本发明属于农业生物
技术领域：
，具体涉及一种无害化处理牛粪的静态堆肥方法。
背景技术：
：牛肉是我国主要的肉食来源之一，随着人民生活水平的提高，牛肉所占的消费比例逐年上升，随之而来的食品安全问题日益凸显。牛肉是引起肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagee.coli，ehec)o157:h7细菌性食物中毒的主要食物之一。食用被eheco157：h7污染的牛肉除引起呕吐、腹泻等肠道疾病外，还可引起溶血性尿毒综合征及脑症等并发症，甚至引起死亡。因此和艾滋病、埃博拉出血热等并称为新兴感染症，受到世界卫生组织的高度重视。牛肉中eheco157:h7的污染主要来源于肉牛的粪便。肉牛粪便中携带大量的eheco157:h7，这些菌体对肉牛本身没有致病性，但可随排泄物污染养殖、屠宰及运输环境，进而污染牛肉本身。由于我国养殖方式粗放，大量的养殖业废弃物被排放到环境中，极易造成ehec的污染。与此同时，我国牛肉微生物检测工作的执行情况与发达国家相比较为薄弱，存在安全风险。预防牛肉eheco157:h7引起的食物中毒，采用堆肥灭活养殖业废弃物中的eheco157:h7，从污染源头切断其传播途径，对保障我国消费者的食品安全具有重要的意义。技术实现要素：本发明目的在于结合当前养殖业现状，通过简便的静态堆肥方法无害化处理牛粪中的致病菌eheco157:h7，并将牛粪作为生物有机肥资源化利用。为实现上述目的，本发明提供了一种无害化处理牛粪的静态堆肥方法，包括以下步骤：s1、微生物复合菌剂的制备：分别取浓度为108～109cfu/ml的枯草芽孢杆菌abtnl-2菌液、地衣芽孢杆菌菌液、蜡样芽胞杆菌菌液和乳酸菌菌液按照体积比1:(0.3～0.8):(0.15～0.9):(0.9～1.8)混合，得牛粪堆肥用微生物复合菌剂；其中201510002881.5的发明专利申请《一种具有抗虫功能的生物有机肥及其制备方法》记载了所述枯草芽孢杆菌abtnl-2，本发明所述枯草芽孢杆菌abtnl-2可选用该枯草芽孢杆菌；s2、牛粪堆肥的建立：将牛粪与植物物料按重量比1:(0.05～0.1)混合，得混合物料；将所述混合物料接种步骤s1制备的微生物复合菌剂，调整含水率至55％～65％，得堆肥物料；用草垛和堆肥物料建立带有通气装置的堆肥堆体，并在堆体中设置温度监测装置；其中，所述植物物料由秸秆、杂草、木屑和树叶中的一种或多种组成；所述混合物料接种微生物复合菌剂的量为：每千克混合物料接种0.005～0.025l；s3、堆肥管理：每日1～2次在同一时间通过通气装置为堆肥通气，若通气次数为2次，时间间隔为12h，每次通气5～10min，通气量为1～2m3·min-1；通过温度监测装置检测堆肥温度；温度随堆肥进行先上升后下降，当堆肥温度下降至堆肥环境温度并保持稳定时，判定堆肥结束，得到的堆肥产物作为生物有机肥原料使用；所述堆肥产物含水率为10％～30％，微生物含量高于2×107cfu·g-1。优选方式下，步骤s1所述草芽孢杆菌abtnl-2菌液、地衣芽孢杆菌菌液和蜡样芽胞杆菌菌液的制备方法相同，具体为：将芽胞杆菌接种于液体培养基a，37℃震荡培养24～48h，获得浓度为108～109cfu/ml的芽孢杆菌菌液；所述液体培养基a配方为牛肉膏3～4g，蛋白胨3.5～4.5g，葡萄糖3～4g，淀粉2～3g，nacl6～8g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2。优选方式下，步骤s1所述乳酸菌菌液的制备方法为：将乳酸菌接种于液体培养基b，37℃条件下静置培养56～72h，获得浓度为108～109cfu/ml的乳酸菌菌液；其中，所述液体培养基b配方为蛋白胨8～10g，牛肉膏8～10g，酵母膏4～5g，葡萄糖18～20g，吐温800.9～1ml，乙酸钠4～5g，磷酸氢二钾1.8～2g，硫酸镁0.5～0.6g，硫酸锰0.2～0.3g，蒸馏水1000ml，ph6.2～6.6。