一种微生物预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法与流程

本发明涉及一种微生物预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法，属于农业固体废弃物资源化利用技术领域。

背景技术：

随着我国集约化农业的快速发展，农作物秸秆和畜禽粪便等农业有机固体废弃物产生量不断增加而且处理难度增大。2016年，全国主要农作物秸秆产量达到9.84亿吨，畜禽粪便产生量达到39亿吨。农业有机固废不合理处置，不仅造成资源浪费，而且已成为我国农业面源污染的主要来源之一。将秸秆和畜禽粪便混合后进行好氧堆肥是实现农业有机废弃物减量化处理和资源化利用的重要方式。腐熟的堆肥产品富含腐殖质，是一种优质的有机肥，农田施用后不仅可以增加土壤中有机质及氮、磷、钾等作物营养元素的含量，减少化肥施用量，而且可以改善土壤理化性状，提高土壤肥力水平，提高作物的产量和品质。

堆肥物料中通常添加农作物秸秆作为调理剂，农作物秸秆的主要组分是难降解的木质纤维素，限制着堆肥过程中碳素的循环转化，造成堆肥腐熟周期长、腐殖化程度低下，严重影响农业废弃物堆肥的生产效益和产品肥效。腐熟的堆肥一般只有10～40％来源于木质纤维素的碳素被降解转化，其中只有30％最终形成稳定腐殖质，其余主要以co2的形式释放到环境中，从而导致堆肥原料碳素损失和腐殖质含量不足(jiangt,etal.effectofc/nratio,aerationrateandmoisturecontentonammoniaandgreenhousegasemissionduringthecomposting.journalofenvironmentalsciences,2011,23(10):1754-1760)。如何快速分解木质纤维素并转化为腐殖质，成为提高堆肥效率和产品质量的关键。

通过对堆肥物料进行预处理以提高堆肥发酵效率的研究已有报道。目前堆肥物料预处理主要采用理化手段，如专利cn107141047a公开了一种湿热预处理促进畜禽粪便腐熟的堆肥方法，将畜禽粪便和调理剂混合，然后加热混合好的物料至80～95℃，维持高温1～4h，待物料冷却至50℃后再进行好氧堆肥，直至物料腐熟。但是该方法需要配备高温加热设备，存在设备要求高和能耗大的不足。

关于微生物预处理秸秆加速堆肥腐熟过程和提高产品腐殖质含量方面的研究仍然很少，微生物预处理具有成本低、处理条件温和和无二次污染等优点。传统上外源微生物作为菌剂直接接种到堆体中，虽然能加快木质纤维素降解，缩短堆肥发酵时间，但是其效果容易受到堆体自身环境条件和堆肥土著微生物竞争的影响，导致物料腐熟不彻底(即秸秆等木质纤维素原料只有部分被转化为腐殖质，大部分仍然存在于堆肥产品中)，难以达到预期的堆肥腐熟效果。此外，常规的堆肥微生物菌剂组成复杂，通常含有多种不同的细菌、真菌和放线菌，制备过程繁琐，增加了堆肥生产成本。有研究报道采用微生物菌剂预处理水稻秸秆可以缩短堆肥高温期8～13d，但是对堆肥腐殖质含量没有提升作用(王砚，李念念，朱端卫，等.水稻秸秆预处理对猪粪高温堆肥过程的影响[j].农业环境科学学报,2018,37(9)：2021-2028)。该方法所用微生物菌剂包括芽孢杆菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等多种微生物，不仅制备过程复杂，而且这些微生物主要将木质纤维素彻底矿化为co2和h2o，而不是向腐殖质方向转化，导致堆肥没有达到提高腐殖质含量的理想效果。

常见的用于堆肥的木质纤维素降解菌，如白腐菌和细菌，通过产生一系列酶将木质纤维素彻底降解，而密粘褶菌降解木质纤维素的功能主要通过羟基自由基的氧化作用来实现，对木质纤维素的矿化程度低。目前将密粘褶菌应用于堆肥领域尚未见报道。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种微生物预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法，该方法不仅可以缩短堆肥腐熟周期，而且减少堆肥过程co2的排放量，有效降低物料中有机物的矿化程度，降低碳素损失，显著增加堆肥产品腐殖质含量，提高堆肥效率和堆肥产品品质。

本发明是这样实现的：一种微生物预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法，其具体步骤如下：

(1)通过活化培养、种子培养和扩大培养制成密粘褶菌液体菌剂；

(2)将农作物秸秆含水率调节至60～80％，ph值至6-8，尿素添加量为农作物秸质量百分数为1～2％(w/w)；本步骤利用尿素为密粘褶菌生长提供氮源，秸秆提供碳源；

