峰值吸收。

在成像期间，首先使用白光宽视野显微镜(27030ba，美国动物医学内镜公司(karlstorzveterinaryendoscopy))确定腺瘤的存在和位置。用2％的异氟烷(fluriso；mwi兽医供应有限公司(mwiveterinarysupplyco))麻醉小鼠。使用内窥镜尖端与肛门之间的距离以及腺瘤的顺时针位置来定义界标。通过使用带有旋转固定装置的平移台控制插入的角度和程度，以使光学器件直接与病变部位相接触。以每秒10帧的速度采集实时视频流。在成像完成后，对小鼠实施安乐死，切除结肠，纵向分开，用pbs冲洗以去除碎屑，然后将其固定在载玻片上。然后将组织固定在10％的福尔马林缓冲液中，并石蜡包埋以进行常规组织学检查(h&e)。得到图9和图10中描述的图像。

本文所述的侧视共聚焦显微内镜是示例性光学探针扫描组件，可与任何照射源一起使用，包括可见光、红外和近红外(nir)激发，从而可以研究组织中多种不同的光学效应(即，光报告基因)。现在，由于本文所述装置的侧视取向的尺寸，临床成像可以在小口径管腔中进行，例如在肺细支气管、胆道和胰管中找到的管腔。

根据前述内容，进一步的修改将是显而易见的，并且可以取决于所需的特定实施方式。例如，可以通过调整扫描仪万向架的多光束扭转弹簧来提高体内成像速度。已达到每秒至少20帧的扫描速度。仪器尺寸可以使用定制设计和制造的光学器件来进一步放大或缩小。垂直位移可以通过控制空气阻尼效果向上调整，例如，通过使用真空来降低扫描头中的环境压力。一个目标是可视化地观察上皮细胞在垂直平面上随时间的迁移和分化，并阐明细胞功能和命运的基本机制。如此，实时光学成像技术可以用于研究控制重要分子途径(包括免疫功能、组织再生和宿主反应)的信号，并且可以大大加快新型疗法的开发和评估。

本文的共聚焦显微内镜可以在系统配置中使用，图11提供了示出示例性框图800的实例，该框图示出了扫描设备802。在光学探针扫描组件的示例性实施例中，根据执行所公开实施例的功能，侧视共聚焦显微内镜150可以定位在标本103内、附近或以其它方式与其联接。扫描设备802可以具有控制器804，该控制器804通过连接到输入/输出(i/o)电路812的链路822可操作地连接到数据库814。应当注意，尽管并未示出，但是附加的数据库可以按照已知方式链接到控制器804。控制器804包括程序存储器806、处理器808(可以称为微控制器或微处理器)、随机存取存储器(ram)810以及输入/输出(i/o)电路812，它们均通过地址/数据总线820互连。应当理解，尽管仅示出了一个微处理器808，但是控制器804可以包括多个微处理器808。类似地，控制器804的存储器可以包括多个ram810和多个程序存储器806。尽管i/o电路812被示为单个块，但是应当理解，i/o电路812可以包括多种不同类型的i/o电路。例如，ram810和程序存储器806可以被实现为半导体存储器、磁性可读存储器和/或光学可读存储器。链路824可以通过i/o电路812将控制器804可操作地连接到光学器件150。

