专利名称：猪血血红蛋白生物酶解制备低分子肽及氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及肉制品加工副产物血液蛋白资源的综合利用领域，具体是指猪血血红蛋白生物酶解制备低分子肽及氨基酸的方法。
背景技术：
来自于肉制品加工副产物的动物血液含有19％左右的蛋白质，与瘦肉中蛋白质含量相当，其中20％存在于血浆中，另外多达80％存在于血红细胞中，而且其氨基酸组成平衡，尤其是赖氨酸、色氨酸含量高，是一种优质而廉价的蛋白质资源。
近年来对血液蛋白主要是血浆蛋白的开发利用取得了一定的进展，但对存在于血红细胞中占血液总蛋白含量80％的血红蛋白，由于其难以被消化吸收、生物利用率低且色泽易于褐变、腥味难以祛除，即使微量添加仍然会引起食品品质的劣变，尚无较好的解决办法，这就严重制约了大量血液资源的开发利用。目前虽然有少部分血液用于生产附加值较低的产品，如血豆腐、血肠及饲用血粉，但其它大部分血液直接排放废弃，造成了严重的资源浪费和环境污染(其化学需氧量高达500,000mg/L)。鉴此，在资源短缺和环境污染问题日益突出的今天，采用现代食品加工技术和生物技术，进行血液蛋白尤其是血红蛋白资源的精深加工及其系列产品的研究开发，对解决目前血液资源精深加工的瓶颈问题具有重要意义。
在上个世纪70年代开始就有国外学者Tybor、Autio、Janaína、Kuppevelt、Hayakawa等采用有机溶剂法、羧甲基纤维素(CMC)法从血红蛋白中提取珠蛋白。前者的蛋白质回收率虽然可达81.4％，但是有溶剂残留而不适合于在食品工业中使用；后者的营养和功能特性都比较好，可是蛋白质回收率最高只能达到60％，且成本高，尚未规模化生产。Buckley K.、Jeng-Huh Yang和Wismer-Pedersen，J.等人分别采用过氧化物氧化法来脱去血红蛋白的颜色，取得了一定的效果，但此类方法残留的过氧化氢会影响到食品的卫生安全。后来亦有学者(Houlier、Synowiecki、Ockerman)采用Alcalase酶水解法来提取血红蛋白中的珠蛋白，蛋白质回收率可达到70-80％，但酶解产物具有较重的苦味，影响了这种方法的推广和使用。
发明内容
本发明的目的在于针对猪血血红蛋白在食品工业生产中不能规模化应用的瓶颈问题，提供一种猪血血红蛋白生物酶解制备低分子肽及氨基酸的方法，使蛋白质回收率提高到90-95％，本发明无二次污染，几乎达到零排放，而且产物没有苦味，具有很高的溶解性和起泡性，兼具突出的保湿性能。
本发明的猪血血红蛋白生物酶解制备低分子肽及氨基酸的方法，包括如下步骤(1)猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为11.4-16.5％重量，调节溶液pH值到7.2-7.7，温度保持在50-55℃，加入胰酶和Protamex、Flavourzyme或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶，酶与蛋白浓度比为330-720U/g，反应时间为12-17h，水解度控制在24-30％；(2)将步骤(1)得到的水解产物通过离心分离除去不溶解的沉淀部分。
步骤(1)中，所述的蛋白酶均为已在食品工业中广泛使用并且安全的食品级用酶，其混合蛋白酶具体比例(U/U)如下胰酶∶Protamex＝1-2∶9；胰酶∶Flavourzyme＝1-2∶4；胰酶∶木瓜蛋白酶＝1-2∶8。
步骤(2)中，可以将步骤(1)得到的水解产物在20℃、3000g-4000g条件下离心10-20min，除去不溶解的沉淀部分。
步骤(2)的产物浓缩至浓度为25-30％，其蛋白质回收率可达90-95％，而且产物没有苦味。浓缩后喷雾干燥，得到粉状猪血血红蛋白酶解物。
在步骤(1)，可以用2M NaOH将溶液pH值调节到7.2-7.7。
步骤(1)水解反应结束后，可在95-100℃条件下加热5-10min进行灭菌，将酶解产物冷却到25℃。
所述猪血血红蛋白可以采用现有技术得到，本发明采用下述方法制备得到检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过3000-4000g、5-10℃离心10-20min，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.0-1.5倍体积的水再经50-60Mpa均质或超声波功率为1000-1500W超声处理2-3min破胞得到猪血血红蛋白。
本发明与现有技术相比，具有如下优点不同的蛋白酶和水解条件对血红蛋白的降解、产物的风味和功能特性以及蛋白质回收率都有重要影响，本发明通过高压均质或超声处理破碎血红细胞结合筛选优化出的蛋白酶最佳组合，采用可控酶解技术降解血红蛋白制备符合食品工业应用要求的低分子肽及氨基酸。该方法反应条件温和，无二次污染，蛋白质回收率较其它方法有显著提高，最高可达95％，比目前文献报道的最好水平提高了15-20％。产物无不良风味，具有很高的溶解性和起泡性，兼具突出的保湿性能。
具体实施例方式
实施例1第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过3000g、5℃离心20分钟，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.0倍体积的水再经50Mpa均质破胞得到猪血血红蛋白，取猪血血红蛋白500g。
