石墨烯产品及其治疗用途的制作方法

石墨烯产品及其治疗用途
发明领域
1.本发明涉及新型石墨烯产品、其组合物及其在治疗中的用途。
2.发明背景
3.在2010年诺贝尔物理学奖之后，石墨烯基材料或石墨烯相关材料家族最近逐渐成为人们关注的焦点，随后这些材料在能源、电子、传感器、光处理、医学和环境领域的应用发展也开始激增。石墨烯，作为这个家族的“创始”成员，是一种由sp2杂化碳原子排列成六角形蜂窝状晶格的二维材料。
4.石墨烯相关材料的大家族包括石墨烯(单层和多层)、石墨、多环芳烃、碳纳米管、富勒烯、各种不同维度的石墨烯纳米结构(例如，石墨烯纳米纤维、石墨烯纳米颗粒、石墨烯量子点、石墨烯纳米带、石墨烯纳米网、，石墨烯纳米盘、石墨烯泡沫、石墨烯纳米柱)、其他石墨烯相关材料、石墨烯替代物相关材料(例如，碳原子被n、b、p、s、si或其他取代)和与石墨烯相关的具有活性官能团的材料(例如，羧基、酯、酰胺、硫醇、羟基、二醇基、酮基、磺酸基、羰基、芳基、环氧基、酚基、膦酸、胺基、卟啉、吡啶、聚合物及其组合)。
5.一些出版物描述了石墨烯材料在医学上的应用。
6.us2006/0134096描述了包含石墨烯的组合物的医学用途的组合物和方法，特别是非多孔碳，富勒烯或纳米管除外，包括石墨烯。它们被局部使用于伤口，作为毒素的吸收剂或用于血液透析。
7.ep313353公开了一种基于石墨烯纳米结构的用于预防或治疗神经退行性疾病的药物组合物。石墨烯纳米结构抑制蛋白质错误折叠所引起的原纤维形成。
8.us2014/0120081公开了一种碳纳米材料通过降低活性氧水平来治疗受试者氧化性应激的用途。碳纳米材料选自可官能化的纳米管、石墨烯、石墨烯纳米带、石墨、氧化石墨等。
9.gb2532449描述了一种用于通过抑制癌症干细胞的增殖来治疗、预防或防治癌症的功能化纳米材料，其中所述纳米材料是单层石墨烯、少层石墨烯、纳米石墨、单壁或多壁碳纳米管、富勒烯、碳纳米角、碳纳米纤维或无定形或部分无定形纳米碳或其混合物。优选为氧化石墨烯。
10.guranathan s.和kim j-h.在《国际纳米医学杂志》，2016:11，1927-1945页，综合概述了石墨烯和石墨烯相关材料的合成方法、毒性、生物相容性以及在生物医学上的应用。正如本文所讨论的，许多此类产品仍然存在相关的毒性和生物相容性问题。石墨烯的毒性效应会受到物理化学性质的影响，如大小和分布，表面电荷、表面积、层数、横向尺寸、表面化学性质、纯度、颗粒状态、表面官能团和形状。抗癌治疗、光热疗法、药物传递、基因转染、生物传感、影像学和组织工程等都是本综述所提及的生物医学应用领域。
11.目前仍需要一种低毒性或无毒性，生物相容性好、能提供有效生物效应的新型石墨烯基材料及其在治疗中的应用。


技术实现要素：

12.我们现在已经发现新型石墨烯产品具有显著的性能，其具有非常低的毒性或无毒性，这些性能在治疗中是有用的。
13.一方面，本发明涉及选自石墨烯纳米纤维的石墨烯纳米材料，其中，所述石墨烯纳米材料具有粒径分布，所述粒径分布的粒子数dn(90)为0.60μm或更少，其粒子体积dv(90)为80.00μm或更小，这些数值是通过激光衍射粒子分析仪测量的。
14.优选地，石墨烯纳米材料的bet比表面积在100到500m2/g之间，更优选地，在300到350m2/g之间。
15.在另一实施例中，石墨烯纳米材料的孔隙体积在0.35-0.40cm3/g之间。优选地，石墨烯纳米材料中的杂质小于重量的0.01％。
16.在另一方面，本发明涉及一种如上所述的、作为药物使用的石墨烯纳米材料。在一个实施例中，该药物用于治疗伤口、湿疹、银屑病、疤痕、溃疡和其他导致皮肤完整性破坏的症状。
17.在另一方面，本发明涉及包含上述石墨烯纳米材料的药物组合物。
18.在另一方面，本发明涉及上述石墨烯纳米材料在治疗中的用途。
附图说明
19.图1:gmc-l的拉曼光谱
20.图2.-gmc-l在n2中的吸附-解吸
21.图3a.-gnfs原料的x射线衍射图
22.图3b.-gmc-l的x射线衍射
23.图4a.-gnfs原料和gmc-l的粒径分布(以粒子数计)比较
24.图4b.-gnfs原料和gmc-l的颗粒体积百分比对粒度分布情况的比较
25.图5.-用gmc-l处理培养hep-g2细胞24小时的毒性试验。a)用台盼蓝细胞排斥法测定存活率，b)用gmc-l lx和l0x浓度的溶媒通过mtt法测定细胞代谢。数值用平均值+/-sem表示。
26.图6：根据背部区域的活体组织检查，对皮肤伤口愈合的啮齿动物模型(褐家鼠)每2天用包含2x gmc-l的制剂或不包含gmc制剂(ct)进行局部治疗。a)创面闭合时间，b)真皮再生(胶原化和再上皮化)以及c)第4天急性炎症浸润。数值以每只动物(未经任何制剂处理)体内可控伤口的百分比表示，并以平均值+/-sem表示。*＝p<0.05vsct，数值具有统计学意义。