(3)按质量比1～5％向秸秆中接种密粘褶菌液体菌剂，将秸秆置于发酵箱中在20～30℃进行5天的固态发酵，获得预发酵秸秆；

(4)待预处理结束，将预发酵秸秆与畜禽粪便按质量比1:3～1:6混合获得发酵物料，通过鼓风或翻堆的方式对物料进行曝气供氧，进行好氧堆肥，直至物料完全腐熟；所述完全腐熟是指堆体温度降至环境温度。

进一步，本发明所述微生物预处理促进畜禽粪便腐熟的堆肥方法中，步骤(1)中所述密粘褶菌液体菌剂活菌数不低于2×10⁸cfu/ml。

进一步，本发明所述微生物预处理促进畜禽粪便腐熟的堆肥方法中，步骤(2)中所述农作物秸秆为麦秸、稻草、玉米秸秆、高粱杆和油菜秸秆中的一种或多种。

进一步，本发明所述微生物预处理促进畜禽粪便腐熟的堆肥方法中，步骤(2)中所述农作物秸秆长度为1～3cm。

进一步，本发明所述微生物预处理促进畜禽粪便腐熟的堆肥方法中，步骤(4)中所述畜禽粪便为猪粪、牛粪、鸡粪、鸭粪和羊粪中的一种或多种。

进一步，本发明所述微生物预处理促进畜禽粪便腐熟的堆肥方法中，步骤(4)中所述秸秆和畜禽粪便按质量比1:3～1:6混合。

进一步，本发明所述微生物预处理促进畜禽粪便腐熟的堆肥方法中，步骤(4)中所述好氧堆肥是指以槽式、条垛式、滚筒式、仓式或塔式，采用鼓风和/或翻堆，进行好氧堆肥，该好氧堆肥为本领域的常规方式，如文献“有机固体废弃物好氧高温堆肥化处理技术”(黄国锋等，中国生态农业学报，2003,11(1):159-161)所公开的堆肥方法。

与现有堆肥方法相比，本发明的有益效果体现在：

(1)密粘褶菌预处理后，农作物秸秆出现大量的孔隙结构，有效表面积增大，结晶度和聚合度降低，促进堆肥土著微生物对木质纤维素类有机物的利用，加快堆肥升温过程，缩短堆肥周期10天左右。

(2)密粘褶菌预处理农作物秸秆产生腐殖质的前体物质酚类物质，酚类物质是腐殖质的前体，为堆肥微生物合成腐殖质提供底物，在升温阶段就启动腐殖质合成，腐殖质含量提高15～20％，并且减少co2释放量30～50％，有效降低有机物的矿化程度。

(3)密粘褶菌预处理提高了堆肥微生物区系的丰度，增加堆肥中细菌数量1～2个数量级。

(4)本发明所述的微生物预处理操作简单，成本低廉，无需专门设备，处理过程无污染物产生，可以避免传统微生物接种剂易受堆肥条件影响和与堆肥土著微生物竞争的问题，显著提高了堆肥效率和堆肥产品品质。本发明所述的微生物预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法具有很好的应用价值，堆肥企业可利用该技术进行畜禽粪便、农作物秸秆的减量化处理和有机肥生产。

附图说明

图1密粘褶菌预处理麦秸(实验组)和对照麦秸(对照组)的扫描电镜图像；

图2密粘褶菌预处理麦秸堆肥(实验组)和常规堆肥(对照组)的堆体温度示意图；

图3密粘褶菌预处理麦秸堆肥(实验组)和常规堆肥(对照组)的腐殖质含量示意图；

图4密粘褶菌预处理麦秸堆肥(实验组)和常规堆肥(对照组)的细菌丰度示意图。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例中涉及的微生物来源：

密粘褶菌(gloeophyllumtrabeum)为常规菌株，实施例中使用的菌株为文献”comparativeanalysisofthesecretomesofschizophyllumcommuneandotherwood-decaybasidiomycetesduringsolid-statefermentationrevealsitsuniquelignocellulose-degradingenzymesystem”(zhuetal.,biotechnologyforbiofuels,2016,9:42)所公开的菌株；由江苏省农业科学院循环农业研究中心生物质转化研究室保存。

实施例中涉及的培养基：

固体培养基：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，水1l，自然ph。

液体培养液：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，水1l，自然ph。

实施例中所使用的塑料发酵箱为江苏林辉塑料制品有限公司市售塑料方箱k-50l。

实施例中所使用的堆肥箱装置(静态堆肥箱)参见文献“超高温预处理装置及其促进鸡粪稻秸好氧堆肥腐熟效果”(曹云等，农业工程学报，2017,33(13):243-250)。堆肥箱为边长60cm立方体，由5块不锈钢板拼装而成，在箱内壁和底部装有2层厚度为3cm的泡沫板，进行保温；顶部装有可拆卸的泡沫板盖，箱底和顶部均匀分布直径为2cm的通气孔，孔面积约为箱底面积的1/4。

