专利名称：：具有新世界灵长类构架区的经改造的抗体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗体或其抗原结合部分，其具有可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区。所述构架区是新世界灵长类构架区或衍生自新世界灵长类构架区，并且至少一个所述CDRs是经修饰的新世界灵长类CDR或非新世界灵长类CDR。
背景技术：
：抗体(免疫球蛋白)在哺乳动物的免疫系统中起重要作用。它们由浆细胞生产，所述浆细胞由前体B细胞发育而成。抗体由通过二硫桥连接的2个相同的多肽轻链和2个相同的多肽重链组成。轻链被称为K或A轻链，和重链被称为v、ju、5、cx或s。每条链由恒定区和可变区组成。可变区给予抗体以特异性。在每个可变区内是具有高可变性的区域或互补决定区(CDRs)，其侧翼是被称为构架区的更保守的区域。在每个可变区内是3个CDRs和4个构架区。抗体是双功能分子，来自重和轻链的N-末端可变区段以特异性方式结合在一起，从而产生对抗原表面上的特定表位具有亲和力的三维结构。恒定区区段负责延长抗体的血清半衰期和效应物功能，并且涉及补体结合、刺激吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和触发粒细胞的颗粒释放。杂交瘤技术的开发促进了具有特定特异性的单克隆抗体的生产。通常，此类杂交瘤是鼠类杂交瘤。已产生了人/小鼠嵌合抗体，其中将来自小鼠基因组的抗体可变区序列与来自人基因组的抗体恒定区序列相组合。该嵌合抗体显示出亲本小鼠抗体的结合特征，以及与人恒定区相关的效应物功能。通过在宿主细胞中表达来产生抗体，所述宿主细胞包括例如中国仓鼠卵巢细胞(CH0)、NSO骨髓瘤细胞、C0S细胞和SP2细胞。此类嵌合抗体已用于人治疗中，然而，由人受者产生了针对这些嵌合抗体的抗体。此类抗嵌合抗体对使用嵌合抗体的持续治疗是有害的。已提出，人单克隆抗体预期是用于体内人治疗的超过小鼠单克隆抗体的改进。根据使用来自旧世界灵长类(恒河猴和黑猩猩)的抗体进行的工作，假定这些非人灵长类抗体在人中将是耐受的，因为它们在结构上类似于人抗体(EhrlichPH等人，Humanandprimatemonoclonalantibodiesfor/'力f/fotherapy.ClinChem.34:9第1681-1688页(1988))。此外，因为人抗体是在恒河猴中是非免疫原性的(EhrlichPH等人，Hybridoma，1987，6:151-60)，所以可能反过来也是可行的，并且灵长类抗体在人中将是非免疫原性的。这些单克隆抗体由杂交瘤分泌，所述杂交瘤通过使淋巴细胞与人x小鼠异骨髓瘤(heteromyeloma)相融合来构建。EP0605442公开了结合人抗原的嵌合抗体。这些抗体包含来自旧世界猴的完整可变区和人或黑猩猩抗体的恒定区。在这个参考文献中提出的关于这些构建体的优点之一是在旧世界猴中产生针对人抗原的抗体的能力，与在小鼠宿主中产生的抗体相比较，所述抗体在人中的免疫原性更低。新世界灵长类(广鼻猴下目(户/fl0^r力//7/))包含至少53个种，其通常分成2个科狨科(和悬猴科(CeW&e)。狨科由狨和糈组成。悬猴科包括松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、绒毛猴、悬猴、秃猴、狐尾猴、夜或枭猴和吼猴。进化上遥远的灵长类，例如新世界灵长类，不仅足够不同于人以允许产生针对人抗原的抗体，还足以类似于人以具有类似于人抗体的抗体，从而使得当衍生自此类灵长类的抗体被引入人中时，宿主不产生抗抗体免疫应答。先前的研究已表征了表达的普通狨(的免疫球蛋白重链储库(雨BudingenH-C等人，Immunogenetics，2001，53:557-563)。鉴定了6个IGHV亚群，其显示了与它们的人IGHV对应物的高度序列相似性。当与互补决定区(CDRs)相比较时，构架区是更保守的。普通狨与人IGHV序列之间的相似性程度小于非人旧世界灵长类与人之间的相似性程度。结构域抗体结构域抗体(dAb)是功能性结合单元，其可以使用抗体构架来制备，并且相应于抗体的重链可变区(VH)或轻链可变区(VJ。结构域抗体具有约13kDa的分子量，或小于完整抗体大小的十分之一。免疫球蛋白轻链被称为k或A轻链，和重链被称为Y、iu、5、oc或s。可变区给予抗体以特异性。在每个可变区内是具有高可变性的区域，或者被称为互补决定区(CDRs)，其侧翼是被称为构架区的更保守的区域。在每个轻链和重链可变区内是3个CDRs和4个构架区。与常规抗体不同，结构域抗体在细菌、酵母和哺乳动物系统中良好表达。它们的小尺寸允许更高的摩尔量/克产物，从而提供了效力的显著增加。此外，结构域抗体可以用作构建部件，以制备治疗产物例如多重耙向性dAbs，其中包含2个或更多个可变结构域的构建体结合至2个或更多个治疗靶，或靶向肺或口服施用的dAbs。发明概述本发明人发现，新世界灵长类提供了抗体序列的来源，所述抗体序列预期在人中具有低免疫原性。选择新世界灵长类作为存在于新世界和旧世界灵长类的分支点上的免疫球蛋白序列的储库。关键想法是，这种储库因此可能产生对于在旧世界灵长类中发现的免疫球蛋白序列中的后来趋异来说原始的免疫球蛋白序列。此类原始序列将与T细胞储库共存，因为它随后在向人的道路上进化，时间为估计是旧世界和新世界灵长类的分支点的3千5百万年前(MYA)(SchneiderH等人，MolPhylogenetEvol.,1993Sep;2(3):225-42)。这代表了延长的关于免疫耐受性的选择期，因此本发明人预期此类原始序列不含最近进化的某些辅助性T细胞表位。因此，在第一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其具有可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区，其中所述构架区是新世界灵长类构架区或衍生自新世界灵长类构架区，并且其中至少一个所述CDRs是非新世界灵长类CDR。在第二个方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合部分，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。在第三个方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合部分在诊断应用中的用途，所述诊断应用用于检测与特定疾病或病症有关的抗原。