本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种具有壮苗促根作用的烟草专用复合微生物肥料及其制备方法。
背景技术：
烤烟是我国重要的经济作物，在我国国民经济中占有重要地位。2007年烟草种植面积为105万公顷，税收达到3880亿元，居全国各行业单项税收之首。在烤烟生产中，培育壮苗是烤烟栽培的重要环节之一，也是提高烤烟产量和质量的重要措施。培育壮苗是烤烟优质高产的基础，国内外十分重视烤烟壮苗的培育。接种优良的微生物菌种，感染形成菌根化烟苗可改善烟苗营养状况，促进生理代谢，增强抗逆性，提高烟苗素质，培育壮苗，进而有益于提高烟叶产量和质量。基质是烟苗根系生长的环境，菌根的形成和发育与基质密切相关。此外，水分和营养是通过基质获得的，基质的成分直接影响烟苗菌根的形成与菌根苗的生长。所以，研制菌根化烟苗的专用基质配方及相应的接种技术是我国烤烟漂浮育苗集约化生产的迫切需要。目前国内基质一般以富含有机质的材料(如泥炭、腐熟植物残体等)为主，再配以适当比例的轻质无机材料，如蛭石、膨胀珍珠岩等制成的。由于材料来源受地区和成本的限制，且泥炭为不可再生资源，限制着基质无土育苗的可持续发展，现已成为草炭匮乏地区烟草工厂化育苗发展的瓶颈。国外工厂化育苗发展很快，进口基质保水性明显优于国产泥炭基质，进口基质中有机质和速效磷、钾含量明显高于国产泥炭基质。因此提升国内育苗基质的整体水平变得尤为迫切。将促进作物生长的根际微生物与不同腐熟废弃物料（普通完全或部分替代泥炭物料研制成的基质）相结合，研制成育苗促生生物基质，将打破传统育苗基质的配方及工艺，成为提升我国育苗基质整体水平的一个重大突破。目前，国内已有部分专家在尝试此方面工作，主要集中在利用AM菌根接种现有基质进行育苗，虽取得一些成果，但均研究不够系统深入，也没有形成大规模推广并被广大农民认可的产品。
植物根际促生菌（Plant growth - promoting rhizobacteria)是指定殖于植物根际系统，并能促进植物生长的一类细菌的总称，能依靠直接产生信号物质，或者提高植物抗性、加速土壤养素循环等方式促进植物生长、提高防病能力、增加作物的产量，因而成为许多学者研究的热点。植物根际（rhizosphere)是一个非常特殊的生态环境，是土壤-植物生态系统物质交换的活跃界面，植物进行光合作用，将光合产物运至地下，促进根际微生物的生长和代谢，而根际微生物将有机态养分转化为无机形态，利于植物吸收，同时，很多根际微生物能分泌促进根系生长的促生物质、拮抗土传病原菌的拮抗物质。植物根际形成了根际微生物的生境，特定作物根系分泌物造就了特定的土壤细菌和真菌的群落结构。与动物不同，植物生长位点是固定的，植物与其他生物的互作主要依靠分泌的各种化学信号物质。植物通过根系分泌能被土壤微生物识别的信号分子启动微生物与植物根系的对话，这种对话又反过来使微生物产生一些信号来启动微生物在根部的定殖。自然条件下，特定作物的根系分泌物被某些有益微生物所爱好，如果我们能够将这些特定的针对不同作物根际的功能微生物在育苗的时候，保活添加到基质中，研制成不同类型作物的专用微生物肥料，从而进一步育出根际带有大量活性功能微生物的优质种苗，必定能够提高该类作物在大田种植中的产量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有壮苗促根作用的烟草专用复合微生物肥料及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种具有壮苗促根作用的烟草专用复合微生物肥料：由常规烟草育苗基质以其干重计，添加1~4%的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）菌液和1~4%的淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus（Thorn.）Samson）菌粉制得；其中，苏云金杆菌菌液的含菌或芽孢量≥4.0×109个/ml，淡紫拟青霉菌粉含孢子量≥4.0×108个/g；前述“%”表示每100g常规烟草育苗基质干重添加的菌液毫升数或菌粉克数。
最佳地，苏云金杆菌菌液的添加比例为1%，淡紫拟青霉菌粉的添加比例为3%。
所述常规烟草育苗基质中以质量百分比计，含有机质≥40%，总养分≥2%，水分≤30%，pH值5.5~7.5，Ec≤2.5ds/cm。只要符合该要求的常规烟草育苗基质均适用于本发明。
制备方法：首先，分别制备苏云金杆菌菌液和淡紫拟青霉菌粉；然后，分别将苏云金杆菌菌液和淡紫拟青霉菌粉按比例再添加到常规烟草育苗基质中，即得烟草专用复合微生物肥料。
较好地，苏云金杆菌菌液通过以下方法制备：将市购苏云金杆菌试管斜面菌种接种到肉汤琼脂培养基斜面上进行斜面活化培养，斜面活化培养36~48h后再转接至肉汤培养基进行种子培养，种子培养36~48h后再转接至肉汤培养基进行扩大培养至培养液中含菌或芽孢量≥4.0×109个/ml，制得苏云金杆菌菌液；其中，斜面活化培养的条件为：培养温度范围30~35℃；种子培养和扩大培养的条件为：培养温度范围30~35℃，搅拌速度为180~300转/分钟。所用肉汤琼脂培养基的配制方法为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化钠5g、琼脂15~20g，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min；所用肉汤培养基的配制方法为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化钠5g，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min。
较好地，淡紫拟青霉菌粉通过以下方法制备：将市购淡紫拟青霉试管斜面菌种接种到PDA培养基斜面上进行斜面活化培养，斜面活化培养后再转接至PDA液体培养基进行液体培养，液体培养后再接种吸附到经过灭菌的麸皮中，进行固体培养，培养至孢子量≥4.0×108个/g，即得淡紫拟青霉菌粉；其中，斜面活化培养的条件为：培养温度范围26~28℃，培养3~5天；液体培养的条件为：培养温度范围26~28℃，搅拌速度为120~160转/分钟，培养24~36h；固体培养的条件为：培养温度范围26~28℃；所用PDA培养基的配制方法为：用200g土豆削皮后切成块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖、琼脂15~20g，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min；所用PDA液体培养基的配制方法为：用200g土豆削皮后切成块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min。
