专利名称：促胃动素同系物的制作方法
背景技术：
在胃肠环境中存在许多对维持营养状况的内环境稳定起重要作用的调节肽。这些肽可在消化系统合成并在局部作用，但也可在大脑中鉴定到。此外，也有相反的情况，即肽虽合成于大脑，但却调节胃肠道内的细胞。这一现象被称为“脑肠轴”，它对发出饱腹信号、调节体温及其它要求在大脑和消化道之间发生反馈的生理过程是重要的。
胃肠肽激素包括促胃液素、缩胆囊素(CCK)、促胰液素、促胃液素抑制肽(GIP)、血管活性肠肽(VIP)、促胃动素、抑生长素、胰多肽(PP)、P物质和神经肽Y(NPY)，它们以各种不同的机制进行作用。例如，促胃液素、促胃动素和缩胆囊素(CCK)是作为内分泌和神经分泌型激素起作用的。其它一些激素，诸如促胃液素和促胃液素抑制肽之类，被认为是完全以内分泌形式作用的。其它的作用方式包括内分泌、神经分泌和旁分泌作用的联合(抑生长素)、完全的神经分泌作用(神经肽Y)；及神经分泌和旁分泌作用的联合(血管活性肠肽和P物质)。大部分胃肠激素作用是由膜结合受体介导的，它们激活第二信使系统。有关胃肠肽的回顾可见以下文献Muluihill等，在《基础与临床内分泌学》中，pp.551-570，第四版，Greenspan F.S.和Baxter J.D.编.Appleton和LangeNowalk，康涅狄格，1994。
这些胃肠肽中的许多是以非活性前体分子形式合成的，它们需经复杂的多重肽裂解而被激活。已知的“胰高血糖素-促胰液素”家族包括例如血管活性肠肽、促胃液素、促胰液素、促胃动素、胰高血糖素和galanin等肽，它们就是通过复杂裂解和翻译后修饰而被调节的肽的例子。
促胃动素是存在于哺乳类肠道组织中的一种22个氨基酸的肽(Domschke，W.，消化类疾病，22(5)454-461，1977)。猪前促胃动素原的DNA和氨基酸序列已被确定了(美国专利5,006,469)。促胃动素已被认为是能提高胃运动、通过刺激胃蛋白酶分泌而影响胃的分泌功能的一个因子(Brown等，加拿大生理学及药学杂志(Canadian J.of Physid.Pharmacol.)，49399-405，1971)，最近有证据显示，它还具有胃和小肠肌动调节的作用。促胃动素的循环系统浓度增加与消化中的肌电复合物第三阶段及十二指肠的饥饿收缩相关(chey等，在《肠激素》中，Bloom，S.R.(编)，第355-358页，Edinkurgh，churchitl Liuing stone，1978；Lee等人，美国消化类疾病杂志(Am.J.Digestive Diseqses)，23789-795，1978；及Itoh等人，美国消化类疾病杂志，23929-935，1978)。现已证明促胃动素及其同系物会引起胃肠平滑肌的收缩，但不会引起其它类型平滑肌细胞收缩(Strunz等，胃肠病学，68卷；1485-1491页，1975)。
本发明涉及与促胃动素具同源性的一种新分泌蛋白，已发现它在胃肠系统中得到转录。这一新肽的发现对于进一步阐明机体如何维持其营养状况的内环境平衡有重要意义，对于开发一些治疗方法以干预那些过程，以及根据本文教导而很显而易见的其它一些用途也很重要。
发明概述一方面，本发明提供了编码多肽的分离的多核苷酸分子，其选自(a)包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)和(b)的正同系物(ortholog)；和(d)(a)、(b)或者(c)的简并核苷酸序列。
另一方面，本发明提供了选自下组的分离的多肽(a)包含SEQ IDNO2所示24位至37位残基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或者(b)的正同系物。
另一方面，本发明提供了含有下列可操作性地连接在一起的元件的表达载体转录启动子；选自下组的DNA片段(a)包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或者(c)的简并核苷酸序列；及转录终止子。
另一方面，本发明提供了已导入表达载体的培养细胞，所述表达载体包含下列可操作性地连接在一起的元件转录启动子；选自下组的DNA片段包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或者(c)的简并核苷酸序列；及转录终止子，其中所述细胞表达该DNA片段所编码的多肽。
另一方面，本发明提供了含有与药学上可接受载体组合的、选自下组的纯化多肽的药物组合物(a)包含SEQ ID NO2所示24位至37位残基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或者(b)的正同系物。
另一方面，本发明提供了可与选自下组之多肽的表位结合的抗体(a)包含SEQ ID NO2所示24位至117位残基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或者(b)的正同系物。
另一方面，本发明提供了生产zsig33多肽的方法，包括培养已导入了表达载体的细胞，该表达载体包含下列可操作性地连接在一起的元件转录启动子；选自下组的DNA片段包含SEQ ID NO1所示70位至111位核苷酸的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或者(c)的简并核苷酸序列；及转录终止子，其中所述细胞表达该DNA片段所编码的多肽；和回收该多肽。
另一方面，本发明提供了刺激胃活动的方法，包括给有此需要的哺乳动物施用于药学上可接受载体中的、含有选自下组之分离多肽的组合物(a)包含SEQ ID NO2所示24位至37位残基的氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或者(b)的正同系物；其施用量足以提高摄入物质的运送时间(transit time)或者胃排空(gastric emptying)。
发明详述在详细描述本发明之前，有必要确定本文所用的某些术语。
术语“正同系物”(ortholog)表示从一个种获得的多肽或蛋白质，它是不同种来源的多肽或蛋白质的功能性对应物。正同系物间的序列差异是物种化的结果。
术语“副同系物”(paralog)表示由一种生物体生成的截然不同、但结构上相关的蛋白质。人们认为副同系物源于基因的重复。例如，α-球蛋白、β-球蛋白和肌球蛋白相互之间是副同系物。
术语“等位变体”表示占据相同染色体位点的基因的两种或多种可互换形式的任一种。等位变体通过突变自然产生，可在种群内导致表型多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)，或可编码含有改变的氨基酸序列的多肽。术语等位变体此处也用于表示由基因的等位变体编码的蛋白质。
术语“表达载体”表示包含编码目的多肽的区段与提供其转录的其它区段可操作连接的线性或环状DNA分子。这样的其它区段可以包括启动子和终止子序列，并且可以选择性包括一个或多个复制起点、一个或多个选择性标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体一般起源于质粒或病毒DNA，或可以含有两者的元件。
术语“分离的”，当用于多核苷酸分子时，表示多核苷酸已从其天然的遗传环境中取出、因而不含有其它额外或不需要的编码序列，并且是适合于基因工程蛋白质合成系统中使用的形式。这类分离分子是那些与其天然环境分开的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离DNA分子不含有正常与它们相关的其它基因，但可能包含天然存在的5′和3′非翻译区，如启动子和终止子。相关区域的鉴定对本领域技术人员来说是显而易见的(见例如Dynan和Tijan，自然316774-78，1985)。当用于蛋白质时，术语“分离的”表示发现蛋白质处于非其天然环境的状态，如与血液和动物组织分开。优选地，分离蛋白质基本上不含其它蛋白质，尤其是不含动物来源的其它蛋白质。优选提供高度纯化形式的蛋白质，即大于95％纯，更优选地大于99％纯。
术语“可操作性地连接在一起的”当用于DNA区段时表示诸区段的排列方式能使它们发挥预期的功能，如在启动子内起始转录，并延伸通过编码区段至终止子。
术语“多核苷酸”指从5′末端读至3′末端的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链和双链多聚体。多核苷酸包括RNA和DNA，可以从天然来源中分离、体外合成或从天然和合成分子的组合制备。
术语“多核苷酸分子的互补物”表示与参照序列相比具有互补碱基序列并且方向相反的多核苷酸分子。如序列5′ATGCACGGG 3′与5′CCCGTGCAT 3′互补。
术语“简并核苷酸序列”表示包含一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体都编码Asp)。
术语“启动子”表示含有提供RNA聚合酶结合和转录起始的DNA序列的基因部分。启动子序列一般，但并不总是，位于基因的5′非编码区。
术语“分泌信号序列”表示编码作为更大多肽的组成部分而指导该更大多肽通过合成此多肽的细胞的分泌通路的多肽(“分泌肽”)的DNA序列。在通过分泌通路传递的过程中通常对该更大多肽进行切割以除去分泌肽。
术语“受体”表示与生物活性分子(即配体)结合并在细胞上介导配体效应的细胞相关蛋白。膜结合受体的特征在于多结构域结构，包括细胞外配体结合结构域和一般参与信号传导的细胞内效应器结构域。配体和受体结合导致受体构象改变，引起效应器结构域和细胞内其它分子间的相互作用。此相互作用继而引起细胞代谢的变化。和受体-配体相互作用相关的代谢事件包括基因转录、磷酸化作用、去磷酸化作用、环AMP合成的增加、细胞钙的迁移、膜脂的迁移、细胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。大多数核受体也表现为多结构域结构，包括氨基末端、反式激活结构域、DNA结合结构域和配体结合结构域。一般情况下，受体可以是膜结合的、细胞质或核的；单体的(如促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、促红细胞生成素受体和IL-6受体。
术语“互补物/反互补物对”表示在适宜条件下形成非共价结合的稳定对的非相同组分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白链霉素)是互补物/反互补物对的典型成员。其它典型互补物/反互补物对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等。在需要互补物/反互补物对随后解离的地方，互补物/反互补物对优选地具有小于109M-1的结合亲和力。
此处所引用的全部文献均全文引入作为参考文献。