27.图7：根据背部区域的活组织检查，对皮肤伤口愈合的啮齿动物模型(褐家鼠)进行系统性生化分析，每2天包含2x gmc-l的制剂或不包含gmc的制剂(ct)进行局部治疗。第4天，在其安乐死后，测定血浆a)肌酐b)、天冬氨酸转氨酶(ast)和wrcrp(广谱c反应蛋白)。d)在外周血单个核细胞(pbmc)中，通过rt-qpcr检测全身炎症标记的白细胞介素1-β(il-l-β)表达的mrna表达倍数变化。
28.数值表示方式为平均值+/-sem。
29.发明的详细说明
30.石墨烯原料
31.在本发明中，术语“石墨烯”是指形成具有多个碳原子彼此共价键合的多环芳烃分子的材料。共价键合的碳原子形成一个作为重复单元的六元环。
32.术语“石墨烯纳米纤维”(gnfs)是指具有石墨烯层的圆柱形纳米结构，石墨烯层排列为堆叠的圆锥体、杯或板。石墨烯平面从纤维轴倾斜，暴露出碳纳米纤维内外表面的平面边缘。
33.术语“石墨烯纳米管”(gnts)是指单壁或多壁同心的石墨烯圆柱体，其中与石墨烯纳米纤维相比，这些圆柱体的基面形成的反应性较小的面，因为它们是圆柱形的，像管子一样中空的，但石墨烯纳米纤维像是棒状的，通常内部没有空隙。
34.本发明的产品是衍生自gnf的碳基纳米材料，其经过一系列纯化和处理以获得具有意想不到的生物特性的医用级材料。
35.起始的碳纳米材料是一种石墨烯基材料(石墨烯纳米纤维)。在一个实施例中，用于制备本发明产品的石墨烯纳米纤维粒径分布的粒子数dn(90)为4.0μm或更小，粒子体积dv(90)为105.00μm或更小。优选地，它们具有约250-400m2/g的表面积。
36.用于获得本发明产品的原料可通过多种方法合成，例如在碳化硅上外延生长、化学气相沉积、石墨的微机械或机械剥离、石墨的化学氧化、使用热还原、化学还原或多步还原方法还原氧化石墨，碳氢化合物在金属催化剂上的催化分解、展开碳纳米管、静电纺丝等。
37.在碳化硅(silicon carbide)上外延生长是一种从在单晶硅碳化硅晶体(sic)上合成的石墨烯分离单层的方法。该方法包括将sic晶片加热到高温(>1100℃)和高度真空。在上述条件下，硅原子升华以获得石墨烯表面的外延生长(碳原子重新排列形成石墨烯)[sutter，p.，外延石墨烯：硅是如何消失的。《自然材料》，2009年。8(3)：第171-172页。]
[0038]
在化学气相分解法中，碳源在催化底物上催化衰变。在碳氢化合物热分解后，催化表面使金属内部产生的碳原子溶解。[jacobberger，r.m.，et ah，通过化学气相沉积合成简单石墨烯.化学教育杂志，2015。92(11)：p.1903-1907，lavin lopez，m.p.等人，《多晶镍上沉积石墨烯的厚度控制》.新化学杂志，2015。39(6)：第4414-4423页]
[0039]
石墨的微机械剥离是指利用固体表面物体或胶带，通过细刮的方法将所述固体的最外层分离成薄片[《自然材料》，2007年.6(3)：第183-191页]机械剥离可以通过超声波将在有机溶剂或水溶剂中形成的悬浮状石墨分离薄片。由此获得材料具有高质量，但是，由于其产量低且生产成本高，因此不具有很大的工业价值[lotya，m.等人，通过在表面活性剂/水溶液中剥离石墨来液相生产石墨烯.美国化学学会杂志，2009,131(10)：第3611-3620页]很多方法都可用于合成石墨烯纳米纤维(gnfs)，尤其优选地，可用于制备本发明的产品。例如，用于碳纳米纤维的化学气相沉积方法是一种催化方法，其中碳源在催化剂存在(的条件)下分解，以生长gnfs。过渡金属催化粒子，如铁、镍、钴和铜可用作催化剂。cvd工艺在500至1200℃的温度范围内进行[martin gullon，l等人，在浮动催化剂反应器中使用fe和ni催化剂生产的碳纳米纤维之间的差异]。碳，2006年。44(8)：第1572-1580页]。静电纺丝是产生gnfs的另一种方法。在这个方法中，溶胶-凝胶过程(sol-gel)是通过一个针尖的细针。由此，向针的下落(方向)施加高电压，引起溶液朝目标方向从针中流出。当溶液的表面张力足够高时，为避免细小的液滴进入其中，可以提取出纤维结构并将其收集在物镜中[zhang，l.，等，综述：电纺聚丙烯腈的碳纳米纤维及其应用.材料科学杂志，2014。49(2)：第463-480
页]
[0040]
通过透射电子显微镜(tem)测量用于制备本发明复合材料的多孔石墨材料的平均直径和长度。
[0041]
纯化和处理
[0042]