实施例中禽畜粪便取自江苏省农业科学院六合动物实验基地。

实施例1

密粘褶菌液体菌剂的制备，包括以下步骤：

(1)活化培养：将密粘褶菌接种到固体培养基上，在28℃静置培养5天；

(2)种子培养：用无菌生理盐水洗涤步骤(1)中固体培养基上的密粘褶菌菌体，进行涡旋振荡5min，获得菌体悬液，接种到100ml液体培养液中，培养条件为28℃摇床振荡培养24h，振荡转速为200rpm，获得种子液；

(3)扩大培养：将步骤(2)中获得的种子液按体积比10％接种到1l液体培养液中，进行扩大培养，培养条件为28℃摇床振荡培养48～72h，振荡转速为200rpm，然后将获得密粘褶菌液体菌剂于4℃保存待用。获得的密粘褶菌液体菌剂中密粘褶菌含量为2×10⁸cfu/ml。

在具体实施中，只要确保液体菌剂中密粘褶菌活菌数不低于2×10⁸cfu/ml(如3.5×10⁸cfu/ml)，均可实现发明之目的。

实施例2

应用实施例1中的密粘褶菌液体菌剂进行麦秸预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法，包括如下步骤：

(1)预处理：向10kg粉碎至长度1～3cm的麦秸中按质量比1％加入尿素，调节含水率为70％，ph值为7。按2％质量比将实施例1中所得密粘褶菌液体菌剂接种到10kg麦秸中，充分搅拌，装入在50l塑料发酵箱中进行固态发酵，发酵时间为5d，发酵温度为30℃；预处理结束后，秸秆各项参数检测结果如表2、表3所示。

(2)堆料：预处理结束后，将预处理后的麦秸和含水率为70％的新鲜猪粪按质量比为1:3混合均匀，调节含水率为60％，通过添加尿素或葡萄糖调节c/n比为25；

(3)堆肥：将步骤(2)中所得混合物料转入静态堆肥箱(物料装样量35kg)中进行堆肥，当温度上升到50℃以上时翻堆，每3d翻堆1次，温度下降到50℃以下每7d翻1次，直至堆体温度下降至环境温度结束堆肥。

上述堆肥方法为本领域常规堆肥方法，如文献“有机固体废弃物好氧高温堆肥化处理技术”(黄国锋等，中国生态农业学报，2003,11(1):159-161)中所公开的方法。

步骤(3)堆肥开始后，每天监测堆料温度和co2排放量，每5d采集堆料样品，测定总有机碳、总氮、腐殖质含量、种子发芽率。

上述堆肥温度的测定方法：每天采用水银温度计分别测定堆肥上、中、下部的温度，取平均值作为堆体的实际温度，同时监测堆肥现场的环境温度。

总碳和总氮含量的测定方法：鲜样经风干、磨碎后过80目筛后备用，总有机碳采用重铬酸钾氧化法测定，总氮采用凯氏定氮法测定。

腐殖质含量的测定方法：2g堆肥样品加入20ml提取液(0.1mol/lnaoh和0.1mol/lna2p2o7，体积比为1:1)，室温下振荡2h，4000rpm离心10min，提取上清液，去掉滤渣，滤液为总腐殖质，采用toc仪测定样品中的腐殖质。

种子发芽指数的测定方法：将新鲜堆肥样品与水按1:10(质量体积比)比例混合振荡2h，上清液过滤后待用；将一张大小合适滤纸放入干净无菌的直径9cm培养皿中，滤纸上整齐摆放20粒小白菜种子，准确吸取3ml滤液于培养皿中，在25℃、黑暗条件下培养96h，测定小白菜种子的发芽率和根长，同时用去离子水做空白对照。其计算公式为：gi＝(堆肥处理的种子发芽率×种子根长)/(对照的种子发芽率×种子根长)×100％。

在具体实施过程中，步骤(1)所述的秸秆还可以选择稻草、玉米秸秆、高粱杆和油菜秸秆中中的一种或多种，尿素添加量为1～2％，调节含水率为60～80％，ph值为6～8，密粘褶菌液体菌剂接种量在质量百分比1～5％之间，均可实现本发明的目的。