在第四个方面，本发明提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF-ot活性的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的抗体或其抗原结合部分(或其药物组合物)，其中所述抗体或其抗原结合部分结合TNF-oc。在本发明的一个进一步方面，提供了如本文所述的抗体及其抗原结合部分，以及其药物组合物在制备药物中的用途。特别地，用于制备在治疗或诊断如本文所述的疾病或病症中使用的药物。在本发明的一个进一步方面，提供了经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其结合细胞表面抗原或细胞因子，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区，其中对所述CDRs进行选择，从而使得所述抗体或抗原结合部分与所述细胞表面抗原或所述细胞因子结合。除非另有说明或上下文明确指出，预期可以使用如本文所述的抗体及其抗原结合部分，而不限制于本文所述的药物组合物，并且掺入本文所述的试剂盒中。并且进一步地，除非另有说明或上下文明确指出，如本文所述的抗体及其抗原结合部分，以及药物组合物和试剂盒，可以用于本文公开的治疗和诊断方法。附图简述图l证实了AB138与大鼠脊髄裂解物(泳道2)中存在的大鼠MOG结合而不与CH0K1SV裂解物(泳道3)结合。泳道1包含分子量标记。图2证实了抗TNFot单克隆抗体缺乏与大鼠脊髓裂解物(泳道2)和CH0K1SV裂解物(泳道3)中存在的大鼠MOG的相同样品的非特异性结合。泳道1包含分子量标记。图3是供体和接纳体(acceptor)VH氨基酸序列的比对。图4是供体和接纳体VL氨基酸序列的比对。图5:通过ELISA测量的抗体AB164、AB103和AB197与TNF-ct的结合。图6:通过AB164、AB197、AB103来中和TNF-a诱导的L-929细胞细胞毒性。发明详述在第一个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其具有可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区，其中所述构架区是新世界灵长类构架区或衍生自新世界灵长类构架区，并且其中至少一个所述CDRs是非新世界灵长类CDR。在第二个方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合部分，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。在第三个方面，本发明提供了本发明的抗体或其抗原结合部分在诊断应用中的用途，所述诊断应用用于检测与特定疾病或病症有关的抗原。在第四个方面，本发明提供了用于治疗特征在于在人受试者中的人TNF-oc活性的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用有效量的如本文所述的抗体或其抗原结合部分(或其药物组合物)，其中所述抗体或其抗原结合部分结合TNF-oc。在本发明的某些实施方案中，可变区包含3个CDRs和4个构架区。还优选的是，该抗体在人中具有低的预测的免疫原性。所述抗体或其抗原结合部分的可变区可以包含来自不同来源的CDRs的组合。在某些实施方案中，可变区包含选自下列的CDRs:至少一个鼠类CDR序列(优选地小鼠或大鼠)，至少一个人CDR序列，至少一个合成的CDR序列，至少一个兔CDR序列，至少一个经修饰的新世界灵长类CDR序列，以及前述CDR序列中的2个或更多个的组合，至少一个人CDR和至少一个鼠类CDR，至少一个人CDR和至少一个合成的CDR，至少一个人CDR和至少一个兔CDR，至少一个人CDR和至少一个新世界灵长类CDR，至少一个鼠类CDR和至少一个合成的CDR，至少一个鼠类CDR和至少一个兔CDR，至少一个鼠类CDR和至少一个新世界灵长类CDR，至少一个合成的CDR和至少一个兔CDR，至少一个合成的CDR和至少一个新世界灵长类CDR，和至少一个兔CDR和至少一个新世界灵长类CDR。在优选形式中，可变区包含3个鼠类CDR序列，特别是3个小鼠CDR序列。在一个备选实施方案中，可变区包含3个人CDR序列在一个进一步的优选实施方案中，可变区包含4个新世界灵长类构架区，或4个其中所述区域衍生自新世界灵长类构架区的构架区。在一些实施方案中，抗原结合部分是结构域抗体。在具体实施方案中，所述抗体或抗原结合部分进一步包含人或非人旧世界灵长类恒定区序列或其组合。非人旧世界灵长类的例子包括但不限于，黑猩猩、狒狒、猩猩、短尾猴和大猩猩。在本发明的一个进一步的实施方案中，dAb可以是多聚化的，如例如异或同二聚体(例如，VH/VH、VJVl或Vh/Vl)，异或同三聚体(例如，VH/VH/VH、VL/VL/VL、Vh/Vh/Vl或vh/vl/vl)，异或同四聚体(例如，VH/VH/VH/VH、Vl/Vl/Vl/Vl、Vh/Vh/Vh,Vl、Vh/Vh/Vl/Vl或Vh/Vl/Vl/Vl)，或更高次的异或同多聚体。多聚化可以增加抗原结合的强度，其中结合的强度与多个结合位点的结合亲和力总和有关。例如，本发明提供了结构域抗体，其中所述结构域抗体与至少一个其他结构域抗体连接。每个dAb可以与相同或不同的抗原结合。dAb多聚体可以进一步包含一个或多个dAbs，所述dAbs是连接的并且其中每个dAb与不同的抗原结合，多特异性配体，包括所谓的"双重特异性配体"。例如，双重特异性配体可以包含一对Vh結枸域或一对V^结构域。此类双重特异性配体在DomantisLtd的W020(M/003019(PCT/GB2003/002804)中描述，所述专利整体引入本文作为参考。新世界灵长类构架区序列优选来自新世界灵长类，其选自狨、糈、松鼠猴、青猴(titimonkey)、蜘蛛猴、绒毛猴(woollymonkey)、悬猴、秃猴、狐尾猴、夜或枭猴和吼猴，最优选是狨。