按照上述方法合成的石墨烯纳米材料用作合成本发明石墨烯基医用级材料的原料。
[0043]
然后石墨烯纳米材料原料采用纯化工艺，优选使用强酸(h2s04、hc1、hf、hno3、hbr等)去除在合成过程中引入到石墨烯纳米材料结构中的任何金属或杂质。可以使用任何能够去除杂质而不影响石墨烯材料性能的工艺。在酸类中，特别优地选用盐酸或氢氟酸，但是技术人员将根据存在的杂质数量和类型来选择酸和条件。净化过程优选在低温(20-50℃)下进行数小时(12-24小时)。如果使用溶液进行纯化过程，则可随后用millipore水将纯化后的石墨烯纳米材料洗涤至中性ph，然后干燥，例如真空干燥。
[0044]
纯化后的石墨烯纳米材料也经过处理，以实现粒径分布的减小，这使得该产品适用于医疗和化妆品用途。纯化的石墨烯纳米材料例如经受减小其尺寸和修改其性质的过程。在一个实施例中，剥离过程在室温下进行，例如采用超声波、湿磨或混合工艺。超声波处理由于工艺简单而特别受青睐，这个过程还可以另外通过样品进行监测，以检查其粒径分布是否达到所需要求。之后，进行可选的定界工艺，将粒径控制在10-100μm之间。本领域技术人员可以无困难地对选择粒度分布所需的技术进行判定。例如，该步骤可通过过滤或离心、优选真空过滤(例如通过烧结玻璃过滤器)来实现。所述定界步骤对引导获得dn(90)为0.60μm或更小的粒子数，以及dv(90)为80.00μm或更小的粒子体积(的过程)是有利的。
[0045]
最后，为了控制等级材料不夹带其他有毒化合物，包括细菌污染或内毒素，并且，为了保持无菌和无菌条件，还可以通过加热对材料实施标准化脱热原过程，优选在200-500℃的温度下加热10-60分钟。
[0046]
由此产生的粒径分布可通过该技术领域的常用手段来确定，如粒径分析仪，例如示例中使用的malvern pananalytical公司的mastersizer 2000。
[0047]
因此，本发明的另一个目的是一种利用石墨烯纳米纤维原料制备本发明产品的方法，包括以下步骤：
[0048]
a)纯化石墨烯原料，优选使用强酸，以去除石墨烯原料中存在的任何金属或杂质，
[0049]
b)缩小纯化石墨烯纳米材料的粒径，优选通过剥离工艺，将dn(90)减小至0.60μm或更小粒子数，以及将粒子体积dv(90)减少至80.00μm或更小体积，如通过激光衍射粒子分析仪测量。
[0050]
c)可选地，可对所获得的产品进行脱热源处理。
[0051]
步骤(b)可进一步包括在步骤(c)之前根据粒子大小来定界粒子的步骤。在一个实施例中，定界步骤通过过滤或离心、优选真空过滤来实现。
[0052]
在本发明的上下文中，可通过以下步骤(b)获得粒径分布，所述粒径分布的dn(90)为0.60μm或更小粒子数量，体积数dv(90)为80.00μm或更小粒子体积，可选地，所述步骤包括进一步定界步骤，优选地，选择过滤步骤。优选地，所述过滤是使用孔径在1μm到20μm之间、优选4μm到20μm之间、更优选5μm到16μm之间的烧结玻璃过滤器的真空过滤。
[0053]
产品
[0054]
本发明的产品是纯化石墨烯纳米材料，其粒径分布为其dn(90)约为0.60μm或粒子数量更小，和dv(90)为80.00μm或更小体积，优选地，体积为70.00μm或更小。粒度分布用激光衍射粒度分析仪测量。粒径分布d50是累积分布中粒径为50％时的数值。如果d50有一个特定的值，那么样品中50％的粒子大于这个值，50％的粒子小于这个值。粒径分布是指落入不同粒径范围内的粒子数，以所需样品中所有粒径总数的百分比表示。描述粒径分布最常用的方法是d值(d10、d50和d90)，分别以累积质量的10％、50％和90％进行划分。
[0055]
这些值可以认为是材料的直径，当粒子的质量以递增的方式排列时，这些值将样品质量分成特定的百分比。d10是指，样本质量的10％是由直径小于此数值的粒子组成的。d50是指，当样本质量的50％小于此值、50％大于此值时的直径。d90是指，样本质量的90％是由直径小于此数值的粒子组成的。这些值可应用于粒子数(dn)和粒子体积(dv)。
[0056]
粒子数上具有dn(90)的分布，是指粒径分布，直至和包括，样品内包含所有材料数量的90％的值。
[0057]
粒子体积分布的dv(90)是指，粒径分布中的点，直到和包括，样品内包含所有材料体积的90％的值。
[0058]
使用malvern panalytical的mastersizer 3000测量本发明产品的粒径分布。在本发明的上下文中，术语“比表面积(ssa)”是指每单位质量的材料所占的总表面积。
[0059]
本申请中描述的孔隙率和比表面积特性是使用brunauer-emmet-teller(“bet”)法测量的，该方法应用于使用氮作为吸附材料的物理吸附技术中，这是本领域技术人员所熟知的。