本发明部分上是以一新的人DNA序列的发现为基础的，此DNA序列编码与促胃动素具同源性的新型分泌多肽，与它最近的同系物是猪促胃动素(见SEQ ID NO3和4)。促胃动素是调节胃肠生理的多肽家族中的一员。此多肽家族对胃肠调节非常重要，除促胃动素外，还包括胰高血糖素、促胃液素、galanin和血管活性肠肽(VIP)。这些多肽均以前体形式合成，需多重步骤才可加工成活性形式。与本发明多肽特别相关的是促胃动素、血管活性肠肽(VIP)和galanin，它们的加工包括信号肽的去除，随后将一个或多个附属多肽断裂下来，从而释放出活性肽。产生的活性肽通常较小(10-30个氨基酸长)，且可能还需进一步的翻译后修饰，诸如酰胺化、硫酸化或谷氨酸残基的吡咯烷羧酸(pyrrolidan carbonylic acid)化修饰。
对相应于此新DNA的mRNA的组织分布进行分析显示，它在胃内表达最高，其次是小肠和胰脏，它们的表达比较明显，但表达水平有所降低。EST也存在于肺cDNA文库中。此多肽已被称为zsig33。
通过在EST数据库中查询具推测的分泌信号的序列，对本发明的新zsig33多核苷酸和多肽进行了初步鉴定。发现有一个EST序列，预计它与促胃动素家族相关。此EST序列来源于胎儿胰脏文库。
由全长cDNA编码的新多肽含117个氨基酸。预计的信号肽序列有23个氨基酸残基(SEQ ID NO2的氨基酸残基1至23)。活性肽预计为18个氨基酸残基长(SEQ ID NO2的氨基酸残基24至41)，还有一个位于SEQ ID NO2之41位氨基酸(Ser)之后的C-末端切割位点。然而，许多胃肠-脑肽要求多重裂解。例如，前促胃液素肽含101个氨基酸，它在N-末端断裂，产生相继较小的肽(G34，G17和G14)(Sugano等，生物化学杂志，26011724-11729，1985)。其它需要多重加工步骤的多肽包括胰高血糖素，它的C-末端断裂产生了类胰高血糖素肽1和类胰高血糖素肽2，还有galanin，其中的加工包括已知为GMAP的C-末端肽的裂解。因此，合成出基于SEQ ID NO2的37位氨基酸(Gln)之后断裂点的附加肽，得到一具生物活性的14氨基酸肽(从SEQ IN NO2的氨基酸残基24(甘氨酸)至氨基酸残基37(谷氨酰胺))。
C-末端肽(SEQ IN NO2的氨基酸42至117)也可能具有某些专门的活性。促胃动素活性肽的加工(见SEQ ID NO4)导致释放出一具70个氨基酸长〔即氨基酸残基50(丝氨酸)至氨基酸残基119(赖氨酸)〕的C-末端肽，已知为促胃动素相关肽(MAP)。Adelman等人(美国专利5006469)曾假设MAP在消化、食欲及营养物摄入的调节中担负着一定的作用。
多肽zsig33中高度保守的氨基酸可用作鉴定新家族成员的工具。例如，逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)可用于从RNA扩增编码保守基元的保守区，此RNA可为各种组织来源的。用来自本发明的序列已鉴定了两个这样的保守结构域。第一个结构域位于SEQ ID NO2的氨基酸残基31至36，其中鉴定出的基元是Glu X Gln Arg X Gln，其中的X可为任何氨基酸残基，而第二个结构域是SEQ ID NO2中的氨基酸残基78至84，其中鉴定出的基元是Ala Pro X Asp X Gly Ile，其中的X可为任何氨基酸残基。特别是，按这些序列设计的高度简并性引物可用于此目的。
本领域技术人员很容易认识到，由于遗传密码的简并性，编码SEQ ID NO2的这些多核苷酸分子中可以存在相当多的序列变异，包括所有由U替代T的RNA序列。这样，本发明还包括编码zsig33多肽的多聚核苷酸及它们的RNA等价物。表一所示单字母密码用于指示简并性核苷酸位置。“解析”是由一个单字母密码指示的核苷酸。“互补”指示互补核苷酸的密码。例如，密码Y指C或T，而它的互补物R指A或G，A与T互补，G与C互补。
表1
在下面表2中列出了包括对于给定氨基酸的所有可能的密码子。
表2
本领域普通技术人员将会理解在确定简并密码子，代表编码每一氨基酸的所有可能密码子时引入的某些错读。例如，丝氨酸(WSN)的简并密码子在某些情况下可编码精氨酸(AGR)，精氨酸(MGN)的简并密码子在某些情况下可编码丝氨酸(AGY)。相似的关系在编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码之间也存在。因此，简并序列所包含的某些多核苷酸可能编码变体氨基酸序列，但本领域普通技术人员参考SEQ ID NO2的氨基酸序列可以容易地鉴定这种变体序列。根据本文所述，可以很容易检测变体序列的功能活性。
在本发明优选的实施方案中，分离的多核苷酸在严谨条件下与SEQID NO1中相似大小的区域或与其互补的序列可杂交。一般来说，严谨条件选择为比该具体序列在规定的离子强度和pH下的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是50％的靶序列和完全匹配的探针杂交时的温度(在规定的离子强度和pH下)。典型的严谨条件是pH7时盐浓度是至少约0.02M，并且温度是至少约60℃。
如前面所指出，本发明的分离的多核苷酸包括DNA和RNA。分离DNA和RNA的方法是本领域内熟知的。一般优选从胃组织中分离RNA，尽管使用来自其它组织的RNA或分离基因组DNA也可以制备DNA。使用盐酸胍抽提，接着通过CsCl梯度离心分离，可以制备总RNA(Chirgwin等，生物化学，1852-94，1979)。使用Aviv和Leder的方法(美国国家科学院院报，691408-1412，1972)，从总RNA制备poly(A)+RNA。使用已知的方法从poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。然后通过例如杂交或PCR，鉴定和分离出编码zsig33多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供来自其它物种的多肽和多核苷酸对应物(正同系物)。尤其感兴趣的是来自其它哺乳类的zsig33多肽，包括小鼠、大鼠、猪、羊、牛、狗、猫、马和其它灵长类蛋白。利用本发明提供的信息和组合物，结合常规克隆技术，可以克隆人蛋白质的正同系物。例如，使用从表达此蛋白质的组织或细胞类型获得的mRNA，可以克隆cDNA。通过用从此处公开的序列设计的探针探查Northern印迹，可以鉴定mRNA的适当来源。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。然后，可以通过一系列方法，如用完整或部分人cDNA或用基于公开序列的一套或多套简并探针探查，来分离编码zsig33正同系物的cDNA。用从此处公开的序列设计的引物，使用聚合酶链反应或PCR(Mullis，美国专利4683202)也可以克隆cDNA。在其它方法中，可以使用cDNA文库转化或转染宿主细胞，用抗zsig33的抗体检测目的cDNA的表达。相似的技术也可以应用于基因组克隆的分离。
本领域技术人员将意识到，SEQ ID NO1所公开的序列及其编码的多肽代表的是人zsig33基因和多肽的单一等位形式，预期会发生等位变体和其它的剪接。根据标准方法探查来自不同个体的cDNA或基因组文库，可以克隆等位变体。显示于SEQ ID NO1的DNA序列的等位变体，包括那些含有沉默突变的变体和那些突变导致氨基酸序列变化的变体，都在本发明的范围之内，SEQ ID NO2的等位变体的蛋白质也在本本发明也提供了与SEQ ID NO2的多肽及它们的正同系物基本上同源的分离的zsig33多肽。术语“基本上同源”此处用于表示与SEQID NO2所示序列或它们的Ortholog有50％、优选60％、更优选至少80％序列相同的多肽。这样的多肽与SEQ ID NO2或其Ortholog将更优选至少90％相同，并且最优选95％或更多的相同。通过传统的方法确定序列相同百分率。见例如Altschul等，Bull.Math.Bio.，48603-616，1986和Henikoff和Henikoff，美国国家科学院院报，8910915-10919，1992。简单地说，使用缺口开放补偿(gap opening penalty)为10、缺口延伸补偿(gap extension penalty)为1，以及表3所示Henikoff和Henikoff(出处同前)的“blosum 62”评分矩阵(用标准单字母符号表示氨基酸)，对两个氨基酸序列进行比对，以使序列匹配最优化。
表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R -1 5N -2 0 6D -2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q -1 1 0 0 -3 5E -1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
然后按以下公式计算相同百分率 使用上述比率用相似方法测定多核苷酸分子的序列相同性。
基本上同源的蛋白和多肽以一个或多个氨基酸置换、删除或添加为特征。优选这些改变的影响较小，即是保守氨基酸置换(见表4)和不会显著影响蛋白或多肽的折叠或活性的其它置换；小的删除，一般1至约30个氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸残基、长达约20-25个残基的小接头肽或有助于纯化的小延伸(亲和标签)如多组氨酸臂、蛋白质A(Nilsson等，欧洲分子生物学组织杂志，41075，1985；Nilsson等，酶学方法1983，1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Jahnson，基因，6731，1988)、麦芽糖结合蛋白(Kellerman和Ferenci，酶学方法，90459-463，1982；Guan等，基因6721-30，1987)，硫氧还蛋白，遍在蛋白，纤维素结合蛋白，T7聚合酶或其它抗原性表位或结合结构域。见Ford等，蛋白质的表达和纯化，295-107，1991，在此引用作为参考。编码亲和标签的DNA可以从商业供应商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，M(A)获得。
表4保守的氨基酸替换碱性氨基酸精氨酸赖氨酸组氨酸酸性氨基酸谷氨酸天冬氨酸极性氨基酸谷氨酰胺天冬酰胺疏水氨基酸 亮氨酸异亮氨酸缬氨酸芳香族氨基酸苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小氨基酸甘氨酸丙氨酸丝氨酸苏氨酸甲硫氨酸除了20种标准氨基酸之外，还可以用非标准的氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)取代zsig33内的氨基酸残基。可以用有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码子编码的氨基酸及非天然氨基酸取代zsig33的氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已被修饰，和/或其侧链的化学结构不同于标准氨基酸。非天然氨基酸可化学合成，或者优选地商业购得，它们包括2-哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸，以及3，3-二甲基脯氨酸。