优选地，嵌合抗体或其抗原结合部分所结合的抗原在性质上是肽、蛋白质、碳水化合物、糖蛋白、脂质或糖脂，选自肿瘤相关抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis—Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受体，涉及免疫或炎性疾病或病症的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI类、MHCII类、GM-CSF、干扰素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-oc和IgE，在宿主细胞上表达的抗原，包括糖蛋白1Ib/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受体和粘附受体，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144,包含细胞因子、趋化因子、生长因子或其他可溶性生理学调节剂或其受体的抗原，包括嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、IL-6、IL-8、TGF-p、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受体，涉及中枢神经系统疾病或病症的抗原，包括P-淀粉样蛋白和感染性蛋白质，非人源的抗原例如微生物、纳米生物(nanobial)或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、响尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗体充当激动剂或拮抗剂，或者对于通过与补体或杀伤细胞(例如NK细胞)一起作用来消除(杀死或去除)不希望的细胞(例如，抗CD4)来说是有活性的，或者对于作为细胞毒剂或引起吞噬细胞对Fc受体的结合来说是有活性的，或者中和其靶的生物活性。还优选的是，至少一个构架区的序列被修饰，以增加结合或效力或者减少预测的在人中的免疫原性。本发明抗体或抗原结合部分的结合或效力增加或者预测的在人中的免疫原性减少是相对于其中构架区未修饰的抗体或其抗原结合部分而言的。在其他实施方案中，一个或多个CDRs的序列被修饰，以增加结合或效力或者减少预测的在人中的免疫原性。本发明抗体或抗原结合部分的结合或效力增加或者预测的在人中的免疫原性减少是相对于其中构架区未修饰的抗体或其抗原结合部分而言的。结合的增加通过抗体或其抗原结合部分的KD(UK。,)的减少而得到证实。效力的增加在生物学测'定法中得到证实。例如，可以用于测量抗体或其抗原结合部分的效力的测定法包括TNFoc诱导的L929细胞毒性中和测定法，IL-12诱导的人PHA活化的外周血单核细胞(PBMC)增殖测定法，和RAML介导的小鼠脾细胞的破骨细胞分化(Stern，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6808-6812(1990);Kong，Y-Y.等人，Nature397:315-323(1990);Matthews,N.和M.L.Neale，4F27p力oir!'/7esa/i///7ter尸ero/2s，a户rac〃c"J/7prosc力,1987，M.J.Clemens,A.G.Morris和A.J.H,Gearing,编辑，IRLPress,第221页)。如本文所使用的，术语"抗体"意指免疫球蛋白分子，其由通过二硫键链间连接的4条多肽链组成2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链由重链可变区(HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区包含3个结构域CH1、Ch2和CH3。每条轻链由轻链可变区(LCVR或VJ和轻链恒定区组成。轻链恒定区由1个结构域组成Vh和Vl区可以进一步再分成称为互补决定区(CDR)的具有高可变性的区域，其中散布着称为构架区(FR)的更保守的区域。每个Vh和VL由3个CDRs和4个FRs组成，从氨基末端到羧基末端以下列顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。如本文所使用的，术语抗体的"抗原结合部分"指免疫球蛋白的一个或多个组分或衍生物，其显示出与抗原结合的能力。已显示，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。包含在术语抗体的"抗原结合部分"内的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由Vl、Vh、C^和Ch1结构域组成的单价片段；(ii)F(aV)2片段，包含在铰链区通过二疏桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的Vl和VH结构域组成的Fv片段；(v)由单个VH结构域或VL结构域(vandenBeukenT等人，2001，J.Mol.Biol，310，591)组成的dAb片段(Ward等人，1989，Nature341:544-546);和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域W和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成的连接体来进行连接，所述合成的连接体使得它们能够制备为单条蛋白质链，其中Vl和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv);(参见例如Bird等人，1988，Science242:423-426和Huston等人，1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。此类单链Fvs也希望包含在术语抗体的"抗原结合部分"内。还包含其他形式的单链Fvs和相关分子，例如双抗体或三抗体。双抗体是二价抗体，其中Vh和l结构域在单条多肽链上表达，但使用太短而不允许同一链上的所述2个结构域之间配对的连接体，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并形成2个抗原结合位点(参见例如，Holliger，P.，等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448;Poljak，R.J,，等人，1994，Structure,2:1121-1123)。生产根据本发明的抗体的方法将是本领域技术人员熟悉的。参见例如，美国专利号4,816,567、美国专利号5,585,089和US20030039649，所述专利整体引入本文作为参考。此类方法需要使用标准重组技术。优选地，根据本发明的抗体或其抗原结合部分在人宿主中具有预测的^[氐免疫原性。"