有益效果：本发明针对烟草，选择特定的烟草根际功能菌，并将其保活添加至常规烟草育苗基质中，不仅可以增强所育种苗促进根系发育，而且能够育出根际带有大量活性功能微生物的优质种苗，能够促进所育种苗后期栽培过程中的生长，提高烟草的产质量。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
第一步，制备功能菌：
（1）苏云金杆菌菌液通过以下方法制备：将市购苏云金杆菌试管斜面菌种接种到肉汤琼脂培养基斜面上进行斜面活化培养，斜面活化培养36h后再转接至肉汤培养基进行种子培养，种子培养36h后再按15wt%的接种量接种到肉汤培养基进行扩大培养至培养液中含菌或芽孢量达到4.0×109个/ml，即得苏云金杆菌菌液；其中，斜面活化培养的条件为：培养温度范围35℃；种子培养和扩大培养的条件为：培养温度范围35℃，搅拌速度为250转/分钟；所用肉汤琼脂培养基的配制方法为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化钠5g、琼脂15g，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min；所用肉汤培养基的配制方法为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、葡萄糖10g、氯化钠5g，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min；
（2）淡紫拟青霉菌粉通过以下方法制备：淡紫拟青霉菌粉通过以下方法制备：将市购淡紫拟青霉试管斜面菌种接种到PDA培养基斜面上进行斜面活化培养，斜面活化培养后再转接至PDA液体培养基进行液体培养，液体培养后再按2%（V/W，ml/g）的接种量接种吸附到经121℃灭菌60min的麸皮中，进行固体培养，培养至孢子量达到4.0×108个/g，即得淡紫拟青霉菌粉；其中，斜面活化培养的条件为：培养温度范围28℃，培养5天；液体培养的条件为：培养温度范围28℃，搅拌速度为160转/分钟，培养24h；固体培养的条件为：培养温度范围28℃；所用PDA培养基的配制方法为：用200g土豆削皮后切成块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖、琼脂15g，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min；所用PDA液体培养基的配制方法为：用200g土豆削皮后切成块放到水里煮，沸腾后煮30min，经过滤后滤液中加20g普通蔗糖，加水定容至1000ml，pH值调至7.0~7.5，121℃灭菌20min。
第二步，以常规烟草育苗基质(市购产品，以质量百分比计，含有机质≥40%，总养分≥2%，水分≤30%，pH值5.5~7.5，Ec≤2.5ds/cm)为原料，制备功能菌不同添加比例的烟草专用复合微生物肥料（功能菌添加比例中涉及的“%”，表示每100g常规烟草育苗基质干重添加的功能菌菌液毫升数或菌粉克数，下同）：
将苏云金杆菌菌液以4%的添加比例加入到常规烟草育苗基质中，混合拌匀，即得添加4%苏云金杆菌的烟草专用复合微生物肥料；
将淡紫拟青霉菌菌粉以4%的添加比例加入到常规烟草育苗基质中，混合拌匀，即得添加4%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；
将苏云金杆菌菌液和淡紫拟青霉菌菌粉分别以3%、1%的添加比例加入到常规烟草育苗基质中，混合拌匀，即得添加3%苏云金杆菌和1%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；
将苏云金杆菌菌液和淡紫拟青霉菌菌粉分别以2%、2%的添加比例加入到常规烟草育苗基质中，混合拌匀，即得添加2%苏云金杆菌和2%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；
将苏云金杆菌菌液和淡紫拟青霉菌菌粉分别以1%、3%的添加比例加入到常规烟草育苗基质中，混合拌匀，即得添加1%苏云金杆菌和3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料。
上述以常规烟草育苗基质为原料，当同时添加两种功能菌时，制得的烟草专用复合微生物肥料产品经计数含有≥4.0×107个/g干重的功能菌（两种菌之和）。功能菌采用选择性培养基计数，选择性培养基配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaC1 10g、琼脂15g，1wt%多粘菌素水溶液2ml/L，1wt%放线菌酮水溶液4ml/L，去离子水定容至1000ml；功能菌菌落数以每克烟草专用复合微生物肥料干重计算。
为验证本发明产品的使用效果，特别进行如下实验：
1．育苗试验
试验设6个处理，分别为：T1（CK）--常规烟草育苗基质；T2--添加4%苏云金杆菌的烟草专用复合微生物肥料；T3--添加4%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；T4--添加3%苏云金杆菌和1%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；T5--添加2%苏云金杆菌和2%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；T6--添加1%苏云金杆菌和3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料。
将烟草种子消毒浸种催芽，露白后，埋入6个处理的烟草专用复合微生物肥料中，每个处理50个重复。20天后分别测定烟草的相关指标：株高、SPAD、总鲜重和总干重。
从表1可以看出，烟草株高、SPAD、鲜重和干重大小的顺序均为T6、T5、T4、T3、T2、T1；这表明，与常规烟草育苗基质相比，添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌或苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料均能显著增加烟草株高、SPAD、鲜重和干重；添加苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料的均高于单独添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌的，其中，添加1%苏云金杆菌和3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料的株高、SPAD、鲜重和干重均最大。