可根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变，鉴定出本发明zsig33多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，科学，2441081-1085，1989)。在后一种技术中，在分子的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并检测生成的突变分子的生物学活性(如对胃肠细胞收缩的刺激作用，对营养物摄入的调节作用，和/或消化酶的分泌)，以鉴定对分子活性比较关键的氨基酸残基。也见Hilton等，生物化学杂志，2714699-4708，1996。通过结构的物理学分析，如通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记之类技术，并结合推测的接触位点氨基酸的突变，也可以出鉴定配体-受体相互作用位点。见例如de Vos等，科学，255306-312，1992；Smith等，分子生物学杂志224899-904，1992；Wlodaver等，FEBS Lett.30959-64，1992。也可以通过与胃肠-脑肽激素的胰高血糖素-促胰液素家族的相关成员一起进行同源性分析，推定出必需氨基酸的位置。
用已知的诱变和筛选方法，如那些由Reidhaar-Olson和Sauer(科学，24153-57，1988)或Bowie和Sauer(美国国家科学院院报，862152-2156，1989)所公开的方法，可以制备和检测多个氨基酸的替换。简要地说，这些作者公开的方法中，使多肽上的两个或多个位置同时随机化，并选择有功能的多肽，再对诱变的多肽测序，以确定每个位置允许被置换的范围。可以使用的其它方法包括噬菌体展示(如Lowman等，生物化学3010832-10837，1991；Ladner等，美国专利号5223409；Huse，WIPO公开WO 92/06204)和定区域诱变(Derbvshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA，7127，1988)。
如上面所公开的诱变方法可以和高效率的自动筛选方法结合，以在宿主细胞中检测克隆的诱变多肽的活性。可以从宿主细胞中回收编码活性多肽(如刺激胃肠细胞收缩、调整营养物质摄入和/或分泌消化酶)的诱变DNA分子，并用现代仪器快速测序。这些方法允许目的多肽中单个氨基酸重要性的快速测定，并可以应用于未知结构的多肽。
使用上面讨论的方法，本领域的普通技术人员可以鉴定和/或制备与SEQ ID NO2的24位至37位残基或其等位变体基本上同源、并保持了野生型蛋白质性质的许多多肽。这些多肽也可以包括如上充分公开的其它多肽片段。
本发明的多肽，包括全长蛋白质及其片段，可以根据传统技术在遗传工程化宿主细胞中合成。合适的宿主细胞是可以用外源DNA转化或转染并在培养中生长的那些细胞类型，包括细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞。优选真核细胞，尤其是多细胞生物的培养细胞。操作克隆的DNA分子和将外源DNA引入许多宿主细胞的技术由Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989和Ausubel等(编辑)，分子生物学常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，纽约，1987公开，这些出版物在此引用作为参考。
总的来说，在表达载体内，编码本发明的zsig33多肽的DNA序列与其表达所需的其它基因元件(一般包括转录启动子和终止子)可操作地连接在一起。载体一般也含有一个或多个选择标记及一个或多个复制起点，尽管本领域技术人员将认识到在某些系统内也可以在分开的载体上提供选标记，并且可以通过整合进宿主细胞基因组中而提供外源DNA的复制。启动子、终止子、选择性标记、载体和其它元件的选择是本领域普通技术水平内的常规设计。许多这样的元件在文献中得到描述并可通过商业供应商得到。
为了将zsig33多肽导入宿主细胞分泌途径，可在表达载体中提供分泌信号序列(也已知为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列可以是zsig33多肽自身的序列，或者来自另一分泌蛋白(如t-PA)，或是从头合成的。分泌信号序列以正确的阅读框架与zsig33 DNA序列连接。分泌信号序列一般置于编码目的多肽的DNA序列的5′端，尽管某些信号序列可以置于目的DNA序列内的别处(见如Welch等，美国专利号5,037,743；Holland等，美国专利号5,143,830)。
在本发明内，培养的哺乳动物细胞也是优选的宿主。将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler等，细胞，14725，1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学，7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒学，52456，1973)、电穿孔(Neumann等，欧洲分子生物学杂志，1841-845，1982)，DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等编辑，现代分子生物学方法，John Wiley和Sons，Inc.，纽约，1987)，脂质体介导的转染(Hawley-Nelson等，焦点，1573，1993；Ciccarone等，焦点，1580，1993)，以及利用病毒载体(A.Miller和G.Rosman，生物技术7980-90，1989；Q.Wang和M.Finer，自然医学(Nature Med.)2714-16，1996)，此处引用作为参考。在培养的哺乳动物细胞中重组多肽的合成公开于Levinson等，美国专利号4713339；Hagen等，美国专利号4784950；Palmiter等，美国专利号4579821；和Ringold，美国专利号4656134，此处引用作为参考。优选的培养哺乳动物细胞包括COS-1(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 1650)、COS-7(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 1651)、BHK570(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 10314)、293(美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 1573；Graham等，普通病毒学杂志，3659-72，1977)和中国仓鼠卵巢细胞系(如CHO-K1，美国典型培养物保藏中心保藏号CRL 61)。其余合适的细胞系在本领域内公知，并可以从公共保藏处如美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland获得。一般优选强转录启动子，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子。见例如，美国专利号4956288。其它合适的启动子包括那些来自金属硫蛋白基因(美国专利号4579821和4601978，此处引用作为参考)的启动子以及腺病毒主要晚期启动子。
一般使用药物选择来选择已插入外源DNA的培养的哺乳动物细胞。这些细胞通常称作“转染子”。在选择性药物存在时培养的并能够将目的基因传递给其子代的细胞称为“稳定转染子”。优选的选择性标记是编码对抗生素新霉素抗性的基因。在新霉素型药物如G-418等存在时进行选择。选择系统也可以用于增加目的基因的表达水平，称之为“扩增”的过程。通过在低水平选择药物存在时培养转染子，然后增加选择性药物的量以选择合成高水平导入基因产物的细胞来进行扩增。优选的可扩增的选择性标记是赋于对氨甲蝶呤抗性的二氢叶酸还原酶。也可以使用其它药物抗性基因(如潮霉素抗性、多药抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。可以利用能导入改变表型的其它标记，如绿色荧光蛋白，或者细胞表面蛋白，例如CD4、CD8、I类MHC、胎盘碱性磷酸酶，通过诸如FACS分拣术或磁珠分离术，从未转染的细胞中选出已转染细胞。
也可以使用其它更高等的真核细胞作为宿主，包括昆虫细胞、植物细胞和鸟类细胞。发根农杆菌作为在植物细胞中表达基因的载体已在Sinkar等，生物科学杂志(Bangalore)，1147-58，1987中综述。昆虫细胞的转化及外源蛋白的产生可见于Guarino等人的美国专利NO.5,162,222和WIPO出版物WO 94/06463中。可用通常来自苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。用以下两种方法之一将编码zsig33多肽的DNA插入杆状病毒基因组中，代替AcNPV多角体蛋白编码序列。第一种方法是传统的方法，即在野生型AcNPV和含有侧翼为AcNPV序列的zsig33的转移载体之间进行同源DNA重组。用野生型AcNPV感染合适的昆虫细胞，如SF9细胞，并用含有zsig33多核苷酸的转移载体进行转染，所说的zsig33多核苷酸可操作性地与AcNPV多角体蛋白基因启动子、终止子及侧翼序列连接。参阅King，L.A.和Possee，R.D.，杆状病毒表达系统实验室指导手册，伦敦，Chapman和Hall；O’Reilly，D.R.等人，杆状病毒表达载体实验室手册，纽约，牛津大学出版社，1944；和Richardson，C.D.(编)杆状病毒表达手册，分子生物学方法，Totowa，NJ，人类出版社，1995。昆虫细胞中的天然重组将产生含有由多角体蛋白启动子驱动的zsig33的重组杆状病毒。按本领域中的常用方法制备重组病毒贮液。
第二种制备重组杆状病毒的方法中利用了Luckow(Luckow，V.A，等人，病毒学杂志(J Virot)674566-79，1993)所描述的基于转座子的系统。此系统在Bac-to-Bac试剂盒(Life Technologies，Rockvitle，MD)中有售。该系统利用了一种转移载体-pFastBaclTM(生命技术公司)，它含一个Tn7转座子，可将编码zsig33多肽的DNA转移进入杆状病毒基因组，此杆状病毒基因组如同一大质粒保留在大肠杆菌中，称“杆粒”。pFastBaclTM转移载体利用AcNPV多角体蛋白启动子驱动目的基因(在本例中即为zsig33)的表达。然而，可对pFastBaclTM进行相当程度的修饰。可去除多角体蛋白启动子，而代之以杆状病毒碱性蛋白启动子(也称Pcor，p6.9或MP启动子)，后者在杆状病毒感染中表达得较早，且已显示出对表达分泌蛋白较为有利。参阅Hill-Perkins，M.S.和Possee，R.D.，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)71971-6，1990；Bonning，B.C.等人，普通病毒学杂志，751551-6，1994；和Chazenbalk，G.D.，和Rapoport，B.，生物化学杂志2701543-9，1995。在这样的转移载体构建体中，可使用长或短形式的碱性蛋白启动子。此外，转移载体可构建成其中用昆虫蛋白的分泌信号序列取代天然zsig33分泌信号序列的形式。例如，可以在构建体中使用蜕皮类固醇葡糖基转移酶(EGT)、密蜂蜂毒素(Invitrogen，Carlsbad，CA)或杆状病毒gp67(PharMingen，圣地哥，C(A)的分泌信号序列取代天然zsig33分泌信号序列。此外，转移载体还可包括一融合于框架内的DNA，此DNA编码一表位标记，位于所表达的zsig33多肽C-或N-末端，例如Glu-Glu表位标记(Grussenmeyer，T.等，Proc Natl Acad Sci.827952-4，1985)。用本领域已知技术，将含zsig33的转移载体转化进入大肠杆菌，然后筛选其中含被打断的LacZ基因、指示是重组杆状病毒的杆粒。用常规技术分离含重组杆状病毒基因组的杆粒DNA，并用于转染秋粘虫细胞，如Sf9细胞。随后得到表达zsig33的重组病毒。用本领域常用制备重组病毒贮液。
