专利名称：司登尼亚蛋白小体-司登尼亚钙蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及新鉴定的多核苷酸、这些多核苷酸编码的多肽、这些多核苷酸和多肽的用途、和这些多核苷酸和多肽的生产。更具体地，本发明中的多肽是人司登尼亚蛋白小体。本发明还涉及此多肽活性的抑制。
背景技术：
司登尼亚钙蛋白(原称硬骨鱼钙蛋白和低血钙蛋白)是一种由有骨鱼类内分泌腺-司登尼亚小体产生的抗高血钙的糖蛋白激素。本发明中的多肽在一级结构上和鱼类中调节钙水平的糖蛋白激素高度同源。
人们对非人类的司登尼亚蛋白小体已有了深入的研究。最近，一个来源于Anguillaaustralis的司登尼亚蛋白小体已经被纯化克隆。已经发现硬骨鱼的肾脏中含有分泌颗粒-司登尼亚小体。电子显微镜指示此分泌颗粒有蛋白性质，可能是未知生理生化功能的激素或酶(Butkus，A.et al.Mol.Cell Endocrinol，54123-33(1987))。
从鳟鱼的司登尼亚小体也已经分离纯化出了一种糖蛋白，它被认作是低血钙蛋白-鱼类主要的低血钙激素。这种蛋白在鱼的几个种(特别是欧洲鳗鱼、tilapia金鱼和鲤鱼)的司登尼亚小体中含量相当大。低血钙蛋白在实验条件诱导血钙浓度增加的情况下典型地从司登尼亚小体中释放出来。超微结构观察显示诱导血钙浓度增加后司登尼亚小体的产生低血钙蛋白的细胞几乎完全解体。分离得到的糖蛋白表观分子量为54kDa(Lafeber F.P.et al.，Gen Comp.Endocrinolo，6919-30(1988))。
另外，最近结果显示几个硬骨鱼钙蛋白的合成多肽片段抑制彩虹鳟幼鱼(Salmogairdneri)钙的吸收。鳗鱼和鲑鱼的硬骨鱼钙蛋白的氨基端肽段(从氨基酸1到20)在钙吸收循环的高点上明显抑制Ca45的吸收(可达75％)，虽然此肽段的摩尔有效剂量20至200倍于完整分子。与此相反，鳗鱼的硬骨鱼钙蛋白的羧基端片段(从氨基酸202-231)对钙的吸收没有抑制作用(Milliken C.E.et al.，Gen.Comp.Endocrinol，77416-22(1990))。
两个鲑鱼司登尼亚钙蛋白的纯化和特性以及用体外和体内模型系统检测相对于钙的激素分泌调节的方法也都有了描述。有关一个来自鲑鱼CSλgt10 cDNA文库的coho鲑鱼司登尼亚钙蛋白信使RNA(mRNA)的分子克隆和cDNA序列分析也有了描述。鲑鱼司登尼亚钙蛋白mRNA长度大约为2Kda，编码一个256个氨基酸的初级翻译产物。前33个残基组成了激素的前蛋白区，而剩下的223个残基构成了激素的成熟形式。(WagnerG.F.et al.，Mol.Cell Endocrinol，907-15(1992))。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了一种新的成熟多肽，即司登尼亚钙蛋白小体，及其片段、类似物和衍生物。本发明中的司登尼亚钙蛋白小体是人源化的。
根据本发明的另一个方面，提供了编码这些多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根据本发明的另一方面，提供了用重组技术生产此多肽的方法。
根据本发明的另一方面，提供了利用此多肽或编码此多肽的多核苷酸达到治疗目的的方法，例如，治疗电解质紊乱引起的肾脏、骨骼和心脏疾病，和过高的骨吸收引起的紊乱，如骨质疏松和Paget氏病。
根据本发明的另一方面，提供了抗此多肽的抗体。此抗体可用于导致痉挛、抽搐和其它相关紊乱症状的低血钙的治疗。低血钙可有大量不同原因引起，包括肾衰竭、甲状旁腺肥大，严重感染或烧伤(可导致从胞间液和从胰腺不足捕获钙元素)。
根据本发明的另一方面，提供此多肽的拮抗剂/抑制剂，可用于抑制此多肽的活性，例如，在治疗低血钙症和骨质疏松时。
本发明的这些和其它一些方面对本领域的熟练技术人员来说通过本文的讲授后是显而易见的。
下列附图是本发明的实施方案的示意，而并非是对权利要求所限的本发明的范围的限制。
图1显示预加工的司登尼亚钙蛋白小体的cDNA的序列和推导的氨基酸序列。氨基酸序列用标准3字母简写码标识在对应cDNA的下面。
图2显示人司登尼亚钙蛋白(上行)和从Oncorhynchus kisutch分离得到的司登尼亚钙蛋白(下行)的多肽序列的比较。在Oncorhynchus kisytch来源的司登尼亚钙蛋白的204位氨基酸之后，二者之间不存在明显的序列同源性。从Oncorhynchus kisutch分离得到的司登尼亚钙蛋白的全序列长度为256个氨基酸。
图3显示细菌表达和纯化后的人司登尼亚钙蛋白多肽的带型。
具体实施例方式
根据本发明的一个方面，提供了编码具有图1的推导的氨基酸序列的成熟多肽，或1994年1月25日ATCC保藏号为No.75652的保藏克隆的cDNA编码的成熟多肽的分离的核酸(多核苷酸)。图1的多核苷酸序列包含由前15个核苷酸组成的前序列。此多核苷酸序列编码一个247个氨基酸的翻译产物，其中前33个氨基酸可能代表此蛋白的前蛋白原区。这样，前蛋白原区切除后就形成一个214个氨基酸的成熟活性多肽。
本发明的多核苷酸是从人早期肺cDNA文库中分离出来的。它包含一个编码247个氨基酸的前多肽原的开放阅读框架。此多肽和来自Anguilla australis的司登尼亚钙蛋白之间有高度同源性，在一个195氨基酸的部分重叠区中有119个氨基酸完全相同(61％)。它还和来自Oncorhynchus kisutch的司登尼亚钙蛋白之间有很高的同源性，在一个204氨基酸的部分重叠区中有118个氨基酸完全相同(57％)。
本发明中的多核苷酸可以以RNA的形式，也可以以DNA的形式提供，其中的DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。DNA可以是双链的或单链的，如果是单链的则可以是编码链或非编码链(反义链)。编码此成熟多肽的编码序列可能和图1所示的编码序列相同，也可能和保藏克隆中的相同，或者可能是因为遗传密码的冗余性和简并性而形成的一个不同的编码序列，但此编码序列编码和图1的DNA或保藏克隆所编码的同样的成熟多肽。