[0060]
在本发明的一个实施例中，本发明产品的bet表面积在300-350m2/g之间。
[0061]
在另一实施例中，本发明产品的孔隙体积在0.35-0.40cm3/g之间。
[0062]
在优选实施例中，本发明产品具有300-350m2/g之间的bet表面积和0.35-0.40cm3/g之间的孔隙体积。
[0063]
本发明产品以石墨烯纳米纤维的形式出现。
[0064]
组合物
[0065]
在另一方面，本发明涉及包含本发明石墨烯产品和一种或多种医药上可接受的赋形剂药物组合物。
[0066]
本文所用的“药物组合物”涉及生理上可耐受的组合物和分子实体，并且当其施用于人或动物时通常不会产生过敏反应或与胃紊乱、头晕等状况类似的不良反应。优选地，术语“医药上可接受的”意指其经州或联邦政府的管理机构批准和/或包括在欧洲-美国药典和/或其他一般公认的用于动物、尤其是用于人类的药典中。
[0067]
术语“赋形剂”是指与活性成分一起使用的溶媒、稀释剂或佐剂。此类药用赋形剂可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物油、植物油或混合来源的液体，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油和类似物。
[0068]
在优选实施例中，本发明的药物组合物适用于皮肤的局部施用，例如乳膏、乳液、软膏、微乳剂、脂肪软膏、凝胶、乳状凝胶、糊剂、泡沫、酊剂、溶液、贴片、绷带和经皮给药系统。最优选的是乳霜或乳液凝胶。
[0069]
乳霜或乳液是水包油乳液。可使用的油基为脂肪醇，尤其是含有12到18个碳原子的脂肪醇，例如月桂醇、十六烷基或硬脂醇、脂肪酸，尤其是含有10到18个碳原子的脂肪酸，
例如棕榈酸或硬脂酸、脂肪酸酯，例如三丙戊酸甘油酯(中性油)或棕榈酸十六烷基酯，液体固体蜡，例如肉豆蔻酸异丙酯、羊毛蜡或蜂蜡和/或碳氢化合物，尤其是液体、半固体或固体物质或者其混合物，例如矿油(凡士林矿酯、凡士林)或石蜡油。合适的乳化剂是具有显著亲水性的表面活性物质，例如相应的非离子乳化剂，例如多元醇的脂肪酸酯和/或其环氧乙烷加合物，尤其是与(聚)乙二醇、(聚)丙二醇或山梨醇酯化的对应的脂肪酸酯，其中脂肪酸基团，尤其是含有10到18个碳原子的基团，尤其是聚羟基乙烯山梨醇(所对应)的部分甘油脂肪酸酯或部分脂肪酸酯，例如聚甘油脂肪酸酯或聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(tweens)，以及聚氧乙烯脂肪醇醚或脂肪酸酯，特别是含有12到18个碳原子的脂肪醇部分以及包含10到18个碳原子的脂肪酸部分，例如聚羟基乙烯甘油脂肪酸酯(例如tagat s)，或相应的离子乳化剂，例如脂肪醇硫酸盐的碱金属盐，尤其是在脂肪醇部分中具有12到18个碳原子的，例如十二烷基硫酸钠、十六烷基硫酸钠或硬脂基硫酸钠，它们通常在脂肪醇(例如十六烷基醇或硬脂醇)存在(的条件)下使用。水相的添加剂，尤其是防止乳膏干燥的其他试剂，例如保湿剂，例如多元醇，例如甘油、山梨醇、丙二醇和/或聚乙二醇，以及防腐剂、香水、凝胶剂等。
[0070]
软膏是油包水乳液，其含量高达70％，但优选地含有约20％至约50％的水或水相。碳氢化合物是尤其适合作为脂肪相的，例如凡士林、石蜡油和/或硬石蜡，为了提高水结合能力，其优选地含有适合的羟基化合物，例如脂肪醇或其酯，例如十六醇或羊毛蜡醇，或羊毛蜡或蜂蜡。乳化剂作为相应地亲脂性物质，例如如上所示的类型，例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯(spans)，例如山梨糖醇油酸酯和/或山梨糖醇异硬脂酸酯。水相的添加剂，除保湿剂外，如多元醇，例如甘油、丙二醇、山梨醇和/或聚乙二醇，以及防腐剂、香料等。
[0071]
微乳剂是基于以下四种组分的各向同性的体系：水、表面活性剂(例如张力活性剂)、脂质(例如非极性或极性油(例如石蜡油)、天然油(例如橄榄油或玉米油)和含有亲脂基团的醇或多元醇(例如2-辛基十二醇或乙氧基化甘油)或聚甘油酯。如果需要，可以向微乳液中添加其他添加剂。微乳剂具有粒径小于200nm的胶束或微粒，为透明或半透明体系，自发形成，性质稳定。脂肪软膏不含水分，含有碱基，特别是碳氢化合物，例如石蜡、凡士林和/或液体石蜡，也包括天然或部分合成的脂肪，如甘油脂肪酸酯，例如椰子脂肪酸甘油三酯，或者，优选硬化油，例如氢化花生油，蓖麻油或蜡，也可以是甘油的脂肪酸部分酯，例如单硬脂酸甘油酯和双硬脂酸甘油酯，还可以是增加吸水能力的脂肪醇，乳化剂和/或与软膏有关的添加剂。
