一种菌根菌剂及其制备方法与流程

1.本发明涉及菌根菌剂技术领域，具体涉及一种菌根菌剂及其制备方法。


背景技术：

2.菌根菌作为植物根系与真菌形成的共生体，对植物的促生作用产生显著影响。从多方面影响着植物的生长发育：(1)提高宿主植物对多种矿质养分的吸收，菌根真菌能显著促进植物对土壤中营养物质的吸收、提高植物抗病虫害的能力；(2)提高植物移栽成活率；(3)促进植物生长、提高产量并且改善品质，从而在一定程度上增加经济效益；(4)增强植物对逆境的抗性。因此，菌根真菌对玉米、大豆等植物的营养吸收和生长发育有重要的生理作用。
3.菌根菌剂可适用于各种类型的土壤，实用性非常广泛，一般讲，凡是有植物生长的土地都可以施用微生物菌肥来进行改良土壤和减少化学肥料的使用而促进作物的生长。菌肥中的菌体在代谢过程中能够产生多种生长素，可以有效调节植物体内养分的运转，有利于土壤中n、p等矿物质的吸收，促进植物生根、生长、和发育。发达的根系有利于提高抗性，提高作物成活率。所以利用微生物菌肥有利于提高农作物的养份吸收效率，进一步提高农作物的品质。
4.本发明提供了一种菌根菌剂，能够解决传统化化肥利用率低；大量使用使蔬菜瓜果品质大大下降、在重金属污染环境下存活率低等问题，本发明的菌根菌剂制备简单、方便使用、肥效高。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中存在的不足，本发明提供了一种菌根菌剂及其制备方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
7.一种菌根菌剂的制备方法，其特征在于，由以下步骤组成：
8.s1、菌种扩繁：将8
‑
12重量份蒸馏水、10
‑
30重量份麸皮、2
‑
8重量份钼酸铵、1
‑
3重量份三聚磷酸钠、1
‑
5重量份葡萄糖混合均匀，于110
‑
125℃下灭菌25
‑
40min，冷却得到扩繁培养基，接种菌种与苏丹草种子，在温度为28
‑
35℃植物组培瓶中无菌培养3
‑
5周，取根部及培养基质作为扩繁菌种；
9.s2、制备：将扩繁菌种加入到固体培养基中混合均匀，所述扩繁菌种的加入量为固体培养基的10
‑
30wt％，播种苏丹草种子，所述苏丹草种子含量为固体培养基的1
‑
5wt％，拌匀，出苗后，继续培养2
‑
3月，把苏丹草的地上部分剪去，剪碎根段，与培养基质混匀，干燥粉碎制剂，即得菌根菌剂。
10.所述s1中的菌种为丛枝菌根，优选的，所述丛枝菌根为摩西球囊霉。
11.所述s1中的菌种接种量为液体培养基质量的0.2
‑
1.5wt％，所述苏丹草种子为液体培养基质量的1
‑
5wt％。
12.所述步骤s2中所述固体培养基的制备方法为：所述步骤s2中所述固体培养基的制
备方法为：将40
‑
80重量份蒸馏水、200
‑
400重量份麸皮、30
‑
50重量份活化蛭石粉、30
‑
50重量份珍珠岩颗粒、30
‑
60重量份钼酸铵、10
‑
30重量份三聚磷酸钠、2
‑
5重量份葡萄糖混合均匀，在室温下搅拌3
‑
10min，得到固体培养基。
13.优选的，所述步骤s2中所述固体培养基的制备方法为：将40
‑
80重量份蒸馏水、200
‑
400重量份麸皮、30
‑
50重量份蛭石粉、30
‑
50重量份活化珍珠岩颗粒、30
‑
60重量份钼酸铵、10
‑
30重量份三聚磷酸钠、2
‑
5重量份葡萄糖混合均匀，在室温下搅拌3
‑
10min，得到固体培养基。
14.更优选的，所述步骤s2中所述固体培养基的制备方法为：将40
‑
80重量份蒸馏水、200
‑
400重量份麸皮、30
‑
50重量份活化蛭石粉、30
‑
50重量份活化珍珠岩颗粒、30
‑
60重量份钼酸铵、10
‑
30重量份三聚磷酸钠、2
‑
5重量份葡萄糖混合均匀，在室温下搅拌3
‑
10min，得到固体培养基。