优选方式下，步骤s2所述通气装置为布置于堆体上下和四周的相互连接的打孔ppr或pvc材质的硬管，两个管口从堆体侧面伸出堆体外部。优选方式下，步骤s2所述建立带有通气装置的堆肥堆体具体为：用20～30cm厚的草垛建立一个立方体堆体空间，采用dn6规格的ppr水暖管，在空间的四个侧面和底部布置田字形通风管道，五个面的管道相互连通并闭合，在管道朝向堆体的一侧打孔，孔直径0.5cm、间隔10cm，所述管道的两个管口从堆体对称的两个侧面伸出堆体外部，所述管口通过软管与鼓风机相连，构成通气装置；将堆肥物料填满堆体空间，所述堆体上部用20cm厚草垛覆盖，得堆肥堆体。优选方式下，所述堆肥堆体宽度为0.8～1.5m、高度为0.7～1.3m。本发明的有益效果是：本发明采用静态堆肥法及时无害化处理牛粪，灭活牛粪中的eheco157:h7，改善养殖环境，减少牛体携菌量，提高牛肉制品的安全性，保证消费者健康；同时，堆肥处理可实现养殖业废弃物的无害化处理和资源化利用，带来更大的经济效益；本发明提供的一种无害化处理牛粪的静态堆肥方法具有如下所述的优点：(1)旨在提高腐熟效率：由于是静态堆肥，虽然有通风装置，但还会有部分角落为厌氧环境，乳酸菌的加入能够在此时大量繁殖，产生热量；(2)微生物复合发酵，通过协同作用，在充分降解有机质的基础上加快温度的上升，使堆肥提前进入高温期，并能够提高温度峰值且延长堆肥高温持续时间，加速eheco157:h7的灭活和生物有机肥制备的过程。(3)枯草芽孢杆菌abtnl-02在堆肥中大量增殖产生的代谢产物对eheco157:h7有很好的抑制作用，加速病原菌的灭活；(4)条垛动态翻堆的工业化模式不能适应小规模的就地静态堆肥。在静态堆肥过程中的上下和四周的草垛，保证堆体外缘和底部温度，使得eheco157:h7灭活不留死角。(5)生产工艺相对简单，生产成本低，适合小型养殖厂实际应用。具体实施方式本发明提供了一种无害化处理牛粪的静态堆肥方法在具体实施方式中，包括以下步骤：s1.微生物菌剂的制备，分别枯草芽孢杆菌abtnl-2、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌接种于液体培养基a，37℃条件下震荡培养24h获得三种浓度为108～109cfu·ml-1的芽孢杆菌菌液；将乳酸菌接种于液体培养基b，37℃条件下静置培养72h，获得浓度为108～109cfu·ml-1的乳酸菌菌液。将上述四种菌液按比例混合后制得牛粪堆肥用微生物复合菌剂；s2.牛粪堆肥的建立，将牛粪与植物物料按照1:0.05～0.1的重量比混合，接种s1中的微生物复合菌剂，混合均匀，将堆体调整至含水率55～65％后建立堆肥，用20～30cm厚的草垛将堆体上下及四周覆盖保温，在堆肥中分别设置通气装置，温度监测装置；s3.堆肥管理，每日1～2次定时通过通气管道装置为堆体通气，每次5～10min，每次保证堆肥中微生物大量繁殖所需的氧气，保证快速升温和腐熟；通过温度监测装置对堆肥温度进行监测。s4.堆肥结束后产物作为生物有机肥原料使用。通过温度监测数据，堆肥温度不断升高，当堆肥温度不断下降至接近或稍高于环境温度并保持稳定时，判定堆肥过程结束，得到堆肥产物作为生物有机肥原料使用。