编码图1的成熟多肽或保藏cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可能包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和诸如前导序列或分泌序列或蛋白原序列的附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)和诸如内含子或成熟多肽的5和/或3′端非编码区的非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”限定为包括此多肽编码序列的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述的多核苷酸的变异体，其编码具有图1推导的氨基酸序列的多肽或保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可能是此多核苷酸天然发生的等位突变体或此多核苷酸的非天然发生的突变体。
因此，本发明包括编码图1所示的相同成熟多肽或其可溶形式或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，所述变异体编码图1的多肽或由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、置换变异体和增加或插入变异体。
如上所述，多核苷酸可以具有为图1所示的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列，或保藏克隆的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列。如本领域所公知的，等位基因变异体是多核苷酸的另一种形式，其可以置换、缺失或增加一个或多个核苷酸，但基本上不改变所编码的多肽的功能。
本发明还包括多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在同一读框内与有助于多肽从宿主细胞表达和分泌的多核苷酸融合，例如前导序列，其是用于控制多肽从细胞转运的分泌序列。具有前导序列的多肽是一种前蛋白(preprotein)，前导序列可以由宿主细胞切下以形成多肽的成熟形式。多核苷酸还可编码一种蛋白原(proprotein)，其是成熟蛋白加上另外的5’氨基酸残基。具有序列原(prosequence)的成熟蛋白为蛋白原并是蛋白质的非活性形式，一旦序列原被切掉，则保留一活性成熟蛋白。
因此，例如，本发明的多核苷酸可以编码一成熟蛋白，或编码一具有序列原的蛋白或一具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白。
本发明的多核苷酸还可以具有在读框内与标记序列融合的编码序列，其可用于纯化本发明的多肽。标记序列可以是，例如，由pQE-9载体提供的六组氨酸标记物用于在细菌宿主中纯化与该标记物融合的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素标记物(HA)。HA标记物相应于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本发明还涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间具有至少50％、优选70％的同一性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用的，术语“严格条件”是指杂交仅发生在序列间具有至少95％、优选97％同一性的情况下。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保持了由图1的cDNA或保藏的cDNA编码的成熟多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物将根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定期限保藏。这些保藏仅为本领域技术人员提供方便，而不是对根据35U.S.C 112索取保藏物的许可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及该序列编码的多肽的氨基酸序列引入本文作参考，并且在与本文的序列描述有抵触时，其是参照。制造、使用或销售保藏物需经许可，而本文不授予这种许可。
本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的司登尼亚小体多肽，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。
当指图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这些多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，其可通过裂解蛋白原部分而激活以生产有活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的一或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选由保守的氨基酸残基取代)，并且这种取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码，也可不是由遗传密码编码，或者(ii)其中的一或多个氨基酸残基包括一取代基，或者(iii)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物例如为增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸与成熟多肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽的序列或者蛋白原序列。这种片段、衍生物和类似物被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并优选纯化至均一性。