15.本发明的构思之一是在制备固体培养基时采用活化蛭石粉，蛭石属于可膨胀性粘土，加热至500℃时，层间水分子从层间被逐出，但置于湿气中就很快地重新水化。如果温度超过700℃时，就不会再发生重新水化的现象，基面间距消失，生成物即为膨胀蛭石，同时在加热活化过程中残留在蛭石层间的葡萄糖水溶液在温度超过150℃时开始融化，温度超过500℃时即开始沸腾，在活化过程中蛭石表面或者空隙中的水蒸气会携带葡萄糖分子蒸发，使得蛭石在活化的过程中具备丰富的孔隙结构，形成蠕虫状的蓬松多孔结构，因而活化后蛭石的比表面积大大提高，有利于菌种培养过程中能够充分吸收营养物质，并促进菌种的繁殖生长。
16.所述活化蛭石粉按以下方法制备：将40
‑
60重量份蛭石粉置入温度为60
‑
80℃的旋转炒锅内恒温炒制15
‑
25min，取出，浸没于80
‑
120重量份3
‑
10wt％的葡萄糖水溶液中浸泡20
‑
40min，置于功率为120
‑
140w、频率为20
‑
50khz的超声波进行20
‑
40min超声处理，过滤，将沉淀置于马弗炉中，加热升温至700
‑
900℃保温煅烧1
‑
4h后取出，得活化蛭石粉。
17.本分发明的构思之二是在制备固体培养基时采用活化珍珠岩颗粒，本发明采用的珍珠岩具有较高的孔隙率和比较好的吸水率、性质稳定、价格低廉等优点。首先珍珠石经酸性柠檬酸水溶液超声清洗以增大其孔隙率和比表面积，再通过加入活化剂，碳酸氢钠在加热的情况可以逐渐分解，产生的二氧化碳需要从珍珠岩颗粒中溢出，能够增加珍珠岩的孔隙率；而氢氧化钠高温活化下将珍珠岩颗粒末中晶体态非活性硅铝酸盐转化成不定型态活性硅铝酸盐，利用碳酸氢钠和氢氧化钠的协同作用，使得珍珠石在焙烧过程中的水分汽化，从而形成孔隙率丰富、比表面积大的多孔结构。本发明以活化珍珠岩培养基，可以大幅度的提高细菌存活率和繁殖率。
18.所述活化珍珠岩颗粒按以下方法制备：将40
‑
60重量份珍珠岩颗粒倒入超声清洗仪中，120
‑
160重量份质量分数为10
‑
20％柠檬酸水溶液，以150
‑
220w功率、超声频率为20
‑
50khz超声洗涤1
‑
3h后移入布氏漏斗用蒸馏水抽滤洗涤20
‑
40min，将抽滤产物烘干后粉碎并过80
‑
120目标准筛，得到纯化珍珠岩颗粒；取全部的纯化珍珠岩颗粒，加入120
‑
180重量份质量分数为1
‑
5％的活化剂，浸于温度为30
‑
50℃、保温浸泡1
‑
3h，过滤，将沉淀再置于马弗炉中，加热升温至400
‑
500℃保温煅烧0.5
‑
2h后取出，得活化珍珠岩颗粒。
19.所述活化剂为碳酸氢钠和/或氢氧化钠；优选的，所述活化剂为碳酸氢钠和氢氧化钠按质量比为1：(1
‑
3)组成。
20.一种菌根菌剂，采用上述任一所述的菌根菌剂的制备方法而成。
21.本发明的有益效果：本发明提出了一种菌根菌剂。本发明的菌根菌剂对玉米的生长具有良好的促进作用，本发明采用特定方法制备的活化蛭石粉和活化珍珠岩颗粒用于制备固体培养基，不仅提供菌根菌生长所具备的丰富营养物质，还能够促进菌根的迅速繁殖，使获得的菌根菌剂性状优良，菌根在代谢过程中能分泌多种酶，来分解土壤中不溶解的矿物质和有机质，使其变为植物可以直接吸收利用的物质。在菌根的促进下，植物可以从为风化的矿物质中吸收养分，也可以从粗腐殖质、木质素和蛋白质等有机化合物中吸收所需营养物质，同时菌根在代谢过程中产生多种生长刺激素，调节植物体内养分运转，进而能够促进农作物生根、生长和发育，同时还可以提高农作物在重金属污染环境下的存活率。
具体实施方式
22.下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
23.本申请中部分原料的介绍：
24.实施例中摩西球囊霉，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为cgmccno.3012。