[0072]
在凝胶方面，将凝胶分为水合凝胶、无水凝胶以及低水凝胶，这些凝胶包含可膨胀的凝胶化物质。尤其是基于无机或有机大分子的透明水凝胶。具有凝胶化特性的高分子量的无机组分主要是含水硅酸盐，例如硅酸铝(例如膨润土)、硅酸镁(如veegum)或胶体硅酸(如aerosil)。作为高分子量的有机物质，有天然的、半合成的或合成的大分子。例如，天然和半合成聚合物衍生自含有多种碳水化合物成分的多糖，例如纤维素、淀粉、黄芩胶(tragacanth)、阿拉伯树胶和琼脂，以及明胶、海藻酸及其盐(例如海藻酸钠)及其衍生物，如低级烷基纤维素(例如甲基或乙基纤维素)、羧基或羟基低级烷基纤维素(例如羧甲基或羟乙基纤维素)。形成凝胶的大分子组分，例如，可以是适当取代的不饱和脂肪族化合物，如乙烯醇、乙烯基吡咯烷、丙烯酸或甲基丙烯酸。
[0073]
乳状凝胶-也称为“乳胶剂
”-
代表了一种结合了凝胶和水包油乳液特性的局部成分。与凝胶不同的是，它们含有脂质相，由于其脂肪塑形性，使得此制剂能够(配合)按摩使
用，同时，其可以直接吸收到皮肤中的特性也是一种令人满意的体验。此外，还可以观察到亲脂性活性成分的溶解度增加。与水包油乳液相比，乳状凝胶的一个优点在于增强了降温效果，这是由于其额外的酒精成分(如果存在)的蒸发而产生的冰凉感所造成的。
[0074]
例如，泡沫是从加压容器中注入的，并且是气溶胶形式的液态水包油乳液；未取代的碳氢化合物，例如烷烃，例如丙烷和/或丁烷，被用作推进剂。作为油相，尤其使用碳氢化合物，例如石蜡油、脂肪醇，例如十六醇、脂肪酸酯，例如肉豆蔻酸异丙酯和/或其他蜡。作为乳化剂，除其他外，使用具有主要亲水性的乳化剂的混合物，例如聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(tweens)和具有主要亲脂性特性的乳化剂的混合物，例如山梨醇酐脂肪酸酯(spans)。此外还添加了常用的添加剂，如防腐剂等。酊剂和溶液通常具有乙醇基，其中可添加水，并且除其他外，添加多元醇，例如甘油、二醇和/或聚乙二醇，作为减少蒸发的保湿剂，和脂肪恢复物质，例如具有低分子量聚乙二醇的脂肪酸酯，丙二醇或甘油，即可溶于水混合物中的亲脂性物质，作为乙醇从皮肤上去除的脂肪物质的替代物，必要时还可添加其他辅料和添加剂。适当的酊剂或溶液也可通过适当的装置以喷雾形式施用。
[0075]
具有本发明记载的石墨烯产品的、可局部递送的透皮递送系统包含有效量的石墨烯产品，可选地，其与载体一起使用。可使用的载体包括可吸收的药理学适宜的溶剂，以帮助活性成分通过皮肤。例如，透皮递送系统为贴片形式，包括(a)基质(＝背衬层或薄膜)，(b)含有活性成分的基质，可选载体和可选(但优选地)用于将系统附着到皮肤的特殊粘合剂，以及通常(c)保护片(＝释放衬垫)。基质(b)通常以所有成分的混合物形式存在，或可能由单独的层组成。
[0076]
包含本发明所述的石墨烯产品的膜和基质也适用于局部使用，无论是单独使用，还是作为更复杂产品(如伤口敷料、绷带等)的一部分使用(均可)。此类膜或基质的实例可为天然聚合物，例如多糖(藻酸盐、几丁质、壳聚糖、肝素、软骨素、卡拉胶)、蛋白聚糖和蛋白质(胶原蛋白、明胶、纤维蛋白、角蛋白、丝素蛋白、蛋壳膜)；基于聚乙醇酸、聚乳酸、聚丙烯酸、聚-ε-己内酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇等的水凝胶或仿生细胞外基质微/纳米纤维等合成聚合物。
[0077]
所有这些体系都是本领域技术人员所熟知的。可局部施用的药物制剂的制造可以本身已知的方式实现，例如通过将本发明的石墨烯产品悬浮在基底中或(如有必要)悬浮在其一部分中。
[0078]
依据本发明记载的组合物还可包含用于皮肤科应用的常规添加剂和佐剂，例如防腐剂，尤其是对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯或季铵化合物，如苯扎氯铵，或咪唑烷基脲等甲醛供体，或苯甲醇、苯氧乙醇等醇或苯甲酸、山梨酸等酸；用作ph缓冲赋形剂的酸或碱；抗氧化剂，特别是对苯二酚、生育酚及其衍生物等酚类抗氧化剂，以及黄酮类化合物，或其它抗氧化剂，如抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯；香料；填料，如高岭土或淀粉；色素或着色剂；紫外线屏蔽剂；保湿剂，尤其是甘油、丁烯二醇、己二醇、尿素、透明质酸或其衍生物；抗自由基剂，如维生素e或其衍生物；渗透性促进剂，特别是丙二醇；乙醇；异丙醇；二甲亚砜；n-甲基-2-吡咯烷酮；脂肪酸/醇，如油酸、油酸醇；萜烯，如柠檬烯、薄荷醇、1-8桉叶脑；烷基酯，如乙酸乙酯、乙酸丁酯；离子配对剂，如水杨酸。