术语“分离的”是指从其原始环境(例如，若其是天然存在的则是天然环境)中脱离的物质。例如，存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从一些或所有共存物质中分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是某种组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞，以及用重组技术生产本发明的多肽。
宿主细胞用本发明的载体遗传工程化(转导或转化或转染)，所述的载体可以是克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。遗传工程化的宿主细胞可以在改良的传统营养培养基中培养，改良培养基是为了激活启动子，选择转化子或扩增司登尼亚基因。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用来表达的宿主细胞的条件，其对本领域普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可通过重组技术用于生产多肽，因此，例如，该多核苷酸可以包括在任一种表达载体中特别是载体或质粒中以表达多肽。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA的结合体的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和拟狂犬病毒。然而，也可使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制和生存。
如上所述，可通过多种程序将合适的DNA序列插入载体，通常，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这些和其它程序属于本领域熟练技术人员的范畴。
可通过各种程序将合适的DNA序列插入载体，一般地，该DNA序列通过本领域已知的程序插入合适的限制性内切酶位点。这些程序和其它程序被视为属于本领域熟练技术人员的范畴。
表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA合成，作为这些启动子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40启动子，E.coli lac或trp启动子，λ噬菌体PL启动子和其它公知用于控制基因在原核细胞或真核细胞或者病毒中表达的启动子。表达载体还含有一用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的合适的序列。
另外，表达载体优选含有一个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的基因，如对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如为四环素或氨苄青霉素抗性。
可采用含有如上所述合适DNA序列以及合适启动子或调控序列的载体转化合适的宿主以使宿主表达蛋白质。
作为合适的宿主的例子，可以提及的有细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。选择合适的宿主细胞被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
更具体地，本发明还包括重组构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入本发明的序列。在这一实施方案的一个优选方面，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，它们是可商购的。以下举出载体的例子，细菌的载体pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBs，pD10，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，Pbsks，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体pWLNEO，pSV2cat，pOG44，pXT1，PSG(Stratagene)，pSVK3，PBPV，PMSG，PSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它质粒或载体，只要其可在宿主中复制和生存即可。
启动子区可以使用CAT(氯霉素转移酶)的载体或其它带有选择性标记的载体选自任何所需基因，两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子属于本领域普通技术人员的水平范畴。
在另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞，所述的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))将构建体导入宿主细胞。
可以用传统的方式使用宿主细胞中的构建体以生产由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在合适的启动子的控制下，可以在哺乳细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质，也可采用无细胞翻译系统使用由本发明的DNA构建体衍生的RNA生产这种蛋白质。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体见Sambrook，et al，Molecular ClonningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，该书引入本文作参考。