低免疫原性，，意指抗体在接受该抗体的至少大多数个体中不产生这样的抗体应答，即所述抗体应答的量级足以减少以达到治疗效果来说足够的时间连续施用所述抗体的功效。在人中的免疫原性水平可以使用MHCII类结合预测程序Propred(http://www.imtech.res.in/raghava/propred)来预测，使用所有等位基因的1%阈值分析。可以使用的其他程序包括Rankpep(hup://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)Epibase(Algonomics专有软件algonofflics.com)。相对于起始供体分子，免疫原性减少的分子将不包含或包含数目减少的被预测与MHCII类等位基因结合的肽，所述匪CII类等位基因在靼群体中是高度表达的(FlowerDR，DoytchinovaIA.(2004)Immunoinformaticsandthepredictionofimmunogenicity，DrugDiscovToday,9(2):82-90)。MHCII类结合的功能分析可以通过下述方法来进行产生相应于目的蛋白质的重叠肽，并就其引起T细胞活化(T细胞增殖测定法)或替换报道肽——已知的MHCII类结合肽(HammerJ等人，1994,J.Exp.Med.，180:2353)的能力来测试这些肽。在本文中关于新世界灵长类构架区所使用的术语"衍生自"意指，新世界灵长类构架区的序列由天然序列而改变。通常，将进行改变以增加结合，例如在美国专利号5，585，089和US20030039649中描述的，或减少预测的在人中的免疫原性。术语"衍生自"不包括导致可变区中存在的构架区的整个序列等同于人构架序列的改变。可以用于比较的一个数据库是hup://www.ncbi.nlm.nih.gov/。在一个进一步的方面，本发明提供了经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其结合细胞表面抗原或细胞因子，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区，其中对所述CDRs进行选择，从而使得所述抗体或抗原结合部分与所述细胞表面抗原或所述细胞因子结合。如本文所使用的，术语"经设计的"意指，已使用在下述参考文献中描述的表位印记方法来选择新世界灵长类CDRs:Hoogenboom等人，PCT公开号W093/06213和Jespers等人，BI0/TEC誦L0GY,第12巻，1994，第899-903页，所述参考文献在此整体引入。在这种方法中使用的抗体文库优选是如下述参考文献中所描述的进行制备并筛选的scFv文库McCafferty等人，PCTV/Hf号WO92/01047，McCafferty等人，1990，Nature,348:552-554;和Griffiths等人，1993，EMBOJ，12:725-734，所述参考文献在此整体引入作为参考。例如，选择了最初的人l和Vh区段后，执行"混合和匹配"实验以选择优选的VJVH配对组合，在所述混合和匹配实验中，就hTNF-oc结合来筛选最初选择的1和1片区段的不同对。此外，为了进一步改善hTNF-cc结合的亲和力和/或降低hTNF-a结合的解离速率常数，可以使优选的V7VH对的Vl和VH区段随机突变，优选在Vh和/或Vl的CDR3区域内，其过程类似于在天然免疫应答过程中负责抗体的亲和力成熟的体内体细胞突变过程。这种体外亲和力成熟可以通过使用分别与VHCDR3或VlCDR3互补的PCR引物扩增Vh和Vl区来完成，所述引物在某些位置处用4种核苷酸碱基的随机混合物"刺入(spiked)"，从而使得所得到的PCR产物编码其中已将随机突变引入Vh和/或lCDR3区域内的Vh和l区段。可以就与抗原的结合来重新筛选这些随机突变的Vh和Vl区段，并且可以选择显示出抗原结合的高亲和力和低解离速率的序列。在筛选并分离与来自重组免疫球蛋白展示文库的目的抗原结合的抗体或其抗原结合部分后，可以从展示包中(例如，从噬菌体基因组中)回收编码所选抗体的核酸，并通过标准重组DNA技术亚克隆到其他表达载体内。需要时，可以进一步处理所述核酸以产生本发明的其他抗体形式(例如，与编码另外的免疫球蛋白结构域例如另外的恒定区的核酸相连接)。为了表达通过筛选组合文库而分离的重组人抗体，将编码该抗体的DNA克隆到重组表达载体中，并引入哺乳动物宿主细胞中。可以被把向的细胞表面抗原和可以在印记法中使用的抗体的例子包括但不限于抗原抗体(参考文献)CD30KT3(VanWauwe-JP等人(1980)JournalofImmunology124:2708-13)CD201F5(Press-0W等人(1987)Blood69:584)Y2B8(White-CA等人(1991)Pharm.Sci.Technol.Today2:95-101)CD33P67.6(Koller-U和Peschel-CH.InKnapp-W等人EdsLeukocyteTypinIV:WhiteCellDifferentiationAntigens，OxfordUniversityPress1989:812-813)CD52CAMPATH1(Hale-G等人(1983)Blood62:873-82)EGF-RmAb225(Bruell-D等人(2005)IntJMolMed15:303-313)糖蛋白1Ib/IIIa10E5和7E3(Coller-BS(1985)JournalofClinicalInvestigation76:101-108)Her-24D5(Kumar-R等人(1991)Mol.CellBiol11:979-86)CD25Mab:RFT5(Engert-A等人(1991)IntJCancer49:450-456)可以被乾向的细胞因子和可以在印记法中使用的抗体的例子包括但不限于抗原抗体(参考文献)TNF-ccmAbl95(Moller-A等人(1990)Cytokine2:162-169)mAbl、11、12、20、21、25、31、32、37、42、47、53、54(RathjenDA等人(1991)MolecularImmunology28:79-86)VEGFmAbsA3.13.1、A4.6.1、B4.3.1和B2.6.2(Kim-KJ(1992)GrowthFactors7:53-64)本发明进一步基于用于扩增新世界灵长类免疫球蛋白基因的方法，例如使用对重和轻链可变区基因家族特异的引物通过聚合酶链式反应(PCR)从由新世界灵长类淋巴细胞中提取的核酸中进行扩增。