优选地，步骤s1中所述abtnl-2，cn201510002881.5的发明专利申请《一种具有抗虫功能的生物有机肥及其制备方法》记载了所述枯草芽孢杆菌abtnl-2，本发明所述枯草芽孢杆菌abtnl-2可选用该枯草芽孢杆菌优选地，步骤s1中所述液体培养基a配方为，牛肉膏3～4g，蛋白胨3.5～4.5g，葡萄糖3～4g，淀粉2～3g，nacl6～8g，蒸馏水1000ml，ph7.0～7.2；优选地，步骤s1中所述液体培养基b配方为蛋白胨8～10g，牛肉膏8～10g，酵母膏4～5g，葡萄糖18～20g，吐温800.9～1ml，乙酸钠4～5g，磷酸氢二钾1.8～2g，硫酸镁0.5～0.6g，硫酸锰0.2～0.3g，蒸馏水1000ml，ph6.2～6.6。优选地，步骤s1中所述枯草芽孢杆菌abtnl-2、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、和乳酸菌在配制复合菌剂时体积比为1:(0.3～0.8):(0.15～0.9):(0.9～1.8)。优选地，步骤s2中所述植物物料由秸秆、杂草、木屑和树叶的至少一种组成。优选地，步骤s2中所述微生物复合菌剂的接种量为菌液体积与混合物料质量比的0.5～2.5％。优选地，步骤s2中所述堆体的宽度0.8～1.5m，高度为0.7～1.3m，长度可根据场地条件进行调整。优选地，步骤s2中所述通风装置的管道材质为相互连接的打孔的ppr或pvc材质的硬管，布置于堆体的上下和四周，两个管口从侧面伸出堆体外部。优选地，步骤s4中所述堆肥产物含水率为10～30％，微生物含量高于2×107cfu·g-1。下面通过实施例进一步详细说明本发明。下述实施例使用的枯草芽孢杆菌abtnl-2选用201510002881.5发明专利申请《一种具有抗虫功能的生物有机肥及其制备方法》记载的枯草芽孢杆菌abtnl-2。实施例1：s1、微生物菌剂的制备s11、制备芽孢杆菌菌液：分别将枯草芽孢杆菌abtnl-2、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌接种于液体培养基a(牛肉膏4g，蛋白胨4g，葡萄糖4g，淀粉3g，nacl7g，蒸馏水1000ml，ph7.0)，37℃条件下震荡培养24h获得菌液，三种细菌对应菌液的体积分别1.5l、0.9l和1.2l，浓度分别为8×108cfu·ml-1，2×108cfu·ml-1和5×108cfu·ml-1；s12、制备乳酸菌液：将乳酸菌接种于液体培养基b(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温801ml，乙酸钠4g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，蒸馏水1000ml，ph6.5)，37℃条件下静置培养72h，获得浓度为3×108cfu·ml-1的乳酸菌菌液1.8ls13混合：将步骤s11所得枯草芽孢杆菌abtnl-02、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和步骤s12所得乳酸菌四种菌液混合后(此时体积比为1:0.6:0.8:1.2)，制得牛粪堆肥用微生物复合菌剂5.4l；s2、牛粪堆肥的建立：将牛粪280kg与秸秆20kg混合，得到300kg混合物料，接种微生物复合菌剂5.4l(此时接种量为0.018l/kg混合物料)混合均匀，此时物料含水率约为60％，得堆肥物料；用20cm厚的草垛建立一个立方体堆体空间，在空间的四个侧面和底部布置田字形通风管道，五个面的管道相互连通并闭合，管道采用dn6规格的ppr水暖管，在朝向堆体的一侧打孔，孔直径0.5cm、间隔10cm，两个管口从对称的两个侧面伸出堆体外部，所述管口分别连接一个软管，软管另一头连接鼓风机，构成通气装置；将堆肥物料填满后，堆肥上部亦用20cm厚草垛盖好保温，此时包括草垛厚度在内的堆体规格为长×宽×高＝1.2m×1m×1m；s3、堆肥管理：每日早晚8点定时通过通气装置为堆体通气，每次10min，通气量为1.5m3·min-1每次保证堆肥中微生物大量繁殖所需的氧气，保证快速升温和腐熟；每次通气前用探头式热电偶测温记录；通过温度监测数据，堆肥温度不断升高，当堆肥温度不断下降至接近或稍高于环境温度并保持稳定时，判定堆肥过程结束，得到堆肥产物作为生物有机肥原料使用，所得堆肥产物含水率为25％，微生物含量为5×108cfu·g-1。