利用重组病毒感染宿主细胞，通常是来自秋粘虫-草地贪夜蛾的细胞系。通常参阅Glick和Pasternak，分子生物技术重组DNA的原理及应用，ASM出版社，华盛顿特区，1994。另一合适的细胞系是来自粉纹夜蛾(美国专利#5,300,435)的High FiveOTM细胞系(Invitrogen)。利用市售无血清培养基培养和维持细胞。对Sf9细胞来说，适合的培养基是Sf900IITM(Life Technotogies)或ESF 921TM(表达系统)，对粉纹夜蛾细胞来说，则为Ex-cell O405TM(JRH Bioscrences，Lenexa，KS)或Gxpress FiveOTM(Life Technologies)。细胞从接种密度2-5×105个细胞生长至1-2×106个细胞的密度，按感染复数为0.1至10(通常大约3)加入重组病毒贮液。通常在感染后12-72小时，重组病毒感染的细胞产生重组zsig33多肽，并以不同的效率分泌至培养基中。常在感染后过48小时收获培养物。通过离心将细胞与培养基(上清液)分离。含zsig33多肽的上清液用微孔滤膜过滤，通常滤膜孔径大小为0.45μm。所用步骤常见于可索要到的实验室手册(King，L.A.和Possee，R.D.，同上；O’Reilly，D.R.等，同上；Richardson，C.D.，同上)中。随后可用本文所述方法完成从上清液中纯化出zsig33多肽的步骤。
真菌细胞，包括酵母细胞，特别是酵母属和毕赤酵母属的细胞，也可用于本发明中，以便例如生产zsig33片段或多肽融合体。用外源DNA转化酵母细胞以及从其生产重组多肽的方法公开于例如Kawasaki，美国专利号4599311；Kawasaki等，美国专利号4931373；Brake，美国专利号4870008；Welch等，美国专利号5037743；和Murray等，美国专利号4845075，此处引用作为参考。通过由选择性标记，通常是抗药性或在缺少特定营养(如亮氨酸)时生长的能力确定的表型来选择转化的细胞。在酵母中可使用的优选载体系统是由Kawasaki等，(美国专利号4931373)公开的POT1载体系统，这一系统允许通过在含葡萄糖的培养基上的生长选择转化的细胞。可在酵母中使用的合适启动子和终止子包括那些来自糖酵解酶基因(见如Kawasaki，美国专利号4 599 311；Kingsman等，美国专利号4 615 974；和Bitter，美国专利号4 977 092，此处引用作为参考)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。也见美国专利号4990446；5063154；5139936和4661454，此处引用作为参考。用于其它酵母，包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、Pichia methanolica和Candida maltosa的转化系统在本领域内已知。参见例如Gleeson等，普通微生物学杂志，1323459-3465，1986和Cregg，美国专利号4 882279。根据McKnight等，美国专利号4 935349的方法可以使用曲霉属细胞，此处引用作为参考。转化Acremonium chrysogenum的方法由Sumino等，美国专利号5162228公开，此处引用作为参考。转化脉孢菌的方法由Lambowitz，美国专利号4486533公开，此处引用作为参考。
根据传统方法，在含有营养物以及选择的宿主细胞生长所需的其它成份的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。许多合适的培养基，包括规定的培养基和复杂培养基，在本领域内是公知的，一般包含碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。如果需要，培养基也可以含有诸如生长因子或血清的成份。生长培养基一般将对含有外加DNA的细胞进行选择，例如通过药物选择或缺乏必需营养物，而这些可以由表达载体所携带的或共转染进宿主细胞的选择性标记来补偿。在含有适当碳源、氮源和微量营养物的培养基中，于大约25-35℃温度下培养P.methanolica。通过常规方式，如晃动小摇瓶或搅拌发酵罐，给液体培养物提供足够的空气。P.methanolica的优选培养基是YEPD[2％D-葡萄糖，2％BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit，MI)，1％BactoTM-酵母提取物(Difco Laboratories)，0.004％腺苷和0.006％L-亮氨酸]。
使用分级分离和/或传统纯化方法及介质可以纯化表达的重组zsig33多肽。硫酸铵沉淀和酸或离液剂抽提可以用来分级分离样品。典型的纯化步骤可以包括羟基磷灰石层析、大小排阻层析、FPLC和反相高效液相层析。合适的阴离子交换介质包括衍生葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特殊性能硅石等。优选的是PEI、DEAE、QAE和Q衍生物，尤其优选的是DEAE Fast-Flow Sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)。典型的层析介质包括用苯基、丁基或辛基衍生化的那些介质，如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl butyl650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯树脂，如Amberchrom CG71(Toso Haas)等。合适的固体支持物包括玻璃珠、硅基树脂、纤维素树脂、琼脂糖珠、交联琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、交联聚丙烯酰胺树脂等，它们在所用的条件下是不可溶的。这些支持物可以用反应性基团进行修饰，使蛋白质可以通过氨基、羧基、硫氢基、羟基和/或碳水化合物组分结合。偶联化学法的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化及碳二亚胺偶联化合法的羧基和氨基衍生物。这些和其它固体介质在本领域内公知并广泛应用，可以从商业供应商获得。将受体多肽与支持物介质结合的方法在本领域内众所周知。特定方法的选择是一种常规设计，部分决定于所选支持物的特性。见例如亲和层析原理和方法，Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
可利用其大小较小和pI较低的性质分离本发明多肽。例如，在低pH时，本发明多肽可与阴离子交换介质结合。其它纯化方法包括通过凝集素亲和层析和离子交换层析纯化糖基化蛋白质(酶学方法，182卷，“蛋白质纯化指南”，M.Deutscher(编辑)，学术出版社，San Diego，1990，529-39页)。此外，可以构建目的多肽和亲和标签(如多聚组氨酸、麦芽糖结合蛋白、免疫球蛋白结构域)的融合体以利于纯化。
也可以有利地使用蛋白质重折叠(和选择性地重氧化)方法。优选纯化蛋白质至＞80％纯度，更优选至＞90％纯度，甚至更优选＞95％，尤其优选的是药学上的纯净状态，即，就污染的大分子、尤其是其它蛋白质和核酸来说，纯度＞99.9％，没有感染和热源因子。优选地，纯化的蛋白质基本上不含其它蛋白，尤其是动物来源的其它蛋白。
也可用化学合成方法制备zsig33多肽或其片段。zsig33多肽可以是单体或多体、糖基化或非糖基化、PEG化(pegylated)或非PEG化、酰胺化或非酰胺化、硫酸化或非硫酸化的，也可以包括或不包括一个起始的甲硫氨酸残基。例如，也可用完全固相合成、部分固相方法、片段缩合或传统的液相合成等方法合成zsig33多肽。优选用固相肽合成法制备此多肽，例如Merrifield，美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)852149，1963中所述方法。用α-氨基端有保护的氨基酸来进行多肽的合成。也用合适的基团保护具不稳定侧链的三功能氨基酸，以阻止在多肽装配中发生非所需要的化学反应。α-氨基保护基团可被选择性地去除，从而允许在氨基末端发生后续反应。去除α-氨基保护基团的条件不会去除侧链保护基团。
α-氨基保护基团是在分步多肽合成领域中已知比较有用的那些基团，包括酰基型保护基团(如甲酰基、三氟乙酰基、乙酰基)、芳香基型保护基团(如生物素)、芳香族尿烷型保护基团〔如苄氧羰基(Cbz)、取代的苄氧羰基和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)〕、脂族尿烷保护基团〔如叔丁基氧羰基(tBoc)、异丙基氧羰基、环己基氧羰基〕和烷基型保护基团(如苯甲基、三苯甲基)。优选的保护基团是tBoc和Fmoc。
所选择的侧链保护基团必须在偶联过程中保持完整，且在氨基端保护基团的脱保护过程中或偶联条件下不会被去除。合成完成后，侧链保护基团也必须是能在不会改变已合成好的多肽的反应条件下被去除。在tBoc化学法中，三功能氨基酸的侧链保护基团大多数情况下是基于苯甲基的基团。在Fmoc化学法中，则大多数情况下是基于叔丁基或三苯甲游基的基团。
在tBoc化学方法中，优选的侧链保护基团对精氨酸来说是甲苯磺酰基，对天冬氨酸来说是环己基，对半胱氨酸来说是4-甲基苄基(和乙酰氨基甲基)，对谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸来说是苯甲基，对组氨酸来说是苄氧甲基(和二硝基苯基)，对赖氨酸来说是2-氯苄氧羰基，对色氨酸来说是甲酰基，对酪氨酸来说是2-溴苯甲基。在Fmoc化学方法中，优选的侧链保护基团有，用于精氨酸的2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pme)或2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基(pbf)，用于天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺和组氨酸的三苯甲游基，用于天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的叔丁基，用于赖氨酸和色氨酸的tBoc。
