一种基于环形光镊与暗场显微的超分辨装置及其分辨方法与流程

本发明涉及一种基于环形光镊与暗场显微的超分辨装置及其分辨方法，是对纳米级别微粒实现超分辨的技术，属于光学显微领域。

背景技术：

光镊诞生于1986年，由于其能够无损伤、无接触地操纵和捕获微粒，因而特别适用于操控活细胞。在生物、医学、微加工等领域中占据了越来越重的份额。光镊中光子与介质微粒进行动量交换产生散射力和梯度力，散射力方向沿着光的传播方向，使粒子沿着光束传播方向运动，梯度力正比于光强梯度，指向光场强度的最大处，使粒子向光束焦点运动。当梯度力大于散射力时，微粒就被捕获在光强梯度最大附近。

传统的光镊大都釆用强会聚实心高斯光束，需要较高的激光功率才能产生足够的梯度力捕获微粒，如细胞等活体生物长时间的处于高功率的激光照射下，较容易受到损害，并且使用高斯光束作为光镊，只能对单一目标进行捕获及操作，不利于光镊技术的应用与发展。随着微纳米技术的蓬勃发展，人们对细胞、纳米乃至原子水平上对物质进行观察和研究的仪器仪表的要求越来越高。尽管近几十年发展起来的扫描电子显微镜等显微镜分辨率可以达到微纳米级，但也存在设备庞大、价格昂贵、操作复杂等缺点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提出了一种基于环形光镊与暗场显微的超分辨装置及其分辨方法，采用环形光镊作为操作与观察手段，结合暗场显微技术以实现分辨率达到最佳的目的，不仅可以实现对单一微粒或多个微粒的操作，同时还可以有效的提高对比度，本发明可用于全息超分辨、光学捕获、图像增强等领域，具有很好的应用前景。

本发明采用的技术方案是：一种基于环形光镊与暗场显微的超分辨装置，包括激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、傅里叶透镜4、暗场聚光镜5、培养皿6、显微物镜7、ccd8、计算机9；

所述的激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、傅里叶透镜4、暗场聚光镜5、培养皿6、显微物镜7、ccd8自下而上间隔放置且各部件的中心位于同一垂直线上，傅里叶透镜4、培养皿6能够上下移动，ccd8与计算机9连接，暗场聚光镜5的数值孔径大于显微物镜7的数值孔径。

优选地，调节扩束准直镜2的放大倍率，使经过扩束准直镜2扩束后的光充满整个锥镜3，上下调整傅里叶透镜4的位置，使经过傅里叶透镜4的环形光完全进入暗场聚光镜5的环缝。

优选地，还包括多孔固定板10，多孔固定板10垂直固定于防震平台上，多孔固定板10的一侧自下而上设有多个螺纹孔，激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、暗场聚光镜5、显微物镜7、ccd8分别通过自身连接的支杆与调节支座安装在多孔固定板10的螺纹孔内，傅里叶透镜4、培养皿6通过自身连接的支杆与调节支座分别安装在两个三维平移台上，两个三维平移台通过底部的螺丝固定在多孔固定板10的螺纹孔内。

优选地，所述的激光器1功率在10mw以上，波长为473nm。

一种所述的基于环形光镊与暗场显微的超分辨装置的分辨方法，包括如下步骤：

step1：自下而上安装激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、傅里叶透镜4、暗场聚光镜5、培养皿6、显微物镜7、ccd8，然后将被观察微粒处于水平放置的培养皿6中；

step2：激光器1发射出一束由下往上垂直照射的激光，激光最先进入扩束准直镜2中，调节扩束准直镜2的放大倍率，使扩束准直镜2扩束后的光恰能充满整个锥镜3，然后使傅里叶透镜4位于锥镜3出射光束的开环点后；

step3：上下调整傅里叶透镜4的位置，使经过傅里叶透镜4的环形光完全进入暗场聚光镜5的环缝，通过暗场聚光镜5对环形光进行汇聚，形成一个环形光锥；

step4：将培养皿6的底端放置于环形光锥的聚光点附近，光束照射在培养皿6中的微粒上，直透光部分未进入显微物镜7中，只有照射在微粒上的散射光进入了显微物镜7中；

step5：显微物镜7之后出射的光通过ccd8进行采集图像，ccd8采集的图像在与之相连接的计算机9上进行实时显示；

step6：当环形光一开始照射在培养皿6时，通过计算机9的显示能够观察到一定数量的微粒被捕获在环形光附近，且微粒依次排列，成圆环状，然后通过微调培养皿6的上下位置，逐步增大培养皿6与暗场聚光镜5之间的距离，通过计算机9的显示观察到所捕获的微粒的数量逐渐减少，所构成的圆环逐渐变小，一直调整到只能捕获一个微粒，继续微调培养皿6的上下位置，直至环形光的暗中空部分恰与所要观察的微粒的尺寸相接近，此时通过ccd8所拍摄出来的是单个微粒的图片，此时刻为分辨率最高的时刻。