实施例2：s1、微生物菌剂的制备s11、制备芽孢杆菌菌液：分别将枯草芽孢杆菌abtnl-2、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌接种于液体培养基a(牛肉膏3g，蛋白胨3.5g，葡萄糖3g，淀粉2g，nacl6g，蒸馏水1000ml，ph7.2)，37℃条件下震荡培养36h获得菌液，三种菌液浓度均为108cfu·ml-1；s12、制备乳酸菌液：将乳酸菌接种于液体培养基b(蛋白胨8g，牛肉膏8g，酵母膏4g，葡萄糖18g，吐温800.9ml，乙酸钠5g，磷酸氢二钾1.8g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.3g，蒸馏水1000ml，ph6.2)，37℃条件下静置培养56h，获得浓度为108cfu·ml-1的乳酸菌菌液s13混合：将步骤s11所得枯草芽孢杆菌abtnl-02、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和步骤s12所得乳酸菌四种菌液按体积比1:0.3:0.15:0.9混合，制得牛粪堆肥用微生物复合菌剂；s2、牛粪堆肥的建立：将牛粪300kg与木屑15kg、秸秆15kg混合，得到330kg混合物料，接种步骤s1所得微生物复合菌剂1.65l(此时接种量为0.005l/kg混合物料)混合均匀，调整物料含水率约为55％，得堆肥物料；用30cm厚的草垛建立一个立方体堆体空间，在空间的四个侧面和底部布置田字形通风管道，五个面的管道相互连通并闭合，管道采用dn6规格的ppr水暖管，在朝向堆体的一侧打孔，孔直径0.5cm、间隔10cm，两个管口从侧面伸出堆体外部，所述管口分别连接一个软管，软管另一头连接鼓风机，构成通气装置；将堆肥物料填满后，堆肥上部亦用30cm厚草垛盖好保温，此时包括草垛厚度在内的堆体规格为长×宽×高＝1.4m×1.2m×1.2m；s3、堆肥管理：每日早晚8点定时通过通气装置为堆体通气，每次8min，通气量为1.5m3·min-1每次保证堆肥中微生物大量繁殖所需的氧气，保证快速升温和腐熟；每次通气前用探头式热电偶测温记录；通过温度监测数据，堆肥温度不断升高，当堆肥温度不断下降至接近或稍高于环境温度并保持稳定时，判定堆肥过程结束，得到堆肥产物作为生物有机肥原料使用，所得堆肥产物含水率为22％，微生物含量为6×108cfu·g-1。实施例3：s1、微生物菌剂的制备s11、制备芽孢杆菌菌液：分别将枯草芽孢杆菌abtnl-2、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌接种于液体培养基a(牛肉膏3.5g，蛋白胨4g，葡萄糖3.5g，淀粉2.5g，nacl7g，蒸馏水1000ml，ph7.2)，37℃条件下震荡培养48h获得菌液，三种菌液浓度均为109cfu·ml-1；s12、制备乳酸菌液：将乳酸菌接种于液体培养基b(蛋白胨9g，牛肉膏9g，酵母膏4.5g，葡萄糖19g，吐温800.9ml，乙酸钠4.5g，磷酸氢二钾1.8g，硫酸镁0.6g，硫酸锰0.3g，蒸馏水1000ml，ph6.6)，37℃条件下静置培养66h，获得浓度为109cfu·ml-1的乳酸菌菌液s13混合：将步骤s11所得枯草芽孢杆菌abtnl-02、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