程序存储器806和/或ram810可以存储多种应用程序(即，机器可读指令)，以供微处理器808执行。例如，操作系统830可以控制侧视共聚焦显微内镜150的操作，并且向装置提供用户界面以实现本文所述的过程。程序存储器806和/或ram810还可以存储各种子例程832，以用于访问扫描设备802和共聚焦显微内镜150的特定功能。通过举例而非限制的方式，除了其它之外，子例程832可以包括：用于控制如本文所述的侧视共聚焦显微内镜150或其它内窥镜设备的操作的子例程；用于通过如本文所述的侧视共聚焦显微内镜150捕获图像的子例程；用于切换如本文所述的侧视共聚焦显微内镜150的成像模式的子例程；用于在3个轴上捕获图像的子例程；用于由采集的3轴扫描图像构造roi的3d体积图像的子例程；以及其它子例程，例如，实现软件键盘功能、与扫描设备802中的其它硬件交互等的子例程。程序存储器806和/或ram810可以进一步存储与侧视共聚焦显微内镜150的配置和/或操作有关和/或与一个或多个子例程的操作有关的数据。例如，数据可以是由侧视共聚焦显微内镜150采集的数据、由处理器808确定和/或计算的数据等。除了控制器804之外，扫描设备802可以包括其它硬件资源。扫描设备802还可以联接各种类型的输入/输出硬件，例如视觉显示器826和输入设备828(例如，小键盘、键盘等)，以微调轴向和横向扫描器的致动。在一实施例中，显示器826是触敏的，并且可以与作为软件例程832之一的软件键盘例程协作以接受用户输入。

在另一示例性实验中，展示出通过联合使用侧视共聚焦显微内镜(即根据本文的光学扫描探针组件技术)和claudin-1靶肽，可以在体内观察结肠癌中claudin-1的过度表达和结肠上皮屏障完整性。claudin-1是在结肠上皮细胞上表达的一种细胞膜蛋白，其完整性决定了结肠上皮的屏障功能。研究表明，claudin-1在人类结肠癌细胞系、原发性和转移性结肠癌中的表达水平增加，这使其成为结肠癌检测的潜在生物标记。此外，claudin-1已被确定为tcf/lef信号转导的可能目标，并且还可能参与wnt和notch信号转导途径。结肠上皮细胞中claudin-1表达的改变可以进一步破坏结肠上皮紧密连接的结构和功能，或干扰细胞信号转导途径从而异常调节组织稳态并促进肿瘤发生。本文的侧视共聚焦显微内镜技术可用于以类似于组织学的质量可视化体内结肠上皮结构的变化。实际上，本技术特别适合于在有限的结肠腔空间中捕获小的和早期的病变。

对于本实验，假设在结肠腺瘤小鼠模型中施用claudin-1特异性肽后，可以观察到结肠上皮细胞和异常隐窝结构中claudin-1表达的增加。还假设在dss诱导的体内急性和慢性结肠炎期间，可以看到结肠上皮连接完整性的丧失和恢复。

对于实验条件，所有动物实验都是在密歇根大学动物使用和护理大学委员会(ucuca)的批准下进行的。将小鼠分组饲养(2-4只/笼)，给予标准的食物和随意量的水，并暴露于12小时光照/12小时黑暗的周期。成像前1周提供无叶绿素饮食(envigotd.97184)，以尽量减少背景自身荧光。

结肠肿瘤：cpc；apc小鼠(cdx2-cre；apc^580s/+)是通过cdx2p9.5-nlscre小鼠与纯合携带loxp侧翼apc等位基因的小鼠(apcloxp/loxp，580s)杂交产生的。cdx2p9.5片段的表达遍及胚胎的尾部区域，并限制在成年组织的末端回肠、盲肠和结肠中。cpc；apc小鼠在结肠中表达截短的apc等位基因，早在4-6周龄时就会导致自发性腺瘤的发展。结肠炎：直接从杰克逊实验室获得c57bl/6j小鼠。在10-12周龄时诱发结肠炎。通过持续5天在饮用水中添加2％硫酸葡聚糖盐(dss)来诱发急性结肠炎。通过持续5天添加2％dss，之后10天恢复，持续3轮，可诱发慢性结肠炎。在最后的10天恢复期后对小鼠成像。肽的合成和表征：claudin-1肽(rtspssr)是使用ps3自动合成仪(蛋白质技术公司(proteintechnologiesinc))合成的，并用cy5.5，一种近红外红(nir)荧光基团(花青5.5nhs酯，lumiprobe27020)，在羧基端利用gggsk连接基标记，之后使用rts*-cy5.5.¹⁷。使用加扰肽(sptssrr)作为对照，并用cy5.5标记，之后使用spt*-cy5.5。通过hplc，两种肽的纯度均大于99％。将该肽冻干以在-80℃下储存。