25.实施例中葡萄糖购于苏州华欣旭化工科技有限公司，货号：hxx
‑
001。
26.实施例中麸皮购于上海骧旭农产品贸易有限公司。
27.实施例中蛭石粉购于河北恒光矿产品有限公司，粒度：40目，sio2含量：40％。
28.实施例中珍珠岩颗粒购于石家庄瑞鸣矿产品有限公司，粒度：200目，货号：rm
‑
25。
29.实施例中钼酸铵，cas：13106
‑
76
‑
8。
30.实施例中三聚磷酸钠，cas：7758
‑
29
‑
4。
31.实施例中柠檬酸购于济宁市旭力化工有限公司，货号：001，含量：99.5％。
32.实施例中市售菌根菌剂购于四川省盛琪蔬菜种子销售有限公司，货号：59。
33.实施例1
34.一种菌根菌剂的制备方法，包括以下步骤：
35.s1、菌种扩繁：将10重量份蒸馏水、20重量份麸皮、6重量份钼酸铵、2重量份三聚磷酸钠、3重量份葡萄糖混合均匀，于121℃下灭菌30min，冷却得到扩繁培养基，接种菌种与苏丹草种子，在温度为30℃植物组培瓶中无菌培养4周，取根部及培养基质作为扩繁菌种；所述菌种接种量为液体培养基质量的1wt％，所述苏丹草种子为液体培养基质量的2wt％；
36.s2、制备：将扩繁菌种加入到固体培养基中混合均匀，所述扩繁菌种的加入量为固体培养基的20wt％，播种苏丹草种子，所述苏丹草种子含量为固体培养基的4wt％，拌匀，出苗后，继续培养2月，把苏丹草的地上部分剪去，剪碎根段，与培养基质混匀，干燥粉碎制剂，即得菌根菌剂；
37.所述固体培养基的制备方法：将60重量份蒸馏水、300重量份麸皮、40重量份蛭石粉、40重量份珍珠岩颗粒、40重量份钼酸铵、20重量份三聚磷酸钠、3重量份葡萄糖混合均匀，在室温下搅拌5min，得到固体培养基。
38.实施例2
39.与实施例1基本相同，其区别仅在于：将蛭石粉替换为活化蛭石粉；
40.所述活化蛭石粉按以下方法制备：将50重量份蛭石粉置入温度为70℃的旋转炒锅内恒温炒制20min，取出，浸没于100重量份6wt％的葡萄糖水溶液中浸泡30min，置于功率为130w、频率为25khz的超声波进行30min超声处理，过滤，将沉淀置于马弗炉中，加热升温至800℃保温煅烧2h后取出，得活化蛭石粉。
41.实施例3
42.与实施例1基本相同，其区别仅在于：将珍珠岩颗粒替换为活化珍珠岩颗粒；
43.所述活化珍珠岩颗粒按以下方法制备：将50重量份珍珠岩颗粒加入到150重量份质量分数为15％柠檬酸水溶液，以200w功率、25khz超声洗涤2h后移入布氏漏斗用蒸馏水抽滤洗涤30min，将抽滤产物烘干后粉碎并过100目筛，得到纯化珍珠岩颗粒；取全部的纯化珍珠岩颗粒，加入150重量份质量分数为3％的活化剂，浸于温度为40℃、保温浸泡2h，过滤，将沉淀再置于马弗炉中，加热升温至450℃保温煅烧1h后取出，得活化珍珠岩颗粒；
44.所述活化剂为碳酸氢钠。
45.实施例4
46.与实施例1基本相同，其区别仅在于：将蛭石粉替换为活化蛭石粉；将珍珠岩颗粒替换为活化珍珠岩颗粒；
47.所述活化蛭石粉按以下方法制备：将50重量份蛭石粉置入温度为70℃的旋转炒锅内恒温炒制20min，取出，浸没于100重量份6wt％的葡萄糖水溶液中浸泡30min，置于功率为130w、频率为25khz的超声波进行30min超声处理，过滤，将沉淀置于马弗炉中，加热升温至800℃保温煅烧2h后取出，得活化蛭石粉；
48.所述活化珍珠岩颗粒按以下方法制备：将50重量份珍珠岩颗粒加入到150重量份质量分数为15％柠檬酸水溶液，以200w功率、25khz超声洗涤2h后移入布氏漏斗用蒸馏水抽滤洗涤30min，将抽滤产物烘干后粉碎并过100目筛，得到纯化珍珠岩颗粒；取全部的纯化珍珠岩颗粒，加入150重量份质量分数为3％的活化剂，浸于温度为40℃、保温浸泡2h，过滤，将沉淀再置于马弗炉中，加热升温至450℃保温煅烧1h后取出，得活化珍珠岩颗粒；