高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一增强子序列而得以增加，增强子是约10-300bp的顺式作用的DNA因子，其作用于启动子以增加其转录。其例子包括位于复制起点晚期侧(100-270bp处)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。这种启动子可以衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。在合适的阶段，杂合结构序列装配上翻译起始和终止序列，以及优选地，装配一能指导翻译的蛋白质进入周质空间或胞外培养基的前导序列。任选地，杂合序列可以编码一包括N-末端鉴别肽的融合蛋白质，以赋予所需的特征，如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。
用于细菌的表达载体的构建是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入带有功能启动子的可操纵阅读相而完成。载体包括一或多种表型选择标记及一个复制起点以确证载体保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中扩增。合适的用于转化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，当然，也可采用其它菌。
作为代表性而非限制性的例子，有用的细菌表达载体可以包括衍生于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的选择标记和细菌复制起点，这些商购质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacma Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子及待表达的结构序列结合。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，用合适的方法(如温度改变或化学诱导)诱导选定的启动子，并继续培养细胞一段时间。
典型地，细胞由离心收集，用物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可用任何常规方法破碎，如冻-融循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂。
也可使用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白，哺乳细胞表达系统包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’旁侧非转录序列。可使用源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接体和多腺苷酸化位点以提供所需的非转录遗传因子。
可通过硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收并纯化司登尼亚蛋白小体。优选的是在纯化过程中存在低浓度(约0.1-5mM)的钙离子(Price，et al.，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，可使用蛋白质重折叠步骤以完成成熟蛋白的构型，最后，可采用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成过程的产物，或者通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳类细胞)而生产。根据在重组生产过程中采用的宿主，本发明的多肽可以用哺乳类或其它真核类的碳水化合物糖基化或是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括一起始的甲硫氨酸残基。
本发明中的多肽可以用于大量电解质类疾病的治疗。动脉高血压的一个原因是由于Na-K泵缺乏或抑制造成的不正常的Na+穿过血管平滑细胞细胞壁的运输，另外一个原因是如同已经在人的几种形式的高血压中描述的那样的Na+通透性提高。最后的结果是细胞内Na+提高，使细胞对血管收缩因子更加敏感。因为Ca++跟随着Na+，推测正是由于细胞内Ca++的积累而非本身Na+的积累引起交感神经刺激敏感性增加。相应地，因为司登尼亚蛋白小体可以发挥降血钙因子的功能，所以它可以帮助降低这种增加的细胞内Ca++，降低或防止高血压。另外，高血钙还与心率不齐，昏迷和心跳骤停有关。因此，司登尼亚蛋白小体可以通过降低自由钙的浓度来发挥其对这类紊乱的治疗价值。
高血压还直接与肾脏紊乱有关。相应地，过高或过低的电解质浓度可以引起肾脏功能失调，直接导致其它更为严重的紊乱。作为例子，钙-磷失衡可以引起肌肉和骨骼疼痛，骨骼脱矿化作用和包括大脑、眼睛、心肌和血管的各种器官的钙化。因此，本发明中的多肽可以用来缓解由于钙-磷失衡引起的紊乱。肾脏功能失调导致血液中不正常的高浓度磷酸盐，用本发明中的多肽可以将其降至正常浓度。
本发明中的多肽对某些骨骼疾病的治疗也是很有用的。如，钙浓度过高引起受影响的骨骼中纤维瘤的发育。
高血钙的起因可能也是包括甲状旁腺肥大症，维生素D过多症，通过破坏骨骼升高血清钙浓度的肿瘤，肉样瘤病，甲状腺肿大，肾上腺机能不全，肾脏疾病引起的血清白蛋白下降，过量的GI钙吸收和血浆蛋白浓度提高的大量不同的紊乱。因此，司登尼亚蛋白小体在降低高血钙和其相关紊乱方面是有效的。