在具体实施过程中，步骤(2)所述的畜禽粪便为猪粪、牛粪、鸡粪、鸭粪和羊粪中的一种或多种，秸秆和畜禽粪便按质量比3:1～6:1混合，调节含水率在50～65％之间，均可实现本发明的目的。

实施例3

本实施例为对比例，堆肥原料组成和方法与测定方法均与实施例2相同，但省略实施例2中微生物预处理步骤(即步骤(1)和步骤(2))，直接进行常规堆肥作为对照组，以实施例2作为实验组，对比预处理前后麦秸性质，和堆肥过程中物料温度变化、种子发芽指数、co2排放量、腐殖质含量和微生物数量。

本实验例堆肥原料的基本性质如下表1：

表1堆肥原料的基本性质

实验结果：

1、利用液相色谱-质谱联用(lc-ms)测定密粘褶菌预处理麦秸前后各种酚类物质的含量，结果如表2所示。

表2密粘褶菌预处理麦秸前后的酚类物质含量(ng/ml)

和对照组相比，实验组中密粘褶菌预处理麦秸显著增加9种酚类物质的产量，这些酚类物质是腐殖质形成的前体物质，为堆肥腐殖质的生成提供底物。

2、密粘褶菌预处理前后麦秸的表面形貌

利用扫描电镜技术对实施例2密粘褶菌预处理前后麦秸的表面形态进行观察，所获得的电镜图如图1所述。由图1可知，对照组麦秸表面较为光滑平整，结构致密规整，而密粘褶菌预处理后的麦秸表面结构被明显破坏，出现了孔隙和裂缝，内部结构暴露。

3、测定预处理过程中麦秸结晶度和聚合度，结果如表3所示。

表3密粘褶菌预处理前后麦秸结晶度和聚合度

由表3可知，密粘褶菌预处理麦秸降低了麦秸结晶度和聚合度，实验组麦秸结晶度和聚合度比对照组分别降低了28.7％和47.9％，麦秸结晶度和聚合度的降低使麦秸在后续堆肥过程中更容易被堆肥土著微生物降解利用，从而加速堆肥腐熟进程。

4、堆肥过程中每天测定实验组和对照组堆体的温度，结果如表4和图2所示。

表4两种处理方式堆肥温度情况

根据堆肥卫生指标要求，堆肥温度达到50℃即进入高温期，50℃以上持续5-7d能够保证堆体病原菌被有效杀灭，使物料完全腐熟。实验组在第3d堆体温度就达到50℃，高温期持续17d，最高温度达到71℃，而对照组经过6d堆体温度达到50℃，高温期持续12d，最高堆温为66℃。同时，实验组堆肥周期仅为27d，远低于对照组37d。由此可见，实验组密粘褶菌预处理能够加速堆肥升温，增加高温期持续时间，提高堆肥高温期的温度，同时显著缩短堆肥周期，加快物料腐熟。

5、堆肥过程中每隔5d测试实验组和対照组堆肥的种子发芽指数(gi)，结果如表5所示。

表5堆肥过程种子发芽指数(gi)

种子发芽指数(gi)能够指示堆肥样品的植物毒性水平，堆肥腐熟的重要指标之一是种子发芽指数(gi)达到80％以上，在堆肥过程中实验组的gi值均高于对照组，实验组在堆肥第5天gi就接近80％，而对照组不到50％。实验组堆肥10天gi就达到80％以上，而对照组的gi值只有52.8％，堆肥第15天后对照组gi才达到80％。说明实验组中密粘褶菌预处理显著提高了后续堆肥产品的腐熟度，缩短了腐熟周期。

6、堆肥过程中每天采用静态箱收集实验组和对照组释放的co2，用气相色谱仪测定co2浓度，取其平均值记录，结果如表6所示。

表6两种堆肥方式co2的日均排放量和累积排放量

由表6可知，实验组每天的平均co2排放量为8.2g/d/kg，堆肥40天的累积排放量为328.4g/kg，而对照组的co2日均排放量为13.7g/d/kg，堆肥40天的累积排放量为546.5g/kg，由此可见：实验组co2日均排放量和累积排放量相对于对照组分别下降了40.1％和39.9％，这说明实验组中密粘褶菌预处理麦秸能显著减少堆肥过程中co2排放，降低堆肥有机质矿化程度，减少物料中碳素损失。

7、堆肥过程中实验组和对照组的腐殖质含量和微生物数量

由图3可知，实验组在堆肥前期的升温阶段腐殖质合成就已经启动，腐殖质含量呈增加趋势，在中后期比对照组提高15.0％-20.3％，说明密粘褶菌预处理麦秸促进堆肥中木质纤维素的降解，提高堆肥有机物的腐殖化程度。腐殖质作为一种有机质可以大大提高肥料的肥效，为作物生长提供一定的营养物质。由图4可知，和对照组相比，实验组中堆肥细菌数量增加了1-2个数量级，说明密粘褶菌预处理麦秸促进堆肥中木质纤维素降解菌的生长，提高了堆肥微生物区系的丰度。