本发明的有益效果是：

（1）本发明采用了暗场显微技术，在本身成像背景为暗背景的情况下，与由散射光形成的明亮的微粒影像，形成鲜明的对比，提高了对比度，并且所使用的照明方式为斜向照明，这种照明方法能提高对微粒的分辨能力。

（2）在暗场显微中，因为直透光的部分没有进入到显微物镜中，所以无法从ccd中观察到环形光的具体位置和形状大小。在此情况下，通过结合光镊的技术手段，就可以利用环形光镊捕获微粒，间接提供环形光的具体轮廓，将光学系统调整到各元件间的最佳配置距离（即单个微粒尺寸与环形光尺寸相接近的状态），最终实现超分辨。

附图说明

图1是本发明的光路示意图。

图2是暗场显微示意图。

图3是操作流程示意图。

其中：a为对培养皿高度进行调整的示意图，b为与之对应的成像在ccd，并在计算机上实时显示的画面，大的圆环部分为环形光，小的实心圆为酵母菌细胞。

图4是不同环形孔径比的点扩散函数归一化的光强分布图。

图中各标号为：1、激光器，2、扩束准直镜，3、锥镜，4、傅里叶透镜，5、暗场聚光镜，6、培养皿，7、显微物镜，8、ccd，9、计算机，10、多孔固定板。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：如图1-4所示，本实施例采用活体酵母菌细胞进行说明，但不应以此限制本发明的保护范围。例如硅珠子、铬粒子、聚苯乙烯小球等均在保护范围内。

环形光镊与传统的光镊相比，具有以下优点：第一，降低捕获所需的激光功率，同时能实现对多个微观粒子的控制；第二，环形光束光镊利用焦点附近的暗中空区域既可以捕获相对折射率大于1的粒子又可以捕获相对折射率小于1的粒子；第三，中心暗区域会削弱光的散射力，在相同功率条件下被捕获粒子受到的光学热损伤会很小，不至于破坏生物细胞的活性。

暗场显微成像的发现很好的解决了扫描电子显微镜等显微镜存在的问题，其成像的原理是基于光路中暗场聚光镜的加入，使入射光线成锥形照射到被检测物上。同时，暗场环的存在滤掉了大部分的垂直入射光而只有侧面的光通过，整个视野内的大背景是黑色的，因此暗场显微成像具有暗背景，信噪比高等优点。只要被检物在光照下的散射能力足够强便可被照亮，经过物镜的放大作用在视野内进行成像，通过目镜可用肉眼直接观察到像斑。此外由于它的成像原理是基于被检物自身的光学特性，因而不需要再对其进行其他的修饰处理如荧光标记，为实验带来很大的便利。

本发明在此基础上，通过采用基于环形光镊和暗场显微的新型成像方法和系统，既能保持常规光学显微镜的实时、直接、无扫描的成像观测方式，也可以提高显微图像的对比度和分辨率，同时还能对单一微粒或者多个微粒进行操作。

如图1所示，本发明的一种基于环形光镊与暗场显微的超分辨装置，包括激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、傅里叶透镜4、暗场聚光镜5、培养皿6、显微物镜7、ccd8、计算机9；

所述的激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、傅里叶透镜4、暗场聚光镜5、培养皿6、显微物镜7、ccd8自下而上间隔放置且各部件的中心位于同一垂直线上，傅里叶透镜4、培养皿6能够上下移动，ccd8与计算机9连接，暗场聚光镜5的数值孔径大于显微物镜7的数值孔径，调节扩束准直镜2的放大倍率，使经过扩束准直镜2扩束后的光充满整个锥镜3，上下调整傅里叶透镜4的位置，使经过傅里叶透镜4的环形光完全进入暗场聚光镜5的环缝。

进一步地，还包括多孔固定板10，多孔固定板10垂直固定于防震平台上，多孔固定板10的一侧自下而上设有多个螺纹孔，激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、暗场聚光镜5、显微物镜7、ccd8分别通过自身连接的支杆与调节支座安装在多孔固定板10的螺纹孔内，傅里叶透镜4、培养皿6通过自身连接的支杆与调节支座分别安装在两个三维平移台上，两个三维平移台通过底部的螺丝固定在多孔固定板10的螺纹孔内。