[0079]
更多有关适合外用制剂的详细信息可参见于标准教科书，如雷明顿《药学科学与
实践》第22版(2012年)。
[0080]
制剂中，本发明中石墨烯纳米材料产品的含量可在0.01％至10％w/w、优选0.01％至5％w/w、更优选地在0.1％至3％w/w的范围内。
[0081]
有益效果和用途
[0082]
如下面的实例所证明，本发明所涉及的产品是无毒的，局部使用时也是无毒的并且具有良好的生物相容性。
[0083]
此外，本发明所涉及的产品在皮肤修复和伤口愈合方面显示出的效果也是令人惊喜的，如实例中所示。
[0084]
因此，本发明的石墨烯产品及其组合物可用作治疗中的药物。
[0085]
术语“治疗”或“治疗性”是指，治疗或预防人类、动物的疾病以及恢复、纠正或改造人类、动物的生理功能。
[0086]
许多疾病都可能损害皮肤的完整性和真皮层的功能，如糖尿病、创伤、炎症性疾病、代谢异常、出血性疾病、自身免疫性疾病如牛皮癣等。因此，无论病原体的性质如何，促进皮损愈合都是至关重要的(环节)。皮肤损伤后，伤口的愈合是通过不同类型的细胞(如角质形成细胞或成纤维细胞)向伤口边缘增殖和定向迁移，形成新的上皮细胞所驱动的。[班纳特.奈特.阿，美国外科学杂志1993；166:74-81；；王.vw.阿，生物医学生物技术杂志。2011:969618.]
[0087]
本发明的石墨烯产品已证明对大鼠模型中的伤口的修复是有效的，并且就全身情况而言，其对体内的肾、肝或炎症的标记物是无害的。因此，它可用于治疗导致皮肤完整性遭到破坏的任何情况，例如伤口、疤痕、烧伤、溃疡、牛皮癣、割伤或其他哺乳动物皮肤创伤。这种损害可能由广泛的事件引起和/或可能与其他疾病有关。
[0088]
需要治疗的损伤包括切口、裂伤、擦伤、水泡、血肿、穿刺、穿透、电、照射、化学、创伤、挤压、咬伤、烧伤、冻伤、手术、原发性癌症或转移、良性肿瘤、痤疮、感染，如细菌感染(可合并真菌或病毒性寄生虫感染)、与血液循环减少有关的病变，如与静脉功能不全或动脉功能不全有关的腿部溃疡和足部溃疡、褥疮、压疮或褥疮，与糖尿病或银屑病相关的病变。
[0089]
施用方式
[0090]
本方法中使用的组合物优选局部施用。
[0091]
包含本发明所述的石墨烯产品的局部制剂的每日剂量可取决于各种因素，例如性别、年龄、体重和患者的个体状况。
实施例
[0092]
实施例1：
[0093]
gmc-1制备及理化表征
[0094]
原料
[0095]
可用于制备本发明石墨烯纳米材料的原料的结构特征、石墨化程度以及主要理化性质和热力性质将在下表1中体现。
[0096]
表1:gnfs原料的理化性质
[0097][0098]
a
晶体中的石墨烯面数(npg＝lc/d)；
[0099]
d是薄层交替范围；lc是样品中晶体在垂直于石墨烯基面方向上的平均尺寸
[0100]
b i
d
/i
g
:拉曼光谱中d带和 g带强度之间的商。
[0101]
在本实施例中，使用石墨烯纳米纤维(gnfs)来制备本发明所述的材料。
[0102]
所述石墨烯基碳纳米材料(gnfs)经过使用hf的纯化过程去除在合成过程中引入到gnf结构中的金属和杂质。净化过程在低温(20-50℃)下进行数小时(12-24小时)。之后，将纯化的碳纳米材料真空干燥并用millipore(密理博)水洗涤至中性ph。
[0103]
纯化后的gnfs在室温下与具有水或其他溶剂的溶液中进行数小时(2-5小时)的剥离过程。最后，对材料加热(200-500℃，10-60分钟)以进行标准化脱气流程。
[0104]
所得产物(gmc-1)的特性如下：
[0105]
gmc-1的元素分析
[0106]
gmc-1和原料的主要差异可在其元素分析中观察到(表2)。与原料gnfs相比，gmc-1仅由碳和氧组成。毒理学实验证实，它不含任何可能危害人体健康的杂质。
[0107]
表2：原料cnfs和gmc-1的元素分析
[0108][0109]
gmc-1的拉曼光谱
[0110]
gmc-1的拉曼光谱可通过512nm激光获得。它显示了(图1)炭材料的特征峰。d峰：1332cm-1
，g峰：1580cm-1
。g带对应于碳原子网络，即理想状态下的石墨结构，而d带(所呈现的特征)是由于基面和边缘部分的存在。石墨烯纳米纤维的d带强度比g带大。如果石墨材料中含有大量的边缘部分，就会出现一个大的d峰，就像这些纳米纤维一样。d峰和g峰的带宽都不算太大，这也特征说明了纳米纤维的结晶性。
[0111]
gmc-1吸附-解吸氮分析
[0112]