在一实施方式中，根据本技术，使用侧视共聚焦显微内镜对结肠肿瘤中claudin-1的表达进行成像。即，在全身注射rts*-cy5.5后，使用光学扫描探针组件以亚细胞分辨率对claudin-1表达进行成像。腺瘤通过使用由宽视野内窥镜确定的界标进行定位。正常隐窝结构(箭头)呈椭圆形，具有相似的尺寸(图12a)。claudin-1(箭簇)的表达可以在细胞之间的紧密连接处识别出。在隐窝之间可以看到固有层(lp)。可以识别出围绕中央管腔(l)的个体结肠细胞(c)和杯状细胞(g)。相比而言，发育异常的隐窝(箭头)显示出更大的强度，并且尺寸更大，形状细长，结构变形且尺寸多变(图12b)。固有层密集出现。spt*-cy5.5(对照)在正常结肠中隐隐出现隐窝结构(箭头)(图12c)，在腺瘤中显示非特异性染色模式(图12d)。对这些结果进行量化，发现在1小时使用rts*-cy5.5，与邻近的正常结肠粘膜相比，腺瘤的强度高2倍以上(图12e)。在1小时的腺瘤中，rts*-cy5.5的t/b比明显大于spt*-cy5.5(图12f)。

在另一实施方式中，根据本技术，使用侧视共聚焦显微内镜对结肠炎中claudin-1表达进行成像。也就是说，在全身注射rts*-cy5.5后，使用光学扫描探针组件对患有急性和慢性结肠炎的c57bl/6j小鼠体内claudin-1表达进行成像。在诱发炎症之前，在正常隐窝中观察到紧密连接部位(箭簇)处的rts*-cy5.5染色(图13a)。通过持续5天每天使小鼠口服2％的dss，诱发急性结肠炎。在体内成像中，隐窝看起来扩大了，rts*-cy5.5渗入固有层导致强烈的信号(图13b)。通过持续5天每天施用2％的dss，之后10天停药，持续总共3轮，从而诱发慢性结肠炎。在体内成像中，隐窝结构显示出再生特征，其特征在于上皮细胞密度增加、隐窝大小增大和固有层密集(图13c)。图13d至图13f显示了每种情况的对应组织学(h&e)。在任一种条件下，仍可以在紧密连接的部位(箭簇)清楚地看到claudin-1的表达。

在整个说明书中，多个实例可以实现被描述为单个实例的组件、操作或结构。尽管一种或多种方法的单独操作示出并被描述为单独的操作，但是单独操作中的一个或多个可以同时地执行，并且不需要按照所示顺序执行操作。在示例配置中呈现为独立组件的结构和功能可以实现为组合结构或组件。类似地，呈现为单个组件的结构和功能可以实现为单独的组件。这些以及其它变型、修改、添加和改进均落入本文主题的范围内。

另外，某些实施例在本文中被描述为包括逻辑或若干例程、子例程、应用程序或指令。这些可以构成软件(例如，体现在非暂时性机器可读介质上的代码)或硬件。在硬件中，例程等是能够执行某些操作的有形单元，并且可以以某种方式配置或布置。在示例性实施例中，一个或多个计算机系统(例如，独立的客户端或服务器计算机系统)或计算机系统的一个或多个硬件模块(例如，处理器或一组处理器)可以由软件(例如，应用程序或应用程序部分)配置作为操作来执行本文所述某些操作的硬件模块。

在各种实施例中，硬件模块可以机械地或电子地实现。例如，硬件模块可以包括被永久配置为执行某些操作的专用电路或逻辑(例如，作为专用处理器，例如现场可编程门阵列(fpga)或专用集成电路(asic))。硬件模块还可以包括由软件临时配置为执行某些操作的可编程逻辑或电路。应当理解，在成本和时间考虑因素的驱动下，可以决定以机械方式在专用且永久配置的电路中或者在临时配置的电路(例如，由软件配置)中实施硬件模块。