第二步500g猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为14.5％，混合均匀后用2MNaOH将溶液pH值调节到7.5，加热并保持温度在55℃时，加入胰酶和Protamex，比例为胰酶∶Protamex＝1.8∶9(U/U)，[酶/蛋白]浓度＝710U/g，恒温状态下酶解13h，水解度为25％，反应结束后在100℃条件下加热5min，将酶解产物冷却到25℃。
第三步将冷却后水解产物在20℃、3000g条件下离心20min，除去不溶解的沉淀部分，将清液浓缩，样品浓度为25-30％。
第四步浓缩后的样品喷雾干燥得到产物。经检验，其主要成分是分子量为10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白质计为93.7％，蛋白回收率为94.5％。
实施例2第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过4000g、10℃离心10分钟，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.4倍体积的水再经60Mpa均质破胞得到猪血血红蛋白，取猪血血红蛋白500g。
第二步500g猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为11.6％，混合均匀后用2MNaOH将溶液pH值调节到7.2，加热并保持温度在51℃时，加入胰酶和Protamex，比例为胰酶∶Protamex＝1.1∶9(U/U)，[酶/蛋白]浓度＝670U/g，恒温状态下酶解16h，水解度为28％，反应结束后在100℃条件下加热5min，将酶解产物冷却到25℃。
第三步将冷却后水解产物在20℃、4000g条件下离心10min，除去不溶解的沉淀部分，将清液浓缩，样品浓度为26-30％。
第四步浓缩后的样品喷雾干燥得到产物。经检验，其主要成分是分子量为10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白质计为92.9％，蛋白回收率为93.7％。
实施例3第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过3500g、5℃离心15分钟，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.2倍体积的水再经超声波功率为1300W超声3min破胞得到猪血血红蛋白，取猪血血红蛋白5kg。
第二步5kg猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为12.5％，然后用2M NaOH将溶液pH值调节到7.5，加热并保持温度在53℃时，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例为胰酶∶木瓜蛋白酶＝1.9∶8(U/U)，[酶/蛋白]浓度＝650U/g，恒温状态下酶解12h，水解度为24％，反应结束后在100℃条件下加热10min，将酶解产物冷却到25℃。
第三步将冷却后水解产物在20℃、3500g条件下离心15min，除去不溶解的沉淀部分，将上清液浓缩(最终浓度为26％)。
第四步浓缩后的样品喷雾干燥得到产物。经检验，其主要成分是分子量为10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白质计为93.1％，蛋白回收率为92.9％。
实施例4第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过3800g、7℃离心12分钟，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.5倍体积的水再经超声波功率为1000W超声3min破胞得到猪血血红蛋白，取猪血血红蛋白5kg。
第二步5kg猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为11.5％，然后用2MNaOH将溶液pH值调节到7.5，加热并保持温度在51℃时，加入胰酶和木瓜蛋白酶，比例为胰酶∶木瓜蛋白酶＝1.2∶8(U/U)，[酶/蛋白]浓度＝610U/g，恒温状态下酶解16h，水解度为29％，反应结束后在95℃条件下加热10min，将酶解产物冷却到25℃。
第三步将冷却后水解产物在20℃、3500g条件下离心15min，除去不溶解的沉淀部分，将上清液浓缩(最终浓度为29％)。
第四步浓缩后的样品喷雾干燥得到产物。经检验，其主要成分是分子量为10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白质计为91.4％，蛋白回收率为93.0％。
实施例5第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过4000g、10℃离心10分钟，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.5倍体积的水再经60Mpa均质破胞得到猪血血红蛋白，取猪血血红蛋白30kg。