49.所述活化剂为碳酸氢钠。
50.实施例5
51.与实施例4基本相同，其区别仅在于：
52.所述活化珍珠岩颗粒按以下方法制备：将50重量份珍珠岩颗粒加入到150重量份质量分数为15％柠檬酸水溶液，以200w功率、25khz超声洗涤2h后移入布氏漏斗用蒸馏水抽滤洗涤30min，将抽滤产物烘干后粉碎并过100目筛，得到纯化珍珠岩颗粒；取全部的纯化珍珠岩颗粒，加入150重量份质量分数为3％的活化剂，浸于温度为40℃、保温浸泡2h，过滤，将沉淀置于置于马弗炉中，加热升温至450℃保温煅烧1h后取出，得活化珍珠岩颗粒；
53.所述活化剂为氢氧化钠。
54.实施例6
55.与实施例4基本相同，其区别仅在于：
56.所述活化珍珠岩颗粒按以下方法制备：将50重量份珍珠岩颗粒加入到150重量份质量分数为15％柠檬酸水溶液，以200w功率、25khz超声洗涤2h后移入布氏漏斗用蒸馏水抽滤洗涤30min，将抽滤产物烘干后粉碎并过100目筛，得到纯化珍珠岩颗粒；取全部的纯化珍珠岩颗粒，加入150重量份质量分数为3％的活化剂，浸于温度为40℃、保温浸泡2h，过滤，将
沉淀置于于马弗炉中，加热升温至450℃保温煅烧1h后取出，得活化珍珠岩颗粒；
57.所述活化剂由碳酸氢钠和氢氧化钠按质量比为1:2组成。
58.测试例1
59.(1)培养基质的制备：将700重量份土壤自然风干，过筛后得到无铀污染土壤，并在180℃进行灭菌处理2h，冷却，平均分成7组，分别与75重量份上述实施例1
‑
6的菌根菌剂和市售的菌剂产品进行充分搅拌均匀混合，即可得到所需的培养基质，放入相同大小的7个盆栽中，分别记录为t1、t2、t3、t4、t5、t6、ck；
60.(2)播种，将黄瓜种子70粒，分成7组，每组各10粒，在对照组和实验组的每个盆栽中间隔相同距离种植10颗黄瓜种子，每个盆栽中采用相同量的自来水进行浇灌；
61.(3)将上述盆栽置于光照培养箱中，设置光照7000勒克斯，温度22℃，湿度50％；
62.(4)根据盆栽的基质干湿状况，每天进行水分补充，15d后观察记录植株生长状态。
63.对分别施用实施1
‑
6制得的菌根菌剂和对照组市售的菌剂后各组黄瓜的株高、根长、株鲜重、幼苗存活率、病虫害发生率进行测定，结果如下表一。
64.表一、黄瓜生长指标测定
[0065][0066][0067]
从上述结果可知，比较t1和空白对照，明显看出来，不施加菌剂肥的黄瓜幼苗的生长效果明显不如添加了菌剂肥，可见菌根肥能促进植物株高、根长、株鲜重、幼苗存活率，同时减少幼苗的病虫害发生率；进一步比较实施例t1、t2、t3，可见t2、t3采用活化蛭石或者活化珍珠岩颗粒的固体培养基得到的菌根菌剂到的活性更高，其原因是制备得到的活化蛭石或者活化珍珠岩颗粒在活化的过程中具备丰富的孔隙结构，形成蠕虫状的蓬松多孔结构，因而活化后蛭石的比表面积大大提高，有利于菌种培养过程中能够充分吸收营养物质，并促进菌种的繁殖生长以家禽肥为有机载体，加入丛枝菌根菌剂，再配合无机矿物质肥料中的氮、磷、及其他微量元素，将有机肥的长效性、微生物独特的生理调节功能和矿物质肥料的高效性结合在一起，制成黄瓜专用有机复合肥料，该肥料在降低了化肥用量的同时提高其利用率、黄瓜的产量和品质，具有均衡提供营养，增加土壤的肥力、促进黄瓜的生长效果；比较实施例t2、t3、t4，可见同时采用活化蛭石粉和活化珍珠岩颗粒能够进一步促进黄瓜的良好生长，同时减少病虫害的发生；其原因是活化蛭石粉和活化珍珠岩颗粒能够起到协同增效的作用的，因为活化蛭石和活化珍珠岩颗粒在活化的过程中具备丰富的孔隙结构，形