为了合成磷酸肽，可以直接也可在装配后掺入磷酸基团。在直接掺入的方法中，可在Fmoc化学中用甲基、苯甲基或叔丁基或者在tBoc化学中用甲基、苯甲基或苯基来保护丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸上的磷酸基团。在Fmoc化学中也可用无磷酸基保护的磷酸酪氨酸进行直接掺入。在装配后掺入的这一方法中，将丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸中未被保护的羟基在固相上用二叔丁基、二苯甲基或二甲基-N，N′-二异丙基亚磷酰胺进行衍生化，然后用叔丁基氢过氧化物氧化。
经常通过将α-氨基被保护(侧链保护)的氨基酸偶联到合适的固体支持物上，从羧基端开始进行固相合成。当氨基酸附着到氯甲基、氯三苯甲游基或羟甲基树脂上时，形成酯键，产生的多肽将在C-末端有一游离羧基。或者，当使用酰胺树脂，如二苯甲基胺或对甲基二苯甲基胺树脂(对tBoc化学法而言)和Rink酰胺或PAL树脂(对Fmoc化学法而言)时，就形成了酰氨键，产生的多肽在C-末端有一羰基酰氨基。这些树脂，无论是基于聚苯乙烯或聚酰胺的或聚乙二醇接枝的，有或无柄或接头的，第一个氨基酸有或无附着，都可购买到，它们的制备可参阅Stewant等，《固相多肽合成》(第二版)、(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL，1984)和Bayer & Papp Chem.Rept.Prot.33(1986)；和Ath erton等，固相肽合成实用入门，IRL出版社，牛津，1989。
若侧链保护是必需的，则用各种活化剂，包括二环己基碳二亚胺(DCC)、N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)和羰基二咪唑(carbonyldiimidazole，CDI)，将侧链被保护(必要的话)和α-氨基被保护的C-末端氨基酸附着到羟甲基树脂上。它可以其三甲基氨化铯的盐形式或有三乙胺(TEA)或二异丙基乙基胺(DIEA)存在的条件下直接附着到氯甲基或氯三苯甲游基树脂上。第一个氨基酸附着到酰胺树脂上的过程与偶联反应中酰胺键的形成相同。
附着到树脂支持物之后，根据保护作用的化学原理(如tBoc，Fmoc)使用不同的试剂去除α-氨基保护基团。Fmoc去除的程度可以在300-320nm或通过传导性元件监控。去除了α-氨基保护基团之后，以要求的顺序逐步偶联剩余的被保护氨基酸，得到想要的序列。
有很多激活剂可用于偶联反应，包括DCC，DIPCDI，六氟磷酸2-氯-1，3-二甲基亚氨鎓(2-chloro-1，3-dimethylimidinmhexafluorophosphate，CIP)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧-三(二甲基氨基)鏻[benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphate，BOP]和它的吡咯烷类似物(PyBOP)，六氟磷酸溴-三吡咯烷鏻(bromo-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphate，PyBroP)，六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓[O-(benzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphate，HBTU]和它的四氟硼酸盐类似物(TBTU)或它的吡咯烷类似物(HBPyU)，六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓[O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyl-uroniumhexafluorophosphate，HATU]和它的四氟硼酸盐类似物(TATU)或它的吡咯烷类似物(HAPyU)。偶联反应中最常用的催化性添加剂包括4-二甲氨基吡啶(DMAP)，3-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HODhbt)，N-羟基苯并三唑(HOBt)和1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)。每种被保护的氨基酸都是过量使用(＞2.0当量)，且偶联通常在N-甲基吡咯烷酮(NMP)或DMF、CH2Cl2或它们的混和物中进行。偶联反应完成的程度可以在每一阶段监控，如通过Kaiser等人(分析生物化学，34595，1970)所述的茚三酮反应进行监控。
想要的肽装配完全之后，用含合适清除剂的试剂切割肽-树脂。Fmoc肽通常用含清除剂(如水，乙二硫醇，苯酚和茴香硫醚)的TFA切割和去保护。tBoc肽通常用液态氟化氢在-5～0℃切割和去保护1～2小时，这样从树脂上切下多肽并除去了大部分侧链保护基团。清除剂如苯甲醚，甲硫醚和甲苯硫酚通常与液态氟化氢一起使用，以防止切割过程中形成的阳离子使多肽中的氨基酸残基发生烷化和酰化。色氨酸的甲酰基和组氨酸的二硝基苯基需要在用氟化氢切割之前分别用溶于DMF的哌啶和苯硫基除去。半胱氨酸的乙酰氨基甲基可以用醋酸汞(II)除去，或者用碘、三氟乙酸铊(III)或四氟硼酸银除去，它们同时氧化半胱氨酸成胱氨酸。其它用于tBoc肽切割和去保护的强酸有三氟甲磺酸(TFMSA)和三甲基甲硅烷基三氟乙酸(TMSOTf)。
此项发明的分子的活性可以用多种试验，通过测定对胃肠细胞收缩的刺激，对营养物摄入的调节和/或消化酶的分泌而确定。尤为有用的是测定平滑肌细胞收缩性的变化，例如哺乳动物十二指肠段或其它胃肠平滑肌组织的收缩反应(Depoortere等人，胃肠运动杂志，1989年第1卷第150-159页，此处引作参考文献)。一个示例性的体内试验中使用超声千分尺测量接触面间径向的尺寸变化和到基值平面纵向的尺寸变化(Hansen等人，胸腔外科医生学会，1995年第60卷第384-390页)。
胃运动在临床上通常是测定胃排空(gastric emptying)所需时间和其后通过胃肠道的传送时间(transit time)。胃空造影扫描对本领域技术人员是熟知的，简单的说，就是使用口服反差剂，诸如钡餐，或放射性标记。固体和液体可以独立检测。检测用的食物或液体用同位素(如99mTc)放射性标记，注射或服用之后，用伽玛摄像机可视化测定通过胃肠道的传送时间和胃排空情况(Meyer等人，Am.J.Dig.Dis.1976年第21卷第296页；Collins等人，肠，1983年第24卷第1117页；Maughan等人，糖尿病医学，139增刊5S6-10，1996；和Horowitz等人，Arch.Intern.Med.，1451467-1472，1985)。这些研究可以在服用促动剂以量化药物的功效之前和之后进行。
测定zsig33多肽影响细胞增殖或分化能力的试验在本领域中是熟知的。例如，测量增殖的试验包括诸如对中性红染料的化学敏感性(Cavanaugh等人，新药调查(Investigational New Drugs)8347-354，1990，此处引作参考文献)，放射性标记核苷酸的掺入(Cook等人，分析生化，1791-7，1989，此处引作参考文献)，在增殖细胞的DNA中掺入5-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)(Porstmann等人，免疫学方法杂志，82169-179，1985，此处引作参考文献)和四唑鎓盐的使用(Mosmann，免疫学方法杂志，6555-63，1983；Alley等人，癌症研究，48589-601，1988；Marshall等人，生长调节(Growth Reg.)，569-84，1995；Scudiero等人，癌症研究，484827-4833，1988；此处均引作参考文献测量分化的试验包括例如测量与组织阶段特异表达相关的细胞表面标记、酶活性，功能活性或形态变化(Watt，FASEB，-5281-284，1991；Francis，分化，5763-75，1994；Raes，Adv.Anim.Cen Biol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989；均在此处引作参考文献)。
可进行试验，以测量其它细胞反应，包括趋化性、粘附、离子通道流入量的变化、第二信使水平的调节和神经递质的释放。这些试验在本领域中是熟知的。参阅，例如，Basic & Clinical EndocrinologySer.第3卷，细胞化学生物试验技术和应用，Chayen；Chayen，Bitensky编，Dekker，纽约，1983年。
从观察到的zsig33的组织分布的观点看，激动剂(包括天然配基/底物/辅助因子/等)和拮抗剂在体外和体内应用中都有巨大潜力。确认为zsig33激动剂的化合物在体外和体内促进刺激胃肠细胞收缩性、调节营养物摄入和/或分泌消化酶方面很有用。例如，激动剂化合物可用作确定的细胞培养基的成分，能有效调节营养的吸收，因此可用于特异性促进胃肠细胞如G细胞，肠嗜铬细胞和胃、十二指肠、近端空肠、窦房和基底上皮粘膜的生长和/或发育。
胃肠-脑肽家族已经与神经病学和CNS功能联系起来了。例如，已证明NPY这种在脑和肠中都有受体的肽，当施予中枢神经系统时会刺激食欲(Gehlert，生命科学，55(6)551-562，1994)。已在脑的不同区域(特别是小脑)和垂体中鉴定到了促胃动素的免疫反应性(Gasparini等人，人类遗传学，94(6)671-674，1994)。已经发现，促胃动素在小脑中与神经递质γ-氨基丁酸共存[Chan-Patay，英国药学会第50届年会论文集(Proc.Sym.50thAnniv.Meet.Br.Pharmalog.Soc.)1-24，1982]。生理学研究已经提供了一些证据表明，促胃动素对进食行为(Rosenfield等人，生理学行为，39(6)735-736，1987)、膀胱控制、垂体生长激素释放有影响。其它胃肠-脑肽，如CCK，脑啡肽，VIP和促胰液素，除了在消化系统中有活性外，还显示与血压、心率、行为和疼痛调节有关。因此，zsig33或其某部分预计存在某些神经病学上的联系。
利用本发明氨基酸和DNA序列内的位点特异性突变，可以制得一些类似物，它们可以是拮抗剂、激动剂或部分激动剂(Macielay等人，肽化学与结构生物学，659，1996)。拮抗剂可用于胃肠运动过度的临床紊乱中，如腹泻和Crohn症。拮抗剂在鉴定配体-受体相互作用位点时可用作研究试剂。