随后，将扩增的可变区克隆到包含人或灵长类恒定区基因的表达栽体内，用于产生新世界灵长类嵌合重组抗体。^吏用标准重组DNA方法来获得抗体重和轻链基因，将这些基因合并入重组表达载体中并且将载体引入宿主细胞中，所述宿主细胞例如为在Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，MolecularCloning:alaboratorymanual,第2版，ColdSpringHarbor,N.Y(1989)中描述的那些。合适的表达载体将是本领域技术人员熟悉的。产生免疫球蛋白的新世界灵长类淋巴细胞通常通过与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤而变得永生。用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NSO骨髓瘤细胞、C0S细胞和SP2细胞。除了哺乳动物表达系统外，本发明还考虑了非哺乳动物表达系统的使用，例如衍生自植物或原核生物(细菌)的那些表达系统。此类表达系统将是本领域技术人员熟悉的。VH、Vl和恒定区结构域储库可以是天然存在的免疫球蛋白序列储库或合成的储库。天然存在的储库是例如从表达免疫球蛋白的细胞制备的储库，所述表达免疫球蛋白的细胞从一种或多种灵长类中收获。此类储库可以是原初的(naive)，即从新生的表达免疫球蛋白的细胞制备，或者是重排的，即从例如成年灵长类B细胞制备。需要时，随后对从天然储库或任何储库中鉴定的结合靶抗原的克隆实施诱变并进一步进行筛选，以产生和选择具有改善的结合特征的变体。免疫球蛋白可变结构域的合成储库通过将多样性人工引入经克隆的可变结构域中来制备。此类亲和力成熟技术将是本领域技术人员熟悉的，例如由R.A.Irving等人,2001，JournalofImmunologicalMethods,248，31-45描述的那些。新世界灵长类抗体基因的可变区或其CDR可以通过下述方法来克隆提供核酸例如cDNA，提供与编码抗体基因的5'前导序列的cDNA序列互补的引物，使那种cDM与引物接触以形成杂交复合物，并扩增cDM以产生编码新世界灵长类抗体基因的可变区(或CDR区)的核酸。鉴于本发明的教导，本发明领域的技术人员将会意识到，新世界灵长类可变区序列可以用作接纳体用于使用标准重组技术来嫁接非新世界灵长类序列，特别是CDR序列。例如，美国专利号5，585，089描述了用于制备低免疫原性的嵌合抗体的方法，所述嵌合抗体保留了非人亲本抗体的高亲和力，并且包含来自供体免疫球蛋白的一个或多个CDRs和来自人免疫球蛋白的构架区。美国公开号20030039649描述了用于制备低免疫原性的嵌合抗体(包含来自非人抗体的CDR序列和人抗体的构架序列)的人源化方法，基于使用规范CDR结构类型的非人抗体，相对于种系规范CDR结构类型的人抗体，其作为用于选择用于人源化抗体的合适的人构架序列的基础。因此，这些原则可以应用于将一个或多个非新世界灵长类CDRs嫁接到新世界灵长类接纳体可变区内。CDR序列可以得自从抗体分离的基因组DNA，或得自数据库中存在的序列，所述数据库例如为国家生物寺支术信息中心(NationalCentreforBiotechnologyInformation)蛋白质和核普酸数据库，KabatDatabaseofSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,CDR序列可以是基因组DNA或cDNA。用于将替代CDR嫁接到接纳体可变序列内的方法将是本发明领域的技术人员熟悉的。通常，对于每个可变轻链和可变重链或者在结构域抗体的情况下对于单条链，将CDRs嫁接到接纳体可变区序列内。本发明的优选方法涉及经由引物指导的诱变来替换可变区序列中的CDR1，或更优选地CDR2。该方法由下述步骤组成使编码所需突变的合成寡核苷酸与靶区域退火，其中它充当引物用于起始体外DNA合成；通过DNA聚合酶延伸寡核苷酸以产生携带所需突变的双链DM;和将该序列连接并克隆到合适的表达栽体中(Sambrook,Joseph;和DavidW.Russell(2001).#o/ecw/a_rC/an//7f爿Zfl6or"CLry他"i/a厶第3版，ColdSpringHarbor,N.Y.:ColdSpringHarborLaboratoryPress)。更进一步地，抗体或其抗原结合部分可以是较大的免疫粘附分子的一部分，所述较大的免疫粘附分子通过使抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽共价或非共价结合来形成。此类免疫粘附分子的例子包括使用链霉抗生物素蛋白核心区来制备四聚scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人，1995HumanAntibodiesandHybridomas,6:93-101)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等人，1994Mol.Immunol.，31:1047-1058)。使用常规技术可以由完整抗体制备抗体部分例如Fab和F(ab')2片段，例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体。此外，使用如本文所述的和技术人员已知的标准重组DM技术，可以获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。恒定区序列(Fc部分)优选从人或灵长类免疫球蛋白序列获得。灵长类序列可以是新世界灵长类或旧世界灵长类序列。合适的旧世界灵长类包括黑猩猩，或其他类人猿例如大猩猩或猩猩，它们由于其与人的紧密的系统发生接近性而与人恒定区序列共享高度的同源性。编码人或灵长类恒定区的序列可从数据库中获得，所述数据库包括例如国家生物技术信息中心蛋白质和核苷酸数据库，KabatDatabaseofSequencesofProteinsofImmunologicalInterest,根据本发明的抗体或抗原结合部分能够与人或非人抗原结合。