司登尼亚蛋白小体对与不正常电解质浓度和体液失衡有关的其它紊乱的治疗也是有用的，如偏头痛。
根据本发明，此多肽也可以用于体内表达，即经常被称为“基因治疗”的方法。
因此，例如，可用编码来自体内的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对患者的细胞进行工程化，随后将工程化的细胞再提供给需用多肽治疗的患者，这些方法是本领域公知的。例如，可用含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒利用本领域熟知的程序对细胞进行工程化。
类似地，例如也可通过本领域公知的程序在体内对细胞进行工程化以在体内表达多肽。如本领域所公知的，可将生产含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产者细胞给予患者以在体内进行细胞的工程化并在体内表达多肽。通过这种方法给予本发明的多肽的这些和其它方法对于本领域熟练技术人员根据本发明的教导是显而易见的。例如，用于工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，而是例如腺病毒，其在与合适的输送载体结合后可用于在体内工程化细胞。
本发明的多肽可以与合适的药物载体结合应用，这种组合物包括治疗有效量的蛋白质以及药物学可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水、缓冲的盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其结合物。配制品应适合给药方式。
本发明还提供了一种药物包装盒或试剂盒，其包括一或多个填充有一或多种本发明的药物组合物成分的容器。与这种容器在一起的还有由控制药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构出具的通知，该通知反应了该机构许可其为人体用而生产、使用或销售。另外，本发明的多肽可以与其它药物化合物结合应用。
此药物组合物可能以诸如口腔的，静脉的，腹膜内的，肌肉的，皮下的，鼻内的，或皮内途径的传统方式给药。对治疗主体的给药量和剂量依赖于诸如给药方式，被治疗病情的性质，被治疗主体的体重和开药方医生的诊断等的大量因素。一般来说，例如，药物有效剂量最低为大约每天每千克体重0.1毫克，大多数情况下给药量不超过每天每千克体重约10.0毫克，最佳给药剂量为每天每千克体重约0.1毫克至1.0毫克，几天后，考虑给药途径、症状等。
本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。
简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15-25bp)而将序列定位在染色体上。使用cDNA的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增产物。
体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体-特异cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至500或600个碱基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于与独特的染色体位置结合以具有足够的信号强度便于检测。FISH需要使用衍生EST的克隆，越长越好。例如，2000bp是好的，更好为4000bp，而超过4000则可能不是获得好结果所必须的，因其时间百分比不合理。此技术的综述见Verma et al.，HumanChromosomesa Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance inMan中发现(可在线从Johns Hopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。
接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。
应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。
感染个体和未感染个体的比较通常是首先寻找染色体的结构改变，如可从染色体涂片上观察到的或者用基于该cDNA序列的PCR检测到的缺失或易位。最后，需要对来自一些个体的基因进行全测序以证实存在突变并从多态性中区分突变。
本发明还涉及用反义技术体内抑制司登尼亚蛋白小体，反义技术通过三螺旋形成或反义DNA或RNA可用于控制基因表达，这两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的结合。例如，用编码本发明的多肽的多核苷酸序列的5’编码区设计长度为10-40bp的反义RNA寡核苷酸。设计一DNA寡核苷酸以互补子转录涉及的基因的某区域(三螺旋-见Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；andDervan et al，Science，2511360(1991))，从而阻止司登尼亚蛋白小体的转录和生产。
反义RNA寡核苷酸与mRNA体内杂交并阻断mRNA分子翻译成司登尼亚蛋白小体(反义-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。
或者，上述寡核苷酸可以通过本领域公知的程序输送到细胞，从而反义RNA或DNA可以体内表达以通过上述方式抑制司登尼亚蛋白小体的生产。
相应地，司登尼亚蛋白小体的反义构建体可以被用来失活司登尼亚蛋白小体，阻止其降低血钙的作用，达到治疗低血钙症的目的。由于钙水平低下造成的以细弱易碎骨骼为特征的骨质疏松病，可以用上述的反义结构体治疗。这些反义构建体可以用相似的方式治疗Paget氏病。