zsig33配体结合多肽还可用于纯化配体。将多肽固定在固体支持物上，如琼脂糖珠、交联琼脂糖、玻璃、纤维素树脂、二氧化硅树脂、聚苯乙烯、交联聚丙烯酰胺，或在使用条件下比较稳定的类似材料。将多肽连接到固体支持物上的方法在本领域中是熟知的，包括胺化学法、溴化氰活化，N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化和酰肼活化。将产生的介质制成柱，使含配体的液体过柱一遍或多遍，以使配体结合到受体多肽上。然后用不同盐浓度、离液剂(盐酸胍)或pH破坏配体-受体的结合，以洗脱配体。
使用配体结合受体(或抗体，互补物/反互补物对之一)或其结合片段的试验系统和市售生物感应器装置(BIAcoreTM，PharmaciaBiosensor，Piscataway，NJ)可有效地被应用。将这些受体、抗体、互补物/反互补物对的成员或片段固定在接受片的表面上。Karlsson，免疫学方法杂志，415229-40，1991；和Cunningham与Wells，分子生物学杂志，234554-63页，1993，介绍了这种装置的使用。使用胺或巯基化学方法，将受体、抗体、成员或片段共价结合到吸附在流动槽内金膜上的葡聚糖纤维上。使待测样品流经小槽。如果样品中存在配体、表位或互补物/反互补物对的另一成员，它们就会相应地与固定化的受体、抗体或成员结合，引起介质折射率的改变，这种改变可检测为金膜表面细胞质基因组共振。此系统可测定结合和解离速率，由此可计算结合亲和力并评估结合的化学计量学。
配体结合受体多肽还可用于本领域已知的试验系统中。这些系统包括测定结合亲和力的Scatchard分析(参阅Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.，51660-72，1949)和量热法分析(Cunningham等人，科学，253545-48，1991；Cunningham等人，科学，245821-25，1991)。
zsig33多肽也可以用于制备与zsig33表位、肽或多肽可特异结合的抗体。制备多克隆和单克隆抗体的方法在本领域内是公知的(见如Sambrook等，分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港，纽约，1989；和Hurrell，J.G.R.编辑，单克隆杂交瘤抗体技术和应用，CRC出版公司，Boca Raton，FL，1982，此处引用作为参考)。多克隆抗体可以从许多温血动物如马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠和大鼠中产生，这一点对本领域普通的技术人员是很明显的。
通过使用佐剂如明矾(氢氧化铝)或者弗氏完全或不完全佐剂，可以增加zsig33多肽的免疫原性。可用于免疫接种的多肽也包括融合多肽，如zsig33或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白的融合体。多肽免疫原可以是全长分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”，为了进行免疫，此部分可以有利地与大分子载体[如匙孔虫血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素]连接。
如本文所述，术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段如F(ab′)2和Fab蛋白水解片段。也包括基因工程化的完整抗体或片段，如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等，以及合成的抗原结合肽和多肽。通过只将非人类CDR接枝到人框架和稳定区，或通过掺入整个非人可变结构域(可选地通过置换暴露的残基而用人样表面选择性“覆盖”它们，其中结果是产生了“被覆盖的”抗体)，可以使非人抗体人源化。在一些例子中，人源化抗体可以在人可变区域框架区内保留非人残基，以加强正确的结合特性。通过使抗体人源化，可以提高生物半衰期，并且在用于人体时减少不利免疫反应的可能。此处对于产生或选择抗体有用的其它技术包括体外使淋巴细胞与zsig33蛋白或肽接触以及对噬菌体或类似载体中的抗体展示文库进行筛选(例如，通过固定的或标记的zsig33蛋白或肽的使用)。
如果抗体与zsig33多肽以106M-1或更高的、优选地107M-1或更高、更优选地108M-1或更高、最优选109M-1或更高的结合亲和性(K(a)结合，那么抗体定义为特异性结合。抗体结合亲和性很容易由本领域普通技术人员测定出来(如通过Scatchard分析)。
本领域技术人员已知的许多实验可以用于检测能与zsig33蛋白或肽特异结合的抗体。典型的实验在《抗体实验室手册》(Harlow和Lane(编辑)，冷泉港实验室出版社，1988)中得到具体描述。这些实验的代表性例子包括共存的免疫电泳、放射免疫试验、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附实验(ELIS(A)、点杂交或Western杂交实验、抑制或竞争实验，和三明治实验。此外，也可以通过与野生型相对于与突变型zsig33蛋白或肽的结合而筛选抗体。
针对zsig33的抗体可以用于标记表达zsig33的细胞；通过亲和纯化分离zsig33；用于测定zsig33多肽循环水平的诊断分析；检测或定量测定可溶的zsig33作为潜在病理学或疾病的标记；采用FACS的分析方法中；筛选表达文库；制备抗独特型抗体；以及作为中和抗体或拮抗剂而体外和体内阻断zsig33活性。合适的直接标签或标记包括放射性核素、酶、底物、辅因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁粒子等；间接标签或标记涉及使用生物素-抗生物素蛋白或其它互补物/反互补物对作为中间体。此处抗体也可以直接或间接与药物、毒素、放射性核素等等偶联，并且将这些偶联物用于体内诊断或治疗应用。
本发明的分子可以用于鉴定和分离介导zsig33功能的受体。例如将本发明的蛋白质和肽固定在柱上，并使膜制品流过柱子(《固定的亲和配体技术》，Hermanson等，编辑，学术出版社，San Diego，CA，1992，195-202页)。也可以对蛋白质和肽进行放射性标记(《酶学方法》，182卷，“蛋白质纯化指南”，M.Deutscher编辑，学术出版社，San Diego，1990，721-737)或光亲和标记(Brunner等，生物化学年鉴，62483-514，1993和Fedan等，生物化学药理学，331167-1180，1984)，并可以鉴定特异的细胞表面蛋白。
本发明多肽、核酸和/或抗体也可用于下述疾病的治疗中与胃肠细胞收缩、消化酶和酸分泌、胃肠运动、消化酶的补充相关的疾病；炎症，特别是当其会影响胃肠系统时；逆流疾病和营养物摄入的调节。用本发明分子治疗可受益的一些具体疾病包括有、但不限于糖尿病性胃轻瘫，手术后的胃轻瘫，迷走神经切断术，慢性特发性假肠梗阻和胃食管逆流疾病。其它应用包括进行胃排空以进行放射性研究，刺激胆囊收缩和窦切除术。
本发明分子的运动和神经病学效果使之可用于治疗肥胖症及其中神经病学性逆流影响了营养物摄入的其它代谢性疾病。本发明分子可用于调节饱腹感、葡萄糖吸收和代谢，以及神经病理相关性胃肠疾病。
本发明分子也可用作含葡萄糖的抗低血糖制剂添加剂，以及需要快速营养作用的口服药物的吸收增强剂。此外，本发明分子还可用来刺激葡萄糖诱导的胰岛素释放。
对于药物使用，可以根据传统方法配制本发明的蛋白质，以用于胃肠外、鼻吸入，尤其是静脉内或皮下送递。静脉内施用是通过一至几小时的典型时段进行大量注射或注入。总的来说，药物配方中将包括与药学上可接受载体如盐水、缓冲盐水、水中5％葡萄糖等结合的zsig33蛋白。配方中可以进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止在小瓶表面发生蛋白丢失的白蛋白等。配方的方法在本领域是熟知的，并显示在如Remington′s药物科学，Gennar，编辑，Mack出版公司，Easton PA，1990中，此处作为参考引入。治疗剂量一般是每天在0.1-100μg/kg患者体重范围内，优选每天0.5-20μg/kg，精确剂量由临床大夫根据普遍接受的标准，并考虑待治疗疾病的本性和严重性、患者特性等等来确定。剂量的确定在本领域普通技术的水平内。可以施用蛋白质进行急性治疗，经一周左右，经常经一至三天左右时间，或用于慢性治疗，经过几个月或几年。例如，zsig33的治疗有效量是足以使胃运动及用来衡量营养物摄入变化情况的参数发生临床上比较显著的变化的量。这类测量的具体检测方法对本领域熟练技术人员是熟知的。
通过下面非限制性实施例进一步说明本发明。
实施例实施例1搜索cDNA资料库中含分泌序列的cDNA，发现有一段表达序列标记(EST)与促胃动素有同源性。cDNA来自人胎儿胰脏cDNA文库。
通过对该EST来源的cDNA进行序列分析，确定了该EST序列。此cDNA包含于质粒中，由克隆位点切下来。分析显示该cDNA包含了编码zsig33的DNA的整个编码区。
实施例2使用Clontech公司(Palo Alto，CA)的人类多种组织印迹和人类RNAMaster点印迹进行Northern杂交。探针是约40个碱基对的寡核苷酸ZC12，494(SEQ ID NO5)。使用T4多核苷酸激酶(Life TechnologiesInc.，Gaithersburg，MD)和T4多核苷酸激酶反应缓冲液(Life Technologies，Inc.)对探针进行末端标记。使用NUCTRAP(Stratagene，La Jolla，CA)推进柱纯化探针。使用EXPRESSHYB(Clontech)溶液进行预杂交，并作为Northern印迹术的杂交溶液。杂交在42℃进行，各印迹用2×SSC和0.05％SDS在室温下洗涤，接着用1×SSC和0.1％SDS在71℃洗涤。观察到胃样品有一个约600bp的转录物的强信号，而胰和小肠样品有较弱信号。
实施例3取两只雄性Sprague-Dawley大鼠，约12周龄(Harlan，Indianapolis，IN)，用尿烷麻醉后，由一个小的腹部切口暴露它们的胃。将两粒2.4毫米大小的转导晶体(Sonometrics，Ontario，Canada)安置在胃窦部，这样可将环形收缩测定为两粒晶体间距离的变化。晶体用VETBONDTISSUE ADHESIVE(3M，S.t Paul，MN)粘附上去。
将10μl 1μM乙酰胆碱局部施加于两晶体间的胃部后，两晶体间的距离发生急速但短暂的增加。10μl 1μM去甲肾上腺素(NE)引起两晶体间距离减小。去甲肾上腺素引起的距离减小的幅度大约是乙酰胆碱引起的增加的50％。两种反应都比较短暂。
将阴性对照-10μl磷酸盐缓冲液(PBS)局部施加于晶体间，没有作用。
zsig33的一段14氨基酸肽[SEQ ID NO2从氨基酸残基24(Gly)至氨基酸残基37(Gln)]溶于磷酸盐缓冲液，局部施加10微升，使终浓度达到1μg、10μg或100μg。1微克zsig33引起持续的、节律性的增大和减小。当检验10微克和100微克浓度时，效果呈现剂量依赖性，反应的速率和幅度都有所增强。