进一步地，所述的激光器1功率在10mw以上，波长为473nm。

一种所述的基于环形光镊与暗场显微的超分辨装置的分辨方法，包括如下步骤：

step1：自下而上安装激光器1、扩束准直镜2、锥镜3、傅里叶透镜4、暗场聚光镜5、培养皿6、显微物镜7、ccd8，然后将被观察微粒处于水平放置的培养皿6中；

step2：激光器1发射出一束由下往上垂直照射的激光，激光最先进入扩束准直镜2中，调节扩束准直镜2的放大倍率，使扩束准直镜2扩束后的光恰能充满整个锥镜3，以保证锥镜3的成像条件及减少光能的损失，然后使傅里叶透镜4位于锥镜3出射光束的开环点后；傅里叶透镜4用于调节由锥镜3整形的环形光的大小；

step3：上下调整傅里叶透镜4的位置，使经过傅里叶透镜4的环形光完全进入暗场聚光镜5的环缝，以保证光能的利用率最高，成像较清晰，通过暗场聚光镜5对环形光进行汇聚，形成一个环形光锥；

step4：将培养皿6的底端放置于环形光锥的聚光点附近，光束照射在培养皿6中的微粒上，直透光部分未进入显微物镜7中，只有照射在微粒上的散射光进入了显微物镜7中；

step5：显微物镜7之后出射的光通过ccd8进行采集图像，ccd8采集的图像在与之相连接的计算机9上进行实时显示；

step6：当环形光一开始照射在培养皿6时，通过计算机9的显示能够观察到一定数量的微粒被捕获在环形光附近，且微粒依次排列，成圆环状，提供了环形光的具体大小，然后通过微调培养皿6的上下位置，逐步增大培养皿6与暗场聚光镜5之间的距离，通过计算机9的显示观察到所捕获的微粒的数量逐渐减少，所构成的圆环逐渐变小，一直调整到只能捕获一个微粒，继续微调培养皿（6）的上下位置，直至环形光的暗中空部分恰与所要观察的微粒的尺寸相接近，此时通过ccd（8）所拍摄出来的是单个微粒的图片，此时刻为分辨率最高的时刻。

本发明设想的超分辨，其条件为环形光锥暗中空部分的大小与所要观察的单个酵母菌细胞的尺寸相接近，此时方能实现超分辨。因为暗场显微的工作原理：不让直透光进入显微物镜7中，只让酵母菌细胞的散射光进入，以增加成像时的对比度，所以从图2可以看出，通过暗场聚光镜5所汇聚的环形光的直透光部分（实线部分）并没有进入显微物镜7中，只有培养皿6中被照亮的酵母菌细胞的散射光（虚线部分）进入了显微物镜7，导致无法实时的观测到环形光具体大小，因此提出结合光镊的方法进行观察，由环形光锥形成的光镊为捕获酵母菌细胞，所捕获的酵母菌细胞为提供环形光在培养皿6位置时的大小。

具体操作示意图，如图3所示，其中a为对培养皿高度进行调整的示意图，b为与之对应的成像在ccd，并在计算机上实时显示的画面，大的圆环部分为环形光，小的实心圆为酵母菌细胞，其中只能通过ccd观察到酵母菌细胞，而无法观察到环形光。当环形光一开始照射在培养皿6时，可以观察到一定数量的酵母菌细胞被捕获在环形光附近，且酵母菌细胞依次排列，成圆环状，为提供了环形光的具体大小。通过微调，增大培养皿6与暗场聚光镜5之间的距离，可以观察到所捕获的酵母菌细胞的数量逐渐减少，所构成的圆环逐渐变小，由此可以判断照射在培养皿位置处的环形光正在缩小，实现对环形光大小的实时监控。最终，当环形光的暗中空部分与所要观察的酵母菌细胞的尺寸相接近，此时只能捕获到一个酵母菌细胞。

图4为不同环形孔径比的点扩散函数归一化的光强分布，从图中可以看出，环形光的孔径比越小，点扩散函数（psf）的主瓣宽度越窄，分辨率也就越高，结合图3图4，当捕获到一个细胞时，需继续微调环形光大小，使其与单个酵母菌尺寸相接近，环形光与酵母菌尺寸越接近，环形孔径比越小，通过ccd所拍摄出来的单个酵母菌细胞的分辨率也就越高，最终实现分辨率的提高。

以上对本发明的具体实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。