2. 田间试验
试验设6个处理，分别为：Q1（CK）--常规烟草育苗基质；Q2--添加4%苏云金杆菌的烟草专用复合微生物肥料；Q3--添加4%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；Q4--添加3%苏云金杆菌和1%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；Q5--添加2%苏云金杆菌和2%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料；Q6--添加1%苏云金杆菌和3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料。
试验各处理氮、磷和钾用量均相同，氮、磷和钾用量分别为 N 4.5 kg/亩、P2O56.75kg/亩和K2O13.5 kg/亩；施肥方式：条施。试验小区面积为72m2，3个重复，随机区组排列，4月22日移栽，8月13日采烤结束。其他各项田间生产管理措施统一按当地规范化措施进行。
分别于移栽后35d（团棵期）、60 d（现蕾期）测定各处理株高、茎围、叶片数、叶面积等农艺性状和倒数第5片功能叶的叶基、叶中、叶尖3个部位的SPAD值。
在烟叶进入成熟期后，叶片由下到上，达到成熟标准后逐次进行采集样品，烟叶采集完后采集各处理根和茎。烟叶洗净后在105℃杀青30min，然后在60℃烘干，根和茎洗净后在烘箱中60℃烘干，然后称重。
各小区单独计产、分级，计算产量和产值。
2.1不同处理对烟株农艺性状的影响
从表2可知，在移栽后35 d，Q6处理和Q5处理的烟草株高、茎围、叶片数和叶面积差异均不显著；在移栽后60 d，Q6处理的烟草茎围显著高于Q5处理的。无论在移栽后35 d，还是在移栽后60 d；烟草株高、茎围、叶片数和叶面积大小的顺序均为Q6、Q5、Q4、Q3、Q2、Q1；这说明，与常规烟草育苗基质相比，添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌和苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料均能显著增加烟草株高、茎围、叶片数和叶面积；添加苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料的均高于单独添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌的，其中，添加1%苏云金杆菌和3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料的烟草株高、茎围、叶片数和叶面积均最大。
2.2不同处理对烟叶SPAD值的影响
SPAD值可代表叶绿素含量，叶绿素不仅是光合作用的重要色素，同时其含量和降解产物的积累量与烟叶的香气物质和品质有密切关系。从表3可以看出，在移栽后35d和60d，不同叶位的SPAD值整体表现为：叶尖＞叶中＞叶基。在移栽后35 d和移栽后60 d；烟草不同叶位的SPAD值大小的顺序均为Q6、Q5、Q4、Q3、Q2、Q1；表明，与常规烟草育苗基质相比，添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌和苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料均能显著不同叶位的SPAD值；添加苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料的均高于单独添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌的，其中，添加1%苏云金杆菌和3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料的不同叶位的SPAD值均最大。
2.3不同处理对烟叶光合特性的影响
从表4可以看出，Q6处理的烟草叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率高于Q5处理的。烟草叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率大小的顺序均为Q6、Q5、Q4、Q3、Q2、Q1；这说明，与常规烟草育苗基质相比，添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌和苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料均能提高叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率；添加苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料的均高于单独添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌的，其中，添加1%苏云金杆菌和3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料的烟草叶片净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率均最大。
2.4不同处理对烤烟经济性状的影响
从表5可以看出，Q6处理和Q5处理的烟草产量和产值均显著高于其他处理的。烟草产量、产值、均价和上等烟比例大小的顺序均为Q6、Q5、Q4、Q3、Q2、Q1；这表明，与常规烟草育苗基质相比，添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌和苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料均能提高产量、产值、均价和上等烟比例；添加苏云金杆菌+淡紫拟青霉菌不同比例的烟草专用复合微生物肥料的均高于单独添加苏云金杆菌、淡紫拟青霉菌的，其中，添加1%-2%苏云金杆菌和2%-3%淡紫拟青霉菌的烟草专用复合微生物肥料能显著提高烟草产量、产值、均价和上等烟比例。