本发明的多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达其的细胞可用作免疫原生产抗体，这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合抗体、CDR嫁接的单链抗体和人源化抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物。可使用现有技术中公知的各种程序生产这些抗体和片段。
抗对应于本发明的序列的多肽或其体内受体的抗体可以通过将多肽直接注射给动物或将多肽给予动物、优选非人而获得，如此获得的抗体随后与多肽本身结合。以这种方式，仅编码多肽的一个片段的序列也可用于生产与完整天然多肽结合的抗体，这种抗体随后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。为制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生产的抗体的技术，例如杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(kozbor et al.，1983，ImmunologyToday 472)，以及生产人单克隆多肽的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，inMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生产单链抗体的技术(USP4.946,778)可以用来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
抗本发明的多肽的抗体可以进一步用来抑制此多肽的正常功能。以这种方式，这些抗体可以通过其阻止司登尼亚钙蛋白的降血钙功能而用作抗低血钙因子。可以用这些抗体治疗的疾病是骨质疏松。
本发明还涉及本发明的多肽的拮抗剂/抑制剂，该拮抗剂/抑制剂抑制或消除该多肽的功能。
因此，例如，拮抗剂与本发明的多肽结合并抑制或消除其功能，拮抗剂例如可以是与多肽结合的抗体，或在某些情况下是寡核苷酸。抑制剂的一个例子是与多肽结合并占据多肽的催化位点的小分子从而使催化位点不能与底物接触，进而防止正常的生物学活性，这些小分子的例子包括但不限于小肽或类肽分子。
或者，可以采用与受体(本发明的多肽正常与该受体结合)结合的本发明的多肽的拮抗剂，该拮抗剂可以是与天然蛋白紧密相关的蛋白质以便它们识别并结合于天然蛋白质的受体位点，但它们是天然蛋白质的无活性形式并由此因为受体位点被占据而阻止司登尼亚蛋白小体的作用。以这种方式，司登尼亚蛋白小体的作用被阻止，拮抗剂/抑制剂还可用作抗低血钙因子治疗类似骨质疏松这类需要提高钙水平的紊乱。
拮抗剂/抑制剂可与例如上述的药物学可接受载体形成组合物而应用。
以下将参照实施例进一步描述本发明，但是应理解的是，本发明不受这些实施例的限制。除非另有说明，所有的份或量均为重量份或重量。
为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。
“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μg DNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃ 1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。
裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。
“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。
除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法进行转化。
实施例1司登尼亚蛋白小体的细菌表达和纯化编码司登尼亚蛋白小体的DNA(ATCC#75652)首先用与司登尼亚蛋白小体的5’和3’端序列对应的，在5’和3’端分别加上Sph I和Bgl II酶切位点附加序列的PCR寡聚核苷酸引物扩增。5’寡聚核苷酸引物的序列为5’-GACTGCATGCTCCAAAACTCAGCAGTG-3’，其中含有一个SphI限制酶位点(GCATGC)和开始于起始密码子的21个核苷酸的司登尼亚蛋白小体的编码序列；3’端引物序列3’-GACTAGATCTTGCACTCTCATGGGATGTGCG-5’含有Bgl II限制性位点(AGATCT)的互补序列和司登尼亚蛋白小体编码序列最后的21个核苷酸。此限制酶位点与细菌表达载体pQE70上的限制酶位点相对应(Qiagen，Inc.9259Eton Ave.，Chatsworth，CA 91311)。pQE70编码抗生素抗性(Ampr)，一个细菌性复制起始点(ori)，一个IPTG可调节启动子操纵子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-His标记和限制酶位点。pQE70用Sph I和Bgl II限制酶消化。扩增序列连接到pQE70中且插入带编码组氨酸标记和RBS序列的框架中。然后，用连接混合物转化E.coli菌株M15/rep4，商标为M15/rep4的菌株可以从Qiagen公司得到。M15/rep4含有质粒pREP4的多个拷贝，pREP4表达lacI阻遏物和带有卡那霉素抗性(Kanr)。通过其在LB板上的生长能力来鉴定转化子，选择有青霉素/卡那霉素抗性的菌落。分离质粒DNA，并用限制酶分析予以确认。含有所需结构体的克隆在加有Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中培养过夜(O/N)。过夜培养物以1∶100到1∶250的稀释倍数用于大规模培养。细胞生长到光密度O.D.600为0.4到0.6之间。然后，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至终浓度为1mM。