第二步30kg猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为11.4％，混合均匀后用2MNaOH将溶液pH值调节到7.6，加热并保持温度在50℃时，加入胰酶和Flavourzyme，比例为胰酶∶Flavourzyme＝1.8∶4(U/U)，[酶/蛋白]浓度＝380U/g，恒温下酶解13h，水解度为25％，反应结束后在100℃条件下加热8min，将酶解产物冷却到25℃。
第三步将冷却后水解产物20℃、4000g条件下离心10min，除去不溶解的沉淀部分，将上清液浓缩到27％。
第四步浓缩后的样品喷雾干燥得到产物。经检验，其主要成分是分子量为10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白质计为94.0％，蛋白回收率为90.6％。
实施例6第一步检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过3000g、5℃离心20分钟，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.0倍体积的水再经超声波功率为1300W超声2.5min破胞得到猪血血红蛋白，取猪血血红蛋白30kg。
第二步30kg猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为16.4％，混合均匀后用2MNaOH将溶液pH值调节到7.2，加热并保持温度在54℃时，加入胰酶和Flavourzyme，比例为胰酶∶Flavourzyme＝1.0∶4(U/U)，[酶/蛋白]浓度＝330U/g，恒温状态下酶解17h，水解度为30％，反应结束后在100℃条件下加热10min，将酶解产物冷却到25℃。
第三步将冷却后水解产物20℃、3000g条件下离心20min，除去不溶解的沉淀部分，将上清液浓缩到26％。
第四步浓缩后的样品喷雾干燥得到产物。经检验，其主要成分是分子量为10,000以下的低分子肽和氨基酸，含量以蛋白质计为92.6％，蛋白回收率为91.1％。
权利要求
1.一种猪血血红蛋白生物酶解制备低分子肽及氨基酸的方法，其特征在于包括如下步骤(1)猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为11.4-16.5％重量，调节溶液pH值到7.2-7.7，温度保持在50-55℃，加入胰酶和Protamex、Flavourzyme或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶，酶与蛋白浓度比为330-720U/g，反应时间为12-17h，水解度控制在24-30％；(2)将步骤(1)得到的水解产物通过离心分离除去不溶解的沉淀部分。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述的混合蛋白酶用量比例(U/U)如下胰酶∶Protamex＝1-2∶9；胰酶∶Flavourzyme＝1-2∶4；胰酶∶木瓜蛋白酶＝1-2∶8。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(1)中，用2MNaOH调节溶液pH。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)中水解反应结束后，在95-100℃条件下加热5-10min，将酶解产物冷却到25℃。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(2)中，将步骤(1)得到的水解产物在20℃、3000g-4000g条件下离心10-20min，除去不溶解的沉淀部分。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述猪血血红蛋白采用下述方法制备得到检疫合格的生猪经空心刀采血，加入0.33％柠檬酸钠并混合均匀抗凝，然后经过3000-4000g、5-10℃离心10-20min，得到下层沉淀血红细胞，血红细胞加1.0-1.5倍体积的水再经50-60Mpa均质或超声波功率为1000-1500W超声处理2-3min破胞得到猪血血红蛋白。
全文摘要
本发明涉及猪血血红蛋白生物酶解制备低分子肽及氨基酸的方法，包括猪血血红蛋白加水调整其蛋白质含量为11.4－16.5％重量，调节溶液pH值到7.2－7.7，温度保持在50－55℃，加入胰酶和Protamex、Flavourzyme或木瓜蛋白酶的混合蛋白酶，酶与蛋白浓度比为330－720U/g，反应时间为12－17h，水解度控制在24－30％；得到的水解产物通过离心分离除去不溶解的沉淀部分。本发明采用细胞破碎技术并结合筛选出的复合蛋白酶的最佳组合，优化了反应条件，使蛋白质回收率提高到90－95％，产物无不良风味，具有很高的溶解性和起泡性，兼具突出的保湿性能，可广泛应用于食品生产中。
文档编号C07K14/795GK1858228SQ20061003469
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月28日 优先权日2006年3月28日
发明者赵谋明, 郭善广, 崔春, 赵强忠 申请人:华南理工大学