通过气体物理吸附法测量固体总表面积的原理是检测覆盖固体表面所需的气体分子数量。一旦知道了分子所占的面积，固体的表面积就可以通过体积法或重量法(brunauer、emmett和teller)，根据吸收的气体分子的数量来估算。
[0113]
总比表面积由多点bet方程计算，假设孔隙中随后填充了液体吸附质，则总空隙体积由相对压力p/p0＝0.99下吸附的水蒸气量确定。平均孔径，假设其为圆柱形，在假设当相对压力小于1时，未被填充的孔隙对孔隙样品的体积和比表面积来说无影响，可根据总孔隙体积值和比表面积来估算。
[0114]
采用quantachrom模型quadrasorb-si模型，在77k下通过n2的吸附-解吸进行比表面积、孔隙体积和孔隙面积的分析，该模型具有六个脱气口和三个分析口，由软件(quadra-win)进行控制，该软件收集每体积n2的相对压力值。图2显示了gmc-1的表面积、孔隙体积和孔径。
[0115]
bet表面积：300-350m2/g
[0116]
孔隙体积：0,35-0,4cm3/g
[0117]
孔径：5-6nm
[0118]
gmc-1的x射线衍射分析
[0119]
对gnfs样品进行x射线检测的衍射图(图3a)。
[0120]
据观察，它在25.9
°
附近出现一个峰值，其对应于石墨烯平面002之间的距离，或石墨烯片之间的距离。在高结晶石墨中，其层间间距为0.334nm。在这种情况下，纳米纤维的距离略大，为0.343nm，这表明它们具有短程结晶性，并且呈现出涡轮层状特性。在垂直于平面002(lc)的方向上的晶体尺寸为4.64nm，(同样可以)表明上述事实。
[0121]
图3b表示本发明所述的材料样品gmc-1对应的衍射图。gnfs和gmc-1呈现出的峰相同，但是在gmc-1中，这些峰呈现出较低的2θ值。
[0122]
表3显示了gnfs和gmc-1的特征晶体学参数：
[0123]
层间空间(d002)
[0124]
晶体堆积高度(lc)
[0125]
平面内晶粒尺寸(la)
[0126]
晶体中石墨烯层数(npg)
[0127][0128]
其中：
[0129]
λ，辐射波长(2＝015404nm)
[0130]
θ1，衍射峰位(
°
)
[0131]
θ2，衍射峰位(
°
)
[0132]
k1，形状系数(k＝0,9)
[0133]
k2，沃伦形状系数常数(k＝l，84)
[0134]
fwhm，对应衍射峰的半高宽度(rad)
[0135]
表3:gnfs和gmc-1的x射线衍射参数
[0136][0137]
当gnfs转变为gmc-1时，材料的晶体结构发生变化。通过这种方式，在gmc-1中观察到，由于材料经过纯化、清洁和剥离过程，晶体堆叠高度(lc)、面内微晶尺寸(la)和晶体中石墨烯层的数量(nc)降低。gmc-1中的层间空间由于针对材料的剥离过程而增大。实验a的晶体堆积高度(lc)和面内晶粒尺寸(la)由于提纯和剥离过程而减小。
[0138]
粒径分布
[0139]
使用malvern panalytical的mastersizer 3000测量原料gnfs和本发明所述的产品gmc-1的粒度分布。mastersizer 3000使用激光衍射技术来测量粒子的大小。它通过测量激光束穿过分散颗粒样品时的散射光强度来实现。然后对这些数据进行分析，以计算产生散射图的粒子大小。
[0140]
图4a显示了gnfs和gmc-1的粒径分布(以粒子数计)的比较。
[0141]
图4b显示了根据gnfs和gmc-1的粒子体积百分比对粒子尺寸分布的比较。
[0142]
在图中可以观察到参数d(0.1)、d(0.5)和d(0.9)，dn是指粒子数，dv是指粒子体积。
[0143]
对于gnfs，dn(10)参数表示10％的粒子数的大小为1.121μm或更小，dn(50)参数表示50％的粒子数的大小为1.573μm或更小，dn(90)参数表示90％的粒子数的大小为3.909μm或更小。对于gnfs，dv(10)参数意味着样品体积的10％为尺寸为19.764μm或更小的粒子，dv(50)参数表示样品体积的50％为57.711μm或更小的粒子，dv(90)参数表示样品体积的90％为尺寸为103.114μm或更小的粒子。
[0144]
在gmc-1的情况下，dn(l0)参数表示10％的粒子数的大小为0.313μm或更小，dn
(50)参数表示50％的粒子数的大小为0.394μm或更小，dn(90)参数表示90％的粒子数的大小0.577μm或更小。对于gmc-1，dv(l0)参数表示样品体积的10％被粒径为10.549μm或更小的粒子占据，dv(50)参数表示样品体积的50％被粒径为39.699μm或更小的粒子占据，dv(90)参数表示样品体积的90％被粒径为尺寸为69.576μm或更小粒子占据。
[0145]