优选地，嵌合抗体或其抗原结合部分所结合的抗原在性质上是肽、蛋白质、碳水化合物、糖蛋白、脂质或糖脂，选自肿瘤相关抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受体，涉及免疫或炎性疾病或病症的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI类、MHCII类、GM-CSF、干扰素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-oc和IgE，在宿主细胞上表达的抗原，包括糖蛋白IIb/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受体和粘附受体，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144,包含细胞因子、趋化因子、生长因子或其他可溶性生理学调节剂或其受体的抗原，包括嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受体，涉及中枢神经系统疾病或病症的抗原，包括p-淀粉样蛋白和感染性蛋白质，非人源的抗原例如微生物、纳米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、响尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗体充当激动剂或拮抗剂，或者对于通过与补体或杀伤细胞(例如M细胞)一起作用来消除(杀死或去除)不希望的细胞(例如，抗CD4)来说是有活性的，或者对于作为细胞毒剂或引起吞噬细胞对Fc受体的结合来说是有活性的，或者中和其靶的生物活性。更优选地，抗原是TNFa，最优选地人TNFot。备选地，所述抗体或其抗原结合部分可以结合非人抗原。优选地，所述非人抗原选自呼吸道合胞病毒F蛋白、巨细胞病毒、蛇毒和地高辛。如本文所使用的，术语"与……结合"意指通过抗体的免疫球蛋白可变区以1UM或更低的离解常数(Kd)与抗原结合，如通过表面等离子共振分析所测量的，使用例如BIAcoreTM表面等离子共振系统和BIAcoreTM动力学评估软件(例如，版本2.1)。关于特异性结合相互作用的亲和力或离解常数(Kd)优选是约500nM-约50pM，更优选约500nM或更低，更优选约300nM或更低，和优选至少约300nM-约50pM，约200nM-约50pM，和更优选至少约100nM-约50pM，约75nM-约50pM,约10nM-约50pM。本发明的抗体在人治疗中是有利的，因为诱导人抗抗体应答的可能性将被减少。通过筛选组合免疫球蛋白文库(例如，噬菌体展示文库)以分离显示出所需结合特异性和功能行为(例如，TNFot的中和可以使用L929细胞进行测量)的文库成员，可以鉴定并分离根据本发明产生的结合乾抗原的重组抗体。应当理解，其中使用抗原结合部分或抗体衍生物(例如Fabs、scFv和V结构域或结构域抗体)的所有方法都在本发明的范围内。噬菌体展示技术在本领域中已广泛地得到描述，并且用于产生并筛选此类文库以及使其产物亲和力成熟的方法和化合物的例子可以在下述参考文献中找到例如，Barbas等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:7978-7982;Clarkson等人，1991，Nature,352:624-628;Dower等人，PCT公开号WO91/17271，美国专利号5，427，908,美国专利号5，580，717和EP527，839;Fuchs等人，1991，Bio/Technology，9:1370-1372;Garrad等人，1991Bio/Technology,9:1373-1377;Garrard等人，PCT公开号W092/09690;Gram等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580;Griffiths等人，1993EMB0J，12:725-734;Griffiths等人，美国专利号5，885，793和EP589,877;Hawkins等人，1992，JMolBiol,226:889-896;Hay等人，1992，HumAntibodHybridomas,3:81-85;Hoogenboom等人，1991NucAcidRes，19:4133-4137;Huse等人，1989，Science,246:1275-1281;Knappik等人，2000，JMolBiol，296:57-86;Knappik等人，PCTWO97/08320;Ladner等人，美国专利号5,223,409，美国专利号5，403，484，美国专利号5，571，698，美国专利号5，837，500和EP436，597;McCafferty等人，1990，Nature,348:552-554;McCafferty等人，PCT公开号WO92/01047，美国专利号5,969,108和EP589,877;Salfeld等人，PCTWO97/29131，US临时申请号60/126，603;和Winter等人，PCTWO92/20791和EP368,684。表达本发明的抗体的重组文库可以在微生物例如酵母或细菌的表面上表达(参见PCT公开W099/36569和98/49286)。选择的淋巴细胞抗体法(SelectedLymphocyteAntibodyMethod)或在现有技术中被称为的SLAM，是快速产生高亲和力抗体的另一种方法。与噬菌体展示方法不同，所有抗体全都是二价的。为了产生新世界灵长类抗体，用人抗原例如TNFot多肽免疫新世界灵长类。在免疫后，取出细胞并在独个微量孔中进行选择性增殖。从孔中取出上清液并就结合和功能进行测试。可以回收基因序列用于后续操作，例如人源化、Fab片段、scFv或dAb产生。因此，另一个例子是通过SLAM及其衍生形式(Babcook，J.S.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci，USA93;7843-7848，美国专利5，627，052和PCT公开WO92/02551)来衍生本发明的配体。SLAM的调整形式，例如使用备选方法来测试上清液，例如淘选，也在本发明的范围内。在一种表达系统中，在核糖体上展示重组肽/蛋白质文库(例如参见Roberts,RW和Szostak，J.W.1997.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.94:12297-123202以及PCT公开号WO98/31700)。因此，另一个例子涉及优选但不限于从经免疫的细胞制备的DM文库(例如抗体和衍生物)的产生和体外转录，翻译该文库，从而使得蛋白质和"经免疫的"mRMs停留在核糖体上，亲和力选择(例如通过与RSP结合)，mRNA分离，反向翻译和后续扩增(例如通过聚合酶链式反应或相关技术)。