和步骤s12所得乳酸菌四种菌液按体积比1:0.8:0.9:1.8混合，制得牛粪堆肥用微生物复合菌剂；s2、牛粪堆肥的建立：将牛粪300kg与秸秆10kg混合，得到310kg混合物料，接种步骤s1所得微生物复合菌剂7.75l(此时接种量为0.025l/kg混合物料)混合均匀，调整物料含水率约为65％，得堆肥物料；用25cm厚的草垛建立一个立方体堆体空间，在空间的四个侧面和底部布置田字形通风管道，五个面的管道相互连通并闭合，管道pvc材质的硬管，在朝向堆体的一侧打孔，孔直径0.5cm、间隔10cm，两个管口从对称的两个侧面伸出堆体外部，所述管口分别连接一个软管，软管另一头连接鼓风机，构成通气装置；将堆肥物料填满后，堆肥上部亦用25cm厚草垛盖好保温，此时包括草垛厚度在内的堆体规格为长×宽×高＝1.3m×1.1m×1.1m；s3、堆肥管理：每日早8点定时通过通气装置为堆体通气，每次10min，通气量为2m3·min-1每次保证堆肥中微生物大量繁殖所需的氧气，保证快速升温和腐熟；每次通气前用探头式热电偶测温记录；通过温度监测数据，堆肥温度不断升高，当堆肥温度不断下降至接近或稍高于环境温度并保持稳定时，判定堆肥过程结束，得到堆肥产物作为生物有机肥原料使用，所得堆肥产物含水率为26％，微生物含量为3×108cfu·g-1。对比例1(微生物复合菌剂中不包含枯草芽孢杆菌abtnl-2)：s1、微生物菌剂的制备，包括步骤：s11、制备芽孢杆菌菌液：分别将地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌接种于液体培养基a(牛肉膏4g，蛋白胨4g，葡萄糖4g，淀粉3g，nacl7g，蒸馏水1000ml，ph7.0)，37℃条件下震荡培养24h获得菌液，两种细菌对应菌液的体积分别1.2l和1.7l，浓度分别为2×108cfu·ml-1和5×108cfu·ml-1；s12：制备乳酸菌液：将乳酸菌接种于液体培养基b(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温801ml，乙酸钠4g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，蒸馏水1000ml，ph6.5)，37℃条件下静置培养72h，获得浓度为3×108cfu·ml-1的乳酸菌菌液2.5l；s13：混合：将地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和乳酸菌四种菌液混合后(此时体积比为0.6:0.85:1.25)，制得牛粪堆肥用微生物复合菌剂5.4l；s2、牛粪堆肥的建立：将牛粪280kg与秸秆20kg混合，得到300kg混合物，接种微生物复合菌剂5.4l(此时接种量为1.8％)混合均匀，此时物料含水率约为60％，用20cm厚的草垛建立一个立方体空间，在空间的四个侧面和底部布置田字形通风管道，五个面的管道相互连通并闭合，管道采用dn6规格的ppr水暖管，在朝向堆体的一侧打孔，孔直径0.5cm，间隔10cm，两个管口从对称的两个侧面伸出堆体外部，所述两个管口分别连接一个软管，软管另一头连接鼓风机。将堆肥物料填满后，堆肥上部亦用20cm厚草垛盖好保温，此时包括草垛厚度在内的堆肥规格为长×宽×高为1.2m×1m×1m；s3、堆肥管理，每日早晚8点定时通过通气管道装置为堆体通气，每次10min，通气量为1.5m3·min-1每次保证堆肥中微生物大量繁殖所需的氧气，保证快速升温和腐熟；每次通气前用探头式热电偶测温记录；通过温度监测数据，堆肥温度不断升高，当堆肥温度不断下降至接近或稍高于环境温度并保持稳定时，判定堆肥过程结束，得到堆肥产物作为生物有机肥原料使用。