成蠕虫状的蓬松多孔结构，因而活化后蛭石的比表面积大大提高，有利于菌种培养过程中能够充分吸收营养物质；更进一步比较实施例t4、t5、t6可以看出，t6中采用的是通过改性剂为碳酸氢钠和氢氧化钠的复配所制备得到的活化珍珠岩可以用于制备菌根菌剂的培养基，对黄瓜的生长具有显著的作用，其原因是珍珠石经酸性柠檬酸水溶液超声清洗以增大其孔隙率和比表面积，再通过加入活化剂，碳酸氢钠在加热的情况可以逐渐分解，产生的二氧化碳需要从珍珠岩颗粒中溢出，能够增加珍珠岩的孔隙率；而氢氧化钠高温活化下将珍珠岩颗粒末中晶体态非活性硅铝酸盐转化成不定型态活性硅铝酸盐，利用碳酸氢钠和氢氧化钠的协同作用，使得珍珠石在焙烧过程中的水分汽化，从而形成孔隙率丰富、比表面积大的多孔结构。本发明采用特定方法制备的培养基，制备得到的菌根菌剂可以大幅度的提高细菌存活率和繁殖率。
[0068]
测试例2
[0069]
重金属含量测定：(1)将700重量份土壤自然风干，过筛后得到无铀污染土壤，并在180℃进行灭菌处理2h，冷却，平均分成7组，分别与75重量份上述实施例1
‑
6的菌根菌剂和市售的菌剂产品进行充分搅拌均匀混合，即可得到所需的培养基质，放入相同大小的7个盆栽中，分别记录为k1、k2、k3、k4、k5、k6、ck；
[0070]
(3)向上述7个盆栽中分别人工施加的相同的铅、镉污染土壤，铅浓度分别为500mg/kg，施加物为pb(no3)2，镉浓度分别为120mg/kg，施加物为cd(no3)2；各盆栽中另外投加ca(no3)2，使各污染水平土壤中的no3‑
含量相同，将测试例1中培育好的幼苗移栽到k1、k2、k3、k4、k5、k6、ck，每盆均匀栽苗4棵，试验在日光温室中进行，植物生长期间进行保持水分最大持水量的70％，移栽60d后收获植株，测试4次，取平均值，测试结果如表二。
[0071]
表二、重金属污染测试结果
[0072][0073]
从上述结果可知，施用特定培养基培养得到的菌剂能够吸附重金属离子，从而减少农作物根部的重金属残留量，其原因是本发明采用的固体培养基是多孔、比表面积大的固体基质，具有很强的吸附性，比较空白组ck1和k1
‑
k3可知，空白组采用市售的菌剂对重金属的吸附效果明显很大，而在人工添加了镉的污染土壤中幼苗死亡，采用活化蛭石粉或者活化珍珠岩颗粒培养菌根得到的菌根菌剂用于培育农作物幼苗，很明显能够降低农作物根部重金属的含量，原因是采用活化的蛭石粉或者活化珍珠岩颗粒具有很大的比表面积，用
于作为培育农作物的基质能够吸附重金属，从而降低了农作物根系对重金属的吸附，从而提高农作物的生长；进一步比较k2
‑
k4，k4采用活化蛭石粉和活化珍珠岩颗粒复配的重金属吸附效果明显优于k2或k3采用任一种活化基质培养菌种得到的菌剂效果，其原因很明显，同时采用活化蛭石粉和活化珍珠岩颗粒复配的比表面积明显大于采用活化蛭石粉或活化珍珠岩颗粒复配的比表面积，因此，吸附重金属的效果也明显增加，从而减少重金属对农作物根系和地上部分的重金属污染；最后比较k4
‑
k6，k6中采用的是通过改性剂为碳酸氢钠和氢氧化钠的复配所制备得到的活化珍珠岩可以用于制备菌根菌剂的培养基，最后得到的菌根菌剂用于培育农作物能够增加对重金属吸附的效果，从而减少农作物根系对重金属的吸附，其原因是珍珠石经酸性柠檬酸水溶液超声清洗以增大其孔隙率和比表面积，再通过加入活化剂，碳酸氢钠在加热的情况可以逐渐分解，产生的二氧化碳需要从珍珠岩颗粒中溢出，能够增加珍珠岩的孔隙率；而氢氧化钠高温活化下将珍珠岩颗粒末中晶体态非活性硅铝酸盐转化成不定型态活性硅铝酸盐，利用碳酸氢钠和氢氧化钠的协同作用，使得珍珠石在焙烧过程中的水分汽化，从而形成孔隙率丰富、比表面积大的多孔结构，可以大幅度的提高对重金属的吸附作用，从而减少农作物对重金属吸附，进而提高种作物在重金属污染的环境下的存活率和品质。
[0074]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。