IPTG通过使lacI阻遏物失活，清除P/O来诱导增加基因表达。细胞继续生长3到4小时。然后离心(6000×g，20分钟)收获细胞。细胞沉淀物溶于6克分子的鸟苷-盐酸试剂中。澄清后，从此溶液中用镍-螯合柱层析纯化溶解的司登尼亚钙蛋白，条件是能够使含6-His标记的蛋白与柱结合紧密。(Hochuli，E.et al.，Genetic Engineering，Principles & Methods，1287-98(1990)。从盐酸胍(GnHCl)中复性蛋白可以通过几种方法完成。(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Structure-A PracticalApproach，IRL Press，New York(1990)。开始，透析步骤用于清除GnHCl。或者是，从镍-螯合柱上分离出来的纯化蛋白可以结合到GnHCl以线性梯度下降的第二个层析柱上。当蛋白结合到层析柱上并用含250mM咪唑，150mM NaCl，25mM Tris-Hcl pH 7.5和10％甘油的缓冲液洗脱时，蛋白质被复性。最后，可溶性蛋白对含5mM碳酸氢铵的储存缓冲液透析。纯化的蛋白用SDS-PAGE分析。见图3。
根据以上的教导，对本发明作出各种改进和变动是可能的，因此，在所附权利要求书的范围内，本发明可以不同于所述的方式实施。
序列表(1)一般信息(i)申请人OLSEN，等(ii)发明名称司登尼亚蛋白小体-司登尼亚钙蛋白(iii)序列数2(iv)联系地址(A)联系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART& OLSTEIN(B)街道6BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州新泽西州(E)国家美国(F)邮编07068(v)计算机可读形式(A)媒介类型3.5寸软盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)本申请资料(A)申请号08/208,005(B)申请日1994年3月8日(C)分类(v)在先申请资料(A)申请号(B)申请日(vi)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注册号36,134(C)案号/文档号325800-139(viii)通讯信息
(A)电话201-994-1700(B)传真201-994-1744
(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度771碱基对(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1GAAACTTCTC AGAGAATGCT CCAAAACTCA GCAGTGCTTC TGGTGCTGGT GATCAGTGCT 60TCTGCAACCC ATGAGGCGGA GCAGAATGAC TCTGTGAGCC CCAGGAAATC CCGAGTGGCG120GCCCAAAACT CAGCTGAAGT GGTTCGTTGC CTCAACAGTG CTCTACAGGT CGGCTGCGGG180GCTTTTGCAT GCCTGGAAAA CTCCACCTGT GACACAGATG GGATGTATGA CATCTGTAAA240TCCTTCTTGT ACAGCGCTGC TAAATTTGAC ACTCAGGGAA AAGCATTCGT CAAAGAGAGC300TTAAAATGcA TCGCCAACGG GGTCACCTCC AAGGTCTTCC TCGCCATTCG GAGGTGCTCC360ACTTTCCAAA GGATGATTGC TGAGGTGCAG GAAGAGTGCT ACAGCAAGCT GAATGTGTGC420AGCATCGCCA AGCGGAACCC TGAAGCCATC ACTGAGGTCG TCCAGCTGCC CAATCACTTC480TCCAACAGAT ACTATAACAG ACTTGTCCGA AGCCTGCTGG AATGTGATGA AGACACAGTC540AGCACAATCA GAGACAGCCT GATGGAGAAA ATTGGGCCTA ACATGGCCAG CCTCTTCCAC600ATCCTGCAGA CAGACCACTG TGCCCAAACA CACCCACGAG CTGACTTCAA CAGGAGACGC660ACCAATGAGC CGCAGAAGCT GAAAGTCCTC CTCAGGAACC TCCGAGGTGA GGAGGACTCT720CCCTCCCACA TCAAACGCAC ATCCCATGAG AGTGCATAAC CAGGGAGAGG T 771(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度247个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2