实施例4取八只雌性ob/ob小鼠，约6周龄(Jackson实验室，Bar Harbor，ME)，用两周时间使它们适应每天4小时的喂养日程表。以喂养日程表喂养两周之后，在它们就餐后，紧接着以口服管饲法给小鼠服用100微克溶于100微升无菌0.1％BSA的14氨基酸zsig33肽(SEQ ID NO2从第24位氨基酸残基甘氨酸至第37位氨基酸残基谷氨酰胺)。30分钟后，给小鼠口服0.5毫升25％葡萄糖进行激发。然后眼窝取血，以测定血清中葡萄糖水平。在服用zsig33之前，口服葡萄糖激发之前，和葡萄糖/激发之后1、2、4和20小时时取血样。
口服葡萄糖刺激之前30分钟，口服zsig33肽100微克时，观察到有增强的餐后葡萄糖吸收现象。
实施例5用431A型肽合成仪(Applied Biosystems/Perkin Elmes，Foster City，CA)以固相肽合成法合成zsig33-1，即相当于SEQ ID NO2的第24位氨基酸残基甘氨酸至第37位氨基酸残基谷氨酰胺的肽。以Fmoc-谷氨酰胺树脂(0.63mmol/g，Advanced Chemtech，Louisville，KY)作为起始支持树脂。用1mmol氨基酸柱体(Anaspec，Inc.San Jose，CA)进行合成。六氟磷酸2-(苯并三唑)-1-基-1，1，3，3-四甲基脲鎓(HBTU)，1-羟基苯并三唑(HOBt)，2m N，N-二异丙基乙基胺，N-甲基吡咯烷酮，二氯甲烷(都购自Applied Biosystems/Perkin Elmer)和哌啶(Aldrich ChemicalCo.，St.Louis，MO)的混合物被用作合成试剂。
用Peptide Companion软件(Peptides International，Louisuille，KY)预测zsig33-1肽合成的聚集趋势和困难程度。依照生产商的详细说明，用单偶联程序进行合成。
按照标准TFA切除步骤(依照肽切割手册，AppliedBiosystems/Perkin Elmer)，从固相上切下肽。用C18、10μm半制备性柱(Vydac，Hesperial，CA)，通过RP-HPLC纯化肽。收集从柱上洗脱的各级分，用电子喷雾质谱仪分析正确的分子量和纯度。收集了两槽洗脱物。质谱分析结果表明两槽都含有纯化形式的zsig33，分子量为1600道尔顿。这即是预期的分子量，所以将两槽合并，冷冻并冻干。
实施例6使用市售“基因桥4放射杂交组”(GeneBridge 4 Radiation HybridPanel)(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)，zsig33被定位于染色体3上。基因桥4放射杂交组含有来自93个放射杂交克隆的DNA，再加上两个对照DNA(HFL供体和A23受体)。一个可公共获得的www网址(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)允许相对于Whitehead研究所/MIT中心而对基因组研究所的人类基因组图谱(“WICGR”放射杂交图谱)作图，而基因组研究所的放射杂交图谱是用基因桥4放射杂交组建立起来的。
为了用“基因桥4放射杂交组”进行zsig33的作图，在96-孔微滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)中建立20μl反应，并在“RoboCyclerGradient 96”热循环仪(Stratagene)中用于PCR。95个PCR反应的每一个含有2μl 10x Klentaq聚合酶反应缓冲液(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)、1.6μl dNTPs混合液(每种2.5mM；Perkin-Elmer，FosterCity，CA)、1μl有义引物和1μl反义引物、2μl“RediLoad”(ResearchGenetics，Inc.，Huntsville，AL)、0.4μl“Advantage Klentaq聚合酶混合液”(Clontech Laboratories，Inc.)、来自每个杂交克隆或对照的25ng DNA，以及ddH2O，总体积20μl。反应用等量矿物油覆盖并封闭。PCR循环条件如下95℃5分钟的一个初始循环，95℃变性1分钟、64℃退火1分钟和72℃延伸1.5分钟，35个循环，接着最后一个循环是72℃延伸7分钟。反应物在3％NuSieve GTG琼脂糖凝胶(FMC Bioproducts，Rockland，ME)上通过电泳分离。
结果显示，zsig33定位于WICGR第3号染色体的放射杂交图上，距离该染色体上的框架标记AFMA216ZG1为10.43cR-3000处。近端和远端框架标记分别是AFMA216ZG1和D3S1263。借助于周围的标记，将zsig33定位于完整LDB染色体3图谱(The Genetic Location Database，University of Southhampton，www网址http//cedar.genetics.soton.ac.uk/public-html/)上的3p26.1区。
实施例7评估局部施用zsig33肽(SEQ ID NO2的第24位至第37位氨基酸)对酚红通过禁食的雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis，IN)的胃部的影响。6只8周龄的大鼠在禁食24小时后，用尿烷(0.5ml/100g的25％溶液)麻醉。麻醉之后，用口服管饲法给大鼠喂以1毫升酚红溶液(50mg/ml，于2％甲基纤维素溶液中)。
以一个腹部小切口暴露大鼠的胃，管饲5分钟之后，在胃部局部施用1微克zsig33肽或随机序列的14氨基酸肽对照。测量管饲后30分钟胃容物提取物的光密度，以测定酚红在胃部的残余量。
相比于随机肽对照，zsig33肽将胃部酚红残余量减少了约25％，表明zsig33肽增强了这些大鼠的胃排空。
实施例8取16只8周龄的雌性ob/ob小鼠(Jackson Labs，Bar Harbor，ME)，用2周时间使它们适应特殊的每天4小时的喂养日程表。这些大鼠在每天上午7:30-11:30间任意喂料。以此喂养日程表喂养两周之后，小鼠被分成两组，每组8只。在取食之前和4小时喂料时间结束时，以管饲法给一组小鼠每只口服1.0微克溶于100微升无菌0.1％BSQA的zsig33-1(14个氨基酸的肽)，另一组服用对照(14个氨基酸的随意序列的肽)。小鼠每天注射两次，并测量每天的食物获取量和体重，这样进行了14天。在第14天，第二次管饲法口服zsig33-1肽之后，紧接着给小鼠口服0.5毫升25％葡萄糖进行刺激。在给予zsig33-1肽或对照之前(t＝30分钟)和服用葡萄糖后过0、1、2、和4小时，从后眼窝取血以测定血清葡萄糖水平。
结果表明，当每只小鼠口服给以1微克zsig33-1时，对每天体重或食物获取量或葡萄糖清除情况没有影响，正如第14天测定的那样。
实施例9A.胃肠组织Northern印迹用下列来源的mRNA进行Northern印迹1.来自人结肠腺癌细胞系SW480的RNA(Clontech，Palo Alto，CA)2.来自人小肠组织的RNA(Clontech)3.来自人胃组织的RNA(Clontech)4.人肠平滑肌细胞系(Hism；ATCC No.CRL-1692；美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD)5.正常人结肠细胞系(FHC；ATCC No.CRL-1831；美国典型培养物保藏中心)6.正常人胎儿小肠细胞系(FHs 74 Znt.；ATCC No.CCL 241；美国典型培养物保藏中心)用酸胍法(Chomczynski等人，分析生化，162156-159，1987)，从Hism、FHC和FHs74 Int.中分离总RNA。用能保留polyA+RNA的层析柱对总RNA进行洗脱，选择出polyA+RNA(Aviv等人，proc.Nat.Acad.Sci.69.1408-1412，1972)。用1.5％琼脂糖凝胶，在2.2M甲醛和磷酸盐缓冲液中电泳，从每种样品中分离得到2微克polyA+RNA。将RNA在20×SSC中过夜转移到Nytran膜(Schleicher and Schuell，Keene，NH)上。印迹用UV Stratalinker 2400(Stratagene，La Jolla，(A)以0.12焦耳处理。然后将印迹在80℃烘烤1小时。
经PCR扩增得到的zsig33全长cDNA(见SEQ ID NO1)约50μg和42.5μl水用Rediprime pellet试剂盒(Amersham，Arlington Heights，IL)，依照生产商的详细说明，用33dCTP放射性标记。印迹在EXPRESSHYB(Clontech)中55℃杂交过夜。印迹在室温下用2×SSC和0.1％SDS清洗，接着在65℃用2×SSC和0.1％SDS清洗，最后在65℃用0.1×SSC和0.1％SDS清洗。结果显示，zsig33与胃RNA杂交上了，而与其它组织来源的RNA未能杂交上。
B.肿瘤Northern杂交用Northern TerritoryTM-人肿瘤组印迹II(Human Tumor PanelBlot II)(Invitrogen，San Diego，CA)和Northern TerritoryTM-人胃肿瘤组印迹(Human Stomach Tumor Panel Blot)(Invitrogen)分析zsig33RNA的表达模式。
人肿瘤组印迹每道含20微克总RNA，在1％变性甲醛凝胶中电泳。印迹中所含RNA来自食道肿瘤，正常食道，胃肿瘤，正常胃，结肠肿瘤，正常结肠，直肠肿瘤和正常直肠。胃肿瘤组印迹含有分离自4位不同提供者的正常组织的总RNA。每样品道用20微克RNA，各道交替为来自每位提供者的正常和肿瘤样品。
准备约40bp的寡核苷酸ZC12，494(SEQ ID NO5)作为探针。探针用T4多核苷酸激酶(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)和T4多核苷酸激酶反应缓冲液(Life Technologies Inc.)末端标记。用NUCTRAP推进柱(Stratagene，La Jolla，CA)纯化探针。肿瘤印迹和胃印迹用相同方法处理。EXPRESSHYB溶液(Clontech)被用于预杂交和Northern杂交的杂交溶液。杂交在42℃下进行，印迹用0.1×SSC和0.01％SDS在60℃下清洗，接着用0.1×SSC和0.1％SDS在70℃下清洗一次。结果清楚说明，zsig33在人肿瘤组和人胃肿瘤组中都只在正常胃组织中表达。
从以上叙述可意识到，尽管为了举例说明，而在此处描述了本发明的一些具体实施方案，但还是可以做许多改进而不偏离本发明的精神和范围的。因此，本发明范围只由所附权利要求确定，而不受其它限制。
序列表(1)基本信息(i)申请人ZymoGenetics，Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattle，WAUSA98102(ii)发明名称促胃动素同系物(iii)序列数目7(iv)联系地址(A)收件人ZymoGenetics，Inc.