对比例2(未加盖草垛保温装置)：s1、微生物菌剂的制备，包括步骤：s11、制备芽孢杆菌菌液：分别将枯草芽孢杆菌abtnl-2、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌接种于液体培养基a(牛肉膏4g，蛋白胨4g，葡萄糖4g，淀粉3g，nacl7g，蒸馏水1000ml，ph7.0)，37℃条件下震荡培养24h获得菌液，三种细菌对应菌液的体积分别1.5l、0.9l和1.2l，浓度分别为8×108cfu·ml-1，2×108cfu·ml-1和5×108cfu·ml-1；s12、制备乳酸菌菌液：将乳酸菌接种于液体培养基b(蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，吐温801ml，乙酸钠4g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，蒸馏水1000ml，ph6.5)，37℃条件下静置培养72h，获得浓度为3×108cfu·ml-1的乳酸菌菌液1.8ls13、混合：将枯草芽孢杆菌abtnl-02、地衣芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和乳酸菌四种菌液混合后(此时体积比为1:0.6:0.8:1.2)，制得牛粪堆肥用微生物复合菌剂5.4l；s2、牛粪堆肥的建立：将牛粪280kg与秸秆20kg混合，得到300kg混合物，接种微生物复合菌剂5.4l(此时接种量为1.8％)混合均匀，此时物料含水率约为60％，用一个1.2m×1m×1m的塑料箱，在空间的四个侧面和底部布置田字形通风管道，五个面的管道相互连通并闭合，管道采用dn6规格的ppr水暖管，在面向堆体的一侧打孔，孔直径0.5cm，间隔10cm，两个管口从侧面伸出堆体外部，所述两个管口分别连接一个软管，软管另一头连接鼓风机；将堆肥物料填满后，堆肥上部塑料布盖好；s3、堆肥管理：每日早晚8点定时通过通气管道装置为堆体通气，每次10min，通气量1.5m3·min-1每次保证堆肥中微生物大量繁殖所需的氧气，保证快速升温和腐熟；每次通气前用探头式热电偶测温记录；通过温度监测数据，堆肥温度不断升高，当堆肥温度不断下降至接近或稍高于环境温度并保持稳定时，判定堆肥过程结束，得到堆肥产物作为生物有机肥原料使用。统计各组的相关数据参数，结果如下表所示：表1堆肥参数统计表项目实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2堆肥平均最高温度/℃717269656260℃以上温暖持续时间/d45432堆肥上表面、侧面和底部平均最高温度/℃5453555040eheco157:h7灭活率/％1001001008545堆肥结束时间/d8781015堆肥产物的种子发芽率/％8587908255堆肥产物的活菌数/cfu·g-15×1086×1083×1081×1081×107结果显示，实施例1、2和3中的堆肥最高温度相对更高，高温持续时间长，堆体各部分保温效果好，能够使eheco157:h7完全灭活，腐熟时间较短，堆肥产物效果好；对比例1中缺少了abtnl-2枯草芽孢杆菌，堆肥效果较实施例稍差，堆肥时间有所延长，对eheco157:h7未能完全灭活；对比例2中减少草垛保温装置，堆体温度未能达到足够的高温，结束时间长，且堆肥产物效果差，对种子发芽有影响，可能由于堆体散热未能腐熟完全，且对eheco157:h7未能完全灭活。由此可知，本发明中无害化处理牛粪的静态堆肥方法能够提高堆肥的腐熟效率，可使eheco157:h7完全灭活，且堆肥产物效果佳，资源化利用潜力高。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12