Met Leu Gln Asn Ser Ala Val Leu Leu Val Leu Val Ile Ser Ala-30 -25 -20Ser Ala Thr His Glu Ala Glu Gln Asn Asp Ser Val Ser Pro Arg-15 -10 -5Lys Ser Arg Val Ala Ala Gln Asn Ser Ala Glu Val Val Arg Cys15 10Leu Asn Ser Ala Leu Gln Val Gly Cys Gly Ala Phe Ala Cys Leu15 20 25Glu Asn Ser Thr Cys Asp Thr Asp Gly Met Tyr Asp Ile Cys Lys30 35 40Ser Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Lys Phe Asp Thr Gln Gly Lys Ala45 50 55Phe Val Lys Glu Ser Leu Lys Cys Ile Ala Asn Gly Val Thr Ser60 65 70Lys Val Phe Leu Ala Ile Arg Arg Cys Ser Thr Phe Gln Arg Met75 80 85Ile Ala Glu Val Gln Glu Glu Cys Tyr Ser Lys Leu Asn Val Cys90 95 100Ser Ile Ala Lys Arg Asn Pro Glu Ala Ile Thr Glu Val Val Gln105 110 115Leu Pro Asn His Phe Ser Asn Arg Tyr Tyr Asn Arg Leu Val Arg120 125 130Ser Leu Leu Glu Cys Asp Glu Asp Thr Val Ser Thr Ile Arg Asp135 140 145Ser Leu Met Glu Lys Ile Gly Pro Asn Met Ala Ser Leu Phe His150 155 160Ile Leu Gln Thr Asp His Cys Ala Gln Thr His Pro Arg Ala Asp165 170 175He Asn Arg Arg Arg Thr Asn Glu Pro Gln Lys Leu Lys Val Leu180 185 190Leu Arg Asn Leu Arg Gly Glu Glu Asp Ser Pro Ser His Ile Lys195 200 205Arg Thr Ser His Glu Ser Ala210
权利要求
1.一种分离的抗体或其片段，其特异性结合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白。
2.一种分离的抗体或其片段，其特异性结合自细胞培养物中纯化的司登尼亚钙蛋白，其中所述的司登尼亚钙蛋白由编码SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所编码。
3.一种分离的单克隆抗体或其片段，其特异性结合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白。
4.一种分离的单克隆抗体或其片段，其特异性结合自细胞培养物中纯化的司登尼亚钙蛋白，其中所述的司登尼亚钙蛋白由编码SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所编码。
5.一种分离的人类抗体或其片段，其特异性结合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白。
6.一种分离的人类抗体或其片段，其特异性结合自细胞培养物中纯化的司登尼亚钙蛋白，其中所述的司登尼亚钙蛋白由编码SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所编码。
7.一种分离的嵌合型抗体或其片段，其特异性结合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白。
8.一种分离的嵌合型抗体或其片段，其特异性结合自细胞培养物中纯化的司登尼亚钙蛋白，其中所述的司登尼亚钙蛋白由编码SEQ ID NO2的第1至247位氨基酸的多核苷酸所编码。
9.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段，其是一种拮抗抗体。
10.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段，其是一种Fab片段。
11.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段，其中所述蛋白是糖基化的。
12.权利要求7或8的抗体或其片段，其是人源化的抗体或其片段。
13.一种生产特异性结合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白的抗体的方法，其包括(a)将该蛋白引入一种动物；(b)并回收该抗体。
14.一种生产特异性结合具有由SEQ ID NO2的第33至247位氨基酸组成的氨基酸序列的蛋白的抗体的方法，其包括(a)用该蛋白对一单链文库或Fab表达文库进行筛选(b)并回收该抗体。
15.权利要求13或14的方法，其中所述抗体是一种单克隆抗体、嵌合型抗体、人源化抗体或人类抗体、或Fab片段。
16.由权利要求13至15中任一项的方法所产生的抗体。
17.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段在制备用于治疗需要升高血钙水平的患者的药物中的用途。
18.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段在制备用于治疗低钙血症的药物中的用途。
19.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段在制备用于治疗骨质疏松症的药物中的用途。
20.权利要求1至8中任一项的抗体或其片段在制备用于治疗Paget’s病的药物中的用途。
全文摘要
本发明披露了人司登尼亚小体－司登尼亚钙蛋白多肽和编码此多肽的DNA(RNA)。本发明还提供用重组技术生产此多肽的程序和生产此多肽的抗体和拮抗剂/抑制剂的程序。本发明的另一方面是提供此多肽和一个合适的药物载体的结合物以用于疾病的治疗和需要抑制此多肽的疾病的治疗。
文档编号C07K19/00GK1560080SQ200410002718
公开日2005年1月5日 申请日期1994年5月9日 优先权日1994年3月8日
发明者亨里克·奥森, 亨里克 奥森, D 亚当斯, 马克·D·亚当斯 申请人:人体基因组科学有限公司