(B)街道1201 Eastlake Avenue East(C)城市Seattle(D)州名WA(E)国家USA(F)邮政编码98102(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM兼容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ，Windows版本2.0(vi)目前申请资料(A)申请号(B)递交日(C)分类(vii)在先申请资料(A)申请号
(B)递交日(viii)代理人/代理信息(A)姓名Sawislak，Deborah A(B)登记号37,438(C)参考/文档号97-04PC(ix)电信信息(A)电话206-442-6672(B)传真206-442-6678(C)电传(2)关于SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度351个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词编码序列(B)位置1...351(D)其它信息(ix)特征(A)名称/关键词信号肽(B)位置1...69(D)其它信息(ix)特征(A)名称/关键词成熟肽(B)位置70...351(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO1
ATG CCC TCC CCA GGG ACC GTC TGC AGC CTC CTG CTC CTC GGC ATG CTC48Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15TGG CTG GAC TTG GCC ATG GCA GGC TCC AGC TTC CTG AGC CCT GAA CAC96Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30CAG AGA GTC CAG CAG AGA AAG GAG TCG AAG AAG CCA CCA GCC AAG CTG144Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45CAG CCC CGA GCT CTA GCA GGC TGG CTC CGC CCG GAA GAT GGA GGT CAA192Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60GCA GAA GGG GCA GAG GAT GAA CTG GAA GTC CGG TTC AAC GCC CCC TTT240Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80GAT GTT GGA ATC AAG CTG TCA GGG GTT CAG TAC CAG CAG CAC AGC CAG288Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95GCC CTG GGG AAG TTT CTT CAG GAC ATC CTC TGG GAA GAG GCC AAA GAG336Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110GCC CCA GCC GAC AAG351Ala Pro Ala Asp Lys115(2)关于SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度117个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO2
Met Pro Ser Pro Gly Thr Val Cys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Met Leu1 5 10 15Trp Leu Asp Leu Ala Met Ala Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His20 25 30Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu35 40 45Gln Pro Arg Ala Leu Ala Gly Trp Leu Arg Pro Glu Asp Gly Gly Gln50 55 60Ala Glu Gly Ala Glu Asp Glu Leu Glu Val Arg Phe Asn Ala Pro Phe65 70 75 80Asp Val Gly Ile Lys Leu Ser Gly Val Gln Tyr Gln Gln His Ser Gln85 90 95Ala Leu Gly Lys Phe Leu Gln Asp Ile Leu Trp Glu Glu Ala Lys Glu100 105 110Ala Pro Ala Asp Lys115(2)关于SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度546个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(A)名称/关键词编码序列(B)位置40...396(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO3GGGCAGAGAC ACACACGCGC CCAGTTGTCC AGCTCCAGG ATG GTG TCC CGC AAG 54Met Val Ser Arg Lys1 5GCT GTG GTC GTC CTG CTG GTG GTG CAC GCA GCT GCC ATG CTG GCC TCC102Ala Val Val Val Leu Leu Val Val His Ala Ala Ala Met Leu Ala Ser10 15 20
CAC ACG GAA GCC TTT GTT CCC AGC TTT ACC TAC GGG GAA CTT CAG AGG150His Thr Glu Ala Phe Val Pro Ser Phe Thr Tyr Gly Glu Leu Gln Arg25 30 35ATG CAG GAA AAG GAG CGG AAT AAA GGG CAA AAG AAA TCC CTG AGT GTC198Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln Lys Lys Ser Leu Ser Val40 45 50CAG CAG GCG TCG GAG GAG CTC GGC CCT CTG GAC CCC TCG GAG CCC ACG246Gln Gln Ala Ser Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asp Pro Ser Glu Pro Thr55 60 65AAG GAA GAA GAA AGG GTG GTT ATC AAG CTG CTC GCG CCT GTG GAC ATT294Lys Glu Glu Glu Arg Val Val Ile Lys Leu Leu Ala Pro Val Asp Ile70 75 80 85GGA ATC AGG ATG GAC TCC AGG CAG CTG GAA AAG TAC CGG GCC ACC CTG342Gly Ile Arg Met Asp Ser Arg Gln Leu Glu Lys Tyr Arg Ala Thr Leu90 95 100GAA AGG CTG CTG GGC CAG GCG CCG CAG TCC ACC CAG AAC CAG AAT GCC390Glu Arg Leu Leu Gly Gln Ala Pro Gln Ser Thr Gln Asn Gln Asn Ala105 110 115GCC AAG TAACAGGCCG CTGGGGGAGA AGGAGGACAC AGCTCGGACC CCCCTCCCAC GC 448Ala LysAGGGAGGGCC TAGAAATCCG CTGGGCTTGG AAGGAAAACA CCCTCTCCCA AACAGCCCTC 508AGCCCCCCTC CCCCAGCAAA TAAAGCGTGG AAATAGGC 546(2)关于SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度119个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(v)片段类型内部的(xi)序列描述SEQ ID NO4
Met Val Ser Arg Lys Ala Val Val Val Leu Leu Val Val His Ala Ala15 10 15Ala Met Leu Ala Ser His Thr Glu Ala Phe Val Pro Ser Phe Thr Tyr20 25 30Gly Glu Leu Gln Arg Met Gln Glu Lys Glu Arg Asn Lys Gly Gln Lys35 40 45Lys Ser Leu Ser Val Gln Gln Ala Ser Glu Glu Leu Gly Pro Leu Asp50 55 60Pro Ser Glu Pro Thr Lys Glu Glu Glu Arg Val Val Ile Lys Leu Leu65 70 75 80Ala Pro Val Asp Ile Gly Ile Arg Met Asp Ser Arg Gln Leu Glu Lys85 90 95Tyr Arg Ala Thr Leu Glu Arg Leu Leu Gly Gln Ala Pro Gln Ser Thr100 105 110Gln Asn Gln Asn Ala Ala Lys115(2)关于SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度40个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型其它(vii)直接来源(B)克隆ZC12494(xi)序列描述SEQ ID NO5TTCTTCGACT CCTTTCTCTG CTGGACTCTC TGGTGTTCAG40(2)关于SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链
(D)拓扑结构线形(vii)分子类型无(xi)序列描述SEQ ID NO6Glu Xaa Gln Arg Xaa Gln1 5(2)关于SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线形(vii)分子类型无(xi)序列描述SEQ ID NO7Ala Pro Xaa Asp Xaa Gly Ile1 权利要求
1.编码多肽的分离多核苷酸分子，其选自(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至111位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)和(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列。
2.编码多肽的分离多核苷酸分子，其选自(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至120位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列。
3.编码多肽的分离多核苷酸分子，其选自(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至351位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列。
4.编码多肽的分离多核苷酸分子，其选自(a)包含如SEQ ID NO1的第1位至111位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列。
5.权利要求4的分离多核苷酸分子，其中所述多核苷酸分子还包含如SEQ ID NO1的第1位至351位核苷酸所示的核苷酸序列。
6.权利要求1的分离多核苷酸分子，其中所述多核苷酸是DNA。
7.含有下列可操作地连接在一起的元件的表达载体转录启动子；选自下组的DNA区段(a)包含如SEQ ID NO1的第70位至111位核苷酸所示的核苷酸序列的多核苷酸分子；(b)(a)的等位变体；(c)(a)或(b)的正同系物；和(d)(a)、(b)或(c)的简并核苷酸序列；及转录终止子。
8.其中已导入权利要求7的表达载体的培养细胞，其中所述细胞表达由该DNA区段编码的多肽。
9.选自下组的一种分离多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至37位残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；和(c)(a)或(b)的正同系物。
10.选自下组的一种分离多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至41位残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；和(c)(a)或(b)的正同系物。
11.选自下组的一种分离多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至117位残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；和(c)(a)或(b)的正同系物。
12.选自下组的一种分离多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第1位至37位残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；和(c)(a)或(b)的正同系物。
13.权利要求9的分离多肽，其中所述多肽分子还包含如SEQ IDNO2的第1位至117位残基所示的氨基酸序列。
14.一种药物组合物，其中包含权利要求9的纯化多肽与药学上可接受载体的结合。
15.可与选自下组的多肽的表位特异性结合的抗体(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至117位残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；和(c)(a)或(b)的正同系物。
16.zsig33多肽的制备方法，包括培养其中已导入了权利要求7的表达载体的细胞，从而所述细胞表达由该DNA区段所编码的多肽；和回收该多肽。
17.一种刺激胃运动的方法，其中包括给有此需要的哺乳动物施用足以提高摄入物质的运送时间或胃排空的一定量药物组合物，该药物组合物中含有选自下组的一种分离多肽(a)包含如SEQ ID NO2的第24位至37位残基所示氨基酸序列的多肽分子；(b)(a)的等位变体；和(c)(a)或(b)的正同系物。
18.权利要求17的方法，其中所述运送时间或胃排空是通过放射性标记物质测定的。
全文摘要
本发明涉及与促胃动素有同源性的新型cDNA序列的多核苷酸、多肽及其肽片段，以及它们的用途。该新多肽的mRNA特异地分布于胃、小肠和胰腺组织中。本发明还包括激动剂、拮抗剂、抗体、表达新型促胃动素同系物编码cDNA的宿主细胞，以及利用该新分子提高胃动力的方法。
文档编号C07K14/63GK1733918SQ20041005679
公开日2006年2月15日 申请日期1998年3月23日 优先权日1997年3月24日
发明者P·O·舍帕德, T·A·戴舍尔 申请人:津莫吉尼蒂克斯公司