对gnfs和gmc-1的粒径分布在数量和体积上的对比表明，gmc-1的粒径分布较低。综上所述，gnfs粒子数的dn(90)的大小为3,909μm或更小，粒子体积dv(90)为103,114μm或更小，而gmc-1粒子数的dn(90)为0.577μm或更小，粒子体积的dv(90)为69.576μm或更小。图4a和4b清楚地显示了与所用原材料(gnfs)相比，gmc-1中粒子数量和体积的减少。
[0146]
生物活性
[0147]
统计
[0148]
图中数据表示为不同次数实验的平均值
±
sem。对2个样本进行student's t检验，对>2个样本进行单因素或双因素方差分析(anova)，采用配对或非配对设计，然后进行多重比较测试。p<0.05的值具有统计学意义。
[0149]
实施例2:hep-g2细胞系毒性试验
[0150]
我们用gmc-1在培养细胞(肝细胞系hep-g2)上进行了药理学和毒理学研究。
[0151]
在6孔培养皿中，每孔培养300,000个细胞，并用添加10％胎牛血清的培养基(默认情况下，dmem)培养。细胞在37℃、5％co2和湿度条件下的受控培养箱中培养。到达细胞汇合点后，将血清移除16小时。将产品以悬浮液的形式加入，在维持相同的控制条件下，以不同的浓度保持相同的最终体积24小时。随后，对细胞进行处理，并通过上述iso中指出的两项试验对细胞的活力/毒性进行补充试验：
[0152]
a)台盼蓝染色排除法，区分活/死细胞，以及
[0153]
b)mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑)细胞染色法测定代谢活性。
[0154]
结果如图5所示。结果表明，gmc-1对体外培养的hep-g2细胞无毒。
[0155]
实施例3：动物模型的伤口愈合
[0156]
皮肤伤口愈合是一个常见的再生过程，它可以关闭伤口和重建上皮屏障和底层结缔组织。
[0157]
许多因素和系统条件是损害皮肤功能的致病源。皮肤损伤后，必须形成新的上皮细胞才能使伤口愈合。
[0158]
伤口愈合包括细胞迁移、增殖、分化和细胞外基质的形成。慢性伤口，如静脉性、糖尿病足或压疮，其特征是愈合过程尚未完全彻底，包括细菌定植和/或感染增加，它们是由其他疾病引起的，如糖尿病、创伤、炎症疾病、代谢异常、出血紊乱、吸烟、免疫抑制和营养不良、肥胖。
[0159]
我们在啮齿动物伤口愈合模型中进行了皮肤再生实验。以明胶为主要赋形剂成分的水凝胶作为gmc-1的制剂的基底[x.j.yang，等人，polym.int44(1997)448-452]
[0160]
所用动物模型为褐家鼠，雄性或雌性，3-8个月大，实验开始时体重在300-500之间，n＝18)。将大鼠分为2组，分别用含有该产品的制剂或不含该产品的相同制剂进行治疗。用异氟醚麻醉动物，刮除其背部皮肤。在用70％乙醇消毒后，用4毫米直径的皮肤活检冲头在背部皮肤上造成5个厚的伤口。其中4个伤口用含有或不含有gmc-1(对照组)的制剂为基
底的贴片进行治疗。第5组不进行贴片，作为愈合情况的对照。制剂每两天使用一次。伤口愈合情况通过平面测量法进行监测，在受伤后0-2天和4天使用数码相机(powershot-prol，canon)拍摄每个伤口的照片。分析伤口面积(nih，jimage)。每个时间点的伤口闭合率由以下公式得出：(l-[当前伤口大小/初始伤口大小])x l00。该值是与第5次活检愈合值(动物的内部对照)相比的百分比。
[0161]
第4天将动物安乐死，切除创面的愈合部位，用10％中性甲醛固定24h，石蜡包埋。三个μm厚度的切片在二甲苯中脱蜡，并通过连续浸泡在浓度递减的乙醇中进行再水化，取得组织病理学诊断(再上皮化、胶原化和急性炎症浸润)。根据上述组织病理学分析确定的个体得分对每个伤口的上皮化进行评分。
[0162]
结果如图6所示。局部使用gmc-1可在体内形成再生真皮。
[0163]
安乐死后，将血浆和外周血单个核细胞(血液中循环的主要白细胞群)进行保存和研究。血浆的生化特性(在这个过程中)被获得，以及可以研究不同的肾、肝和炎症标记物(肌酐、转氨酶和广泛的c-反应蛋白)。用pbmcs检测促炎标志物白细胞介素l-β的表达。用逆转录定量聚合酶链反应(rt-qpcr)来检测这种表达的变化。用商用基因表达分析法(taqman，life technologies)扩增从不同样本中提取的100ng由mrna转化的dna(cdna)。通过分子内标(β-肌动蛋白)来使上述数值标准化，然后使用方法2^deltadeltact执行表达过程中的折叠变化。
[0164]
结果如图7所示。局部施加gmc-1于皮肤损伤部位，并且就全身情况而言，其对体内的肾、肝或炎症的标记物是无害的。