因此，术语“硬件模块”应被理解为涵盖有形实体，是指被物理地构造、永久地配置(例如，硬连线)或临时地配置(例如，编程)为按照一定方式操作或者执行本文所述的某些操作的实体。考虑其中硬件模块被临时配置(例如，编程)的实施例，每个硬件模块不需要在任何一个时间实例进行配置和实例化。例如，在硬件模块包括由软件配置的处理器的情况下，处理器可以在不同时间配置为相应的不同硬件模块。软件可以相应地配置处理器，例如，在一个时间实例上构成特定的硬件模块，以及在不同的时间实例上构成不同的硬件模块。

硬件模块可以向其它硬件模块提供信息，或从其它硬件模块接收信息。因此，所述硬件模块可以被认为是通信联接的。在同时存在多个此类硬件模块的情况下，可以通过连接硬件模块的信号传输(例如，通过适当的电路和总线)来实现通信。在其中在不同时间配置或实例化多个硬件模块的实施例中，可以例如通过在多个硬件模块能够访问的存储器结构中存储和检索信息来实现此类硬件模块之间的通信。例如，一个硬件模块可以执行操作并将该操作的输出存储在其所通信联接的存储器设备中。然后，另一个硬件模块可以在以后的时间访问该存储器设备以检索和处理所存储的输出。硬件模块还可以发起与输入或输出设备的通信，并且可以对资源(例如，信息的集合)进行操作。

本文所述的示例性方法的各种操作可以至少部分地由被临时配置(例如，通过软件)或永久配置为执行相关操作的一个或多个处理器执行。无论是临时配置还是永久配置，此类处理器都可以构成处理器实现的模块，这些模块运行以执行一个或多个操作或功能。在一些示例性实施例中，本文所指的模块可以包括处理器实现的模块。

类似地，本文所述的方法或例程可以至少部分地由处理器实现。例如，一种方法的至少一些操作可以由一个或多个处理器或处理器实现的硬件模块执行。某些操作的性能可以分布在一个或多个处理器之间，不仅驻留在单个机器内，而且可以跨多个机器部署。在一些示例性实施例中，处理器或多个处理器可以位于单个位置(例如，在家庭环境、办公室环境内或作为服务器场)，而在其它实施例中，处理器可以分布在多个位置。

某些操作的性能可以分布在一个或多个处理器之间，不仅驻留在单个机器内，而且可以跨多个机器部署。在一些示例性实施例中，一个或多个处理器或处理器实现的模块可以位于单个地理位置(例如，在家庭环境、办公室环境或服务器场内)。在其它示例性实施例中，一个或多个处理器或处理器实现的模块可以分布在多个地理位置。

除非另有明确说明，否则本文中使用诸如“处理”、“计算(computing)”、“计算(caculating)”、“确定”、“呈现”、“显示”等的词语进行的讨论可以是指机器(例如，计算机)的动作或进程，来操纵或转换在一个或多个存储器(例如，易失性存储器、非易失性存储器或其组合)、寄存器或接收、存储、传输或显示信息的其它机器组件中被表示为物理(例如，电、磁或光)量的数据。

如本文所使用的，对“一个实施例”或“一实施例”的任何引用意思是结合该实施例所描述的特定元件、特征、结构或特性包括在至少一个实施例中。说明书中各个地方出现的短语“在一个实施例中”不一定全都指同一实施例。

一些实施例可能使用“联接”和“连接”的表达及其派生词进行描述。例如，一些实施例可能使用术语“联接”来描述，以表示两个或更多个元件处于直接物理接触或电接触。然而，术语“联接”也可以是指两个或更多个元件彼此并不直接接触，但是仍然彼此协作或进行交互。实施例不限于此上下文。

本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的范围的情况下，可以关于上述实施例进行多种各样的修改、改变和组合，并且此类修改、改变和组合也应被视为在本发明构思的范围之内。