必要时可以偶联另外的选择和扩增循环，以通过在这种系统中引入体细胞突变或通过现有技术中已知的其他亲和力成熟方法来进行亲和力成熟(R.A.Irving等人，JournalofImmunologicalMethods,248，31-45(2001))。另一个例子考虑应用乳状液区室化技术(emulsioncompartmentalisationtechnology)以产生本发明的抗体。在乳状液区室化中，将体外和光学分选方法与在乳状液的油滴内的水相中翻译的蛋白质及其核苷酸编码序列的共区室化相组合(参见PCT公开号W099026711和WO0040712)。用于生产和选择抗体的主要要素基本上类似于核糖体展示的体外方法。根据本发明的抗体或其抗原结合部分可以与另一种功能分子衍生或连接。例如，抗体或抗原结合部分可以通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式与一种或多种其他分子实体进行功能上连接，所述其他分子实体例如为另一种抗体、可检测的试剂、细胞毒剂、药物试剂和/或可以介导抗体或其抗原结合部分与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。常用于产生免疫毒素的细胞毒剂包括放射性同位素例如mIn或9°Y，硒，核糖核酸酶，删除了结合结构域的截短的微生物毒素例如假单胞菌外毒素或白喉毒素，微管蛋白抑制剂例如加利车霉素(ozagamicin)，美登木素生物碱(包括DM-1)，auristatins和红豆杉醇类(taxoids)，核糖体灭活蛋白例如蓖麻毒素，ebulinl,肥皂草毒蛋白和白树毒蛋白，和前体药物例如美法仑。抗体或其抗原结合部分可以与之衍生的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性的荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲基胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体还可以用可检测的酶进行衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等。当抗体用可检测的酶进行衍生化时，它通过添加该酶用于产生可检测的反应产物的另外试剂来检测。抗体还可以用生物素进行衍生化，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合进行检测。本发明还扩展至聚乙二醇化的抗体或抗原结合部分，其相对于非聚乙二醇化的抗体多肽而言提供了增加的半衰期和针对降解的抗性而无活性的损失(例如结合亲和力的减少)。如本文所述的抗体或抗原结合部分可以使用本领域已知的方法与聚合物分子(优选PEG)偶联，所述聚合物分子对于达到增加的半衰期和降解抗性性质是有用的。可以在本发明中使用的聚合物部分可以是合成或天然存在的，并且包括但不限于，直链或支化的聚亚烷基、聚亚烯基或聚氧化烯聚合物，或分支或未分支的多糖例如同或杂多糖。可以在本发明中使用的合成聚合物的优选例子包括直链或支化的聚(乙二醇)(PEG)、聚(丙二醇)或聚(乙烯醇)，及其衍生物或取代的形式。用于与本文所述的抗体连接的特别优选的取代的聚合物包括取代的PEG,包括甲氧基(聚乙二醇)。除PEG外可以使用的，或可以代替PEG使用的天然存在的聚合物部分包括乳糖、直链淀粉、葡聚糖或糖原，以及将由本领域技术人员认可的其衍生物。聚合物分子的衍生形式包括例如这样的衍生物，其中存在另外的用。此类衍生物包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯，琥珀酰亚胺基丙酸酯聚合物，和巯基-选择性反应试剂例如马来酰亚胺，乙烯砜和硫醇。特别优选的衍生化的聚合物包括但不限于具有下式的PEG聚合物PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS;PEG-0-CH2-miS;PEG-0-CH2CH2-C02-NHS;PEG-S-CH2CH2-CO-NHS;PEG-02CNH-CH(R)-C02-NHS;PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS;和PEG-0-CH2-C02-NHS;其中R是(CH2)4)NHC02(mPEG)。PEG聚合物可以是线性分子，或可以是分支的，其中多个PEG部分存在于单个聚合物中。反应性基团(例如，MAL、NHS、SPA、VS或巯基)可以直接与PEG聚合物连接，或可以经由连接体分子与PEG连接。在本发明中可用的聚合物的大小可以为500Da-60kDa，例如，1000Da-60kDa,10kDa-60kDa，20kDa-60kDa，30kDa-60kDa，40kDa-60kDa,以及高达50kDa-60kDa。在本发明中使用的聚合物，特别是PEG，可以是直链聚合物或可以具有分支的构象。在本发明中可用的聚合物(PEG)分子可以使用本领域众所周知的方法与抗体或其抗原结合部分附着。在PEG或其他聚合物部分与本发明的抗体多肽单体或多聚体附着中的第一个步骤是用包含亲电子体的官能团替换PEG聚合物的羟基末端基团。特别地，将PEG聚合物与抗体多肽单体或多聚体中存在的半胱氨酸或赖氨酸残基附着。所述半胱氨酸和赖氨酸残基可以是天然存在的，或可以被改造到抗体多肽分子中。例如，半胱氨酸残基可以在抗体多肽的C-末端上进行重组改造，或者在抗体多肽中特异的溶剂可接近位置处的残基可以用半胱氨酸或赖氨酸置换。可以将抗体与能够增加其体内半衰期的一种或多种分子连接。这些分子在抗体上除抗原结合位点外的位点处与抗体连接，从而它们不干扰/在空间上阻碍抗原结合位点。通常，此类分子是体内天然存在并且抵抗经由内源性机制的降解或去除的多肽。对于本领域技术人员显而易见的是，可以使用此类天然存在的分子的片段或衍生物，并且某些可以不是多肽。增加半衰期的分子可以选自下述(a)来自细胞外基质的蛋白质，例如，胶原，层粘连蛋白，整联蛋白和纤连蛋白；(b)在血液中发现的蛋白质，例如纤维蛋白，ot-2巨球蛋白，血清白蛋白，纤维蛋白原A,纤维蛋白原B，血清淀粉样蛋白A，庚珠蛋白(heptaglobin)，蛋白质，泛蛋白，子宫球蛋白(uteroglobulin)，p-2微球蛋白，纤溶酶原，溶菌酶，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，oc-l-抗胰蛋白酶和胰腺胰蛋白酶抑制剂；(c)免疫血清蛋白，例如IgE，IgG，IgM;(d)转运蛋白，例如视黄醇结合蛋白，oc-l微球蛋白；(e)防卫素，例如P-防卫素1，嗜中性粒细胞防卫素1、2和3;(f)在血脑屏障处或在神经组织中发现的蛋白质，例如黑皮质素受体、髄磷脂、抗坏血酸转运体；(g)转铁蛋白受体特异性配体-神经药物试剂融合蛋白(参见US5977307);脑毛细管内皮细胞受体，转铁蛋白，转铁蛋白受体，胰岛素，胰岛素样生长因子1(IGF1)受体，胰岛素样生长因子2(IGF2)受体，胰岛素受体；(h)定位于肾的蛋白质，例如多囊蛋白，IV型胶原，有机阴离子运载体Kl，Heymann's抗原；(i)定位于肝的蛋白质，例如乙醇脱氢酶，G250;(j)凝血因子X;(k)oc-l抗胰蛋白酶；(1),1oc;(m)定位于肺的蛋白质，例如分泌组分(结合IgA);(n)定位于心脏的蛋白质，例如HSP27;(o)定位于皮肤的蛋白质，例如角蛋白；(P)骨特异性蛋白质，例如骨形态发生蛋白(BMPs)，例如BMP-2、-4、-5、-6、-7(也称为成骨蛋白(0P-1))和-8(0P-2);(q)肿瘤特异性蛋白质，例如人滋养层抗原，赫赛汀(herceptin)受体，雌激素受体，组织蛋白酶例如组织蛋白酶B(在肝和脾中发现)；(r)疾病特异性蛋白质，例如仅在活化的T-细胞上表达的抗原包括LAG-3(淋巴细胞活化基因)；护骨蛋白配体(OPGL)，参见Nature402,304-309,1999;0X40(TNF受体家族的成员，在活化的T细胞上表达，以及为已知在产生人T细胞白血病病毒I型(HTLV-I)的细胞中特异性地上调的唯一共刺激T细胞分子——参见J.Immunol.2000Jull;16561:263-70);金属蛋白酶(与关节炎/癌症相关)，包括CG6512果蝇，人截瘫蛋白，人FtsH，人AFG3L2，鼠类ftsH;血管生成生长因子，包括酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，血管内皮生长因子/血管通透性因子(VEGF/VPF),转化生长因子-a(TGF-oc)，肿瘤坏死因子-ot(TNF-ct),血管生成素，白介素-3(IL-3)，白介素-8(IL-8)，血小板衍生内皮生长因子(PD-ECGF)，胎盘生长因子(P1GF)，中期因子(midkine)血小板衍生生长因子-BB(PDGF)，CXXXC趋化分子(fractalkine)j(s)应激蛋白质(热休克蛋白)；(t)参与Fc转运的蛋白质；和(u)维生素，例如B12，生物素。在另一个方面，本发明提供了药物组合物，其包含有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合部分，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂或稀释剂。"药学上可接受的赋形剂或稀释剂"包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的栽体的例子包括水、盐水、磷酸盐緩冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合中的一种或多种。在许多情况下，优选地将是在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇、山梨糖醇，或氯化钠。术语"有效量，，指足以治疗或改善指定疾病或病症或一种或多种其症状，和/或预防或减少所述疾病或病症发生的抗体或其抗原结合部分(包括包含抗体或其抗原结合部分的药物组合物)的量。术语"诊断有效量，，或"对于诊断来说有效的量"及其同源术语指足以诊断指定疾病或病症和/或一种或多种其表现的抗体或其抗原结合部分(包括包含抗体或其抗原结合部分的药物组合物)的量，其中诊断包括鉴定所述疾病或病症的存在和/或检测所述疾病或病症的程度或严重度。通常，诊断将相对于在没有所述疾病或病症的个体中观察到的基线或背景检测水平来进行。超过背景或基线水平的检测水平(升高的检测水平)是存在的指示，并且在某些情况下是病状严重度的指示。当相关于治疗方法以及抗体或其抗原结合部分(包括包含抗体或其抗原结合部分的药物组合物)的用途进行使用时，"有此需要的"个体可以是被诊断为患有待治疗的疾病或病症，或者先前对于待治疗的疾病或病症进行治疗的个体。相关于诊断方法，"有此需要的"个体可以是怀疑患有疾病或病症，处于疾病或病症的风险中，或先前被诊断为具有所述疾病或病症的个体(例如，诊断可以包括随着时间过去和/或与治疗一起地监控疾病或病症的严重度(例如，进展/消退))。优选的是，抗体或其抗原结合部分阻断或刺激受体功能或中和活性可溶性产物，例如一种或多种白介素，TNF或C5a。更优选地，活性可溶性产物是人TNF-oc。所述组合物可以是各种形式，包括液体、半固体或固体剂型，例如液体溶液(例如的可注射和可输注的溶液)，分散液或悬浮液，片剂，丸剂，粉剂，脂质体或栓剂。优选地，所述组合物是用于免疫接种的可注射溶液的形式。施用可以是静脉内、皮下、腹膜内、肌内、经皮、鞘内和动脉内。优选地，剂型为每天、每周、每二或三周或每月施用约0.001mg-约10mg/kg体重，更优选地每周约0.05-约5mg/kg体重。所述组合物还可以配制为用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末。在某些实施方案中，活性化合物可以用载体来制备，所述载体将保护化合物不被快速释放，例如受控释放制剂，包括植入物，透皮贴剂和微胶嚢化的递送系统。可以使用相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯或聚乳酸。所述组合物还可以配制用于口月艮施用。在这个实施方案中，抗体可以封装在硬或软壳明胶胶嚢中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。所述组合物还可以配制用于直肠施用。可以施用所述抗体以便在体外和体内与所选择的细胞结合并鉴定所选择的细胞，在体内与所选择的细胞结合并破坏所选择的细胞，或者在体内渗透到所选择的细胞内并破坏所选择的细胞。备选地，所述抗体可以用作免疫毒素，以将细胞毒剂例如毒素或化学治疗剂递送至特定细胞类型例如肿瘤细胞。免疫毒素的产生将是本领域技术人员熟悉的。在优选实施方案中，所述组合物给人施用。本发明还提供了抗体或其抗原结合部分在诊断应用中的用途，所述诊断应用用于检测与特定疾病或病症有关的抗原。更具体而言，根据第三个方面，本发明提供了抗体或其抗原结合部分在用于诊断具有与特定疾病或病症有关的抗原的受试者的方法中的用途，所述方法包括给