实施例4

本实施例同样应用实施例1中的密粘褶菌液体菌剂进行稻草预处理促进畜禽粪便堆肥腐熟的方法，实验组包括如下步骤：

(1)预处理：向10kg粉碎至长度1～3cm的稻草中按质量比2％加入尿素，调节含水率为80％，ph值为7.5。按4％质量比将实施例1中所得密粘褶菌液体菌剂接种到10kg稻草中，充分搅拌，装入在50l塑料发酵箱中进行固态发酵，发酵时间为5d，发酵温度为28℃；

(2)堆料：预处理结束后，将预处理后的稻草和含水率为72％的新鲜鸡粪按质量比为1：5用人工或机械方法混合均匀，调节含水率为55％，c/n比为25；

(3)堆肥：将步骤(2)中所得混合物料转入静态堆肥箱(物料装样量35kg)中进行堆肥，当温度上升到50℃以上时翻堆，每3d翻堆1次，温度下降到50℃以下每7d翻1次，直至堆体温度下降至环境温度结束堆肥。

上述步骤(3)堆肥箱装置参见文献“超高温预处理装置及其促进鸡粪稻秸好氧堆肥腐熟效果”(曹云等，农业工程学报，2017,33(13):243-250)。堆肥箱为边长60cm立方体，由5块不锈钢板拼装而成，在箱内壁和底部装有2层厚度为3cm的泡沫板，进行保温；顶部装有可拆卸的泡沫板盖，箱底和顶部均匀分布直径为2cm的通气孔，孔面积约为箱底面积的1/4。

上述步骤(3)堆肥方法参见文献“有机固体废弃物好氧高温堆肥化处理技术”(黄国锋等，中国生态农业学报，2003,11(1):159-161)。

堆肥开始后，每天监测堆料温度和co2排放量，每7d采集堆料样品，测定总有机碳、总氮、腐殖质含量，测定方法见实施例2。

同时，以经过商业秸秆菌剂预处理的稻草堆肥为对照组，预处理方法、菌剂添加量、堆肥原料组成和方法与测定方法均与实施例3相同，对比两种预处理下堆肥过程中物料温度变化、co2排放量和腐殖质含量。

秸秆菌剂为南京宁粮生物工程有限公司市售微生物液体菌剂，主要成分包括芽孢杆菌、高温放线菌、酵母菌、白腐菌等多种常规微生物，有效活菌数≥2亿/ml。

本实验例堆肥原料的基本性质如下表7：

表7堆肥原料的基本性质

实验结果：

1、堆肥过程中每天测定实验组和对照组堆体的温度，结果如表8所示。

表8两种处理方式堆肥温度情况

由表8可知，实验组在第2d堆体温度就达到50℃，高温期持续15d，最高温度达到70℃，而对照组经过4d堆体温度达到50℃，高温期持续11d，最高堆温为64℃。实验组堆肥周期为36d，低于对照组45d。由此可见，和常规微生物预处理相比，实验组密粘褶菌预处理能够加速堆肥升温，增加高温期持续时间，提高堆肥高温期的温度，同时显著缩短堆肥周期。

2、堆肥过程中每天测定实验组和对照组的co2释放量，取其平均值记录，结果如表9所示。

表9两种堆肥方式co2的日均排放量和累积排放量

由表9可知，实验组每天的平均co2排放量为10.8g/d/kg，堆肥40天的累积排放量为432.0g/kg，碳素损失率为23.7％。而对照组的co2日均排放量为16.3g/d/kg，堆肥40天的累积排放量为652.2g/kg，碳素损失率为34.8％。实验组co2累积排放量相对于对照组下降了33.8％，碳素损失率也低于对照组。这说明相比于常规微生物预处理，实验组中密粘褶菌预处理稻草能显著减少堆肥过程中co2排放，降低堆肥有机质矿化程度，减少物料中碳素损失。

3、堆肥过程中实验组和对照组的腐殖质含量

表10两种堆肥方式下堆肥物料的腐殖质含量

由表5可知，实验组和对照组腐殖质含量呈增加趋势，实验组腐殖质含量在堆肥过程中均高于对照组，堆肥结束时实验组腐殖质含量比对照组高18.5％，说明和常规微生物预处理相比，密粘褶菌预处理稻草对堆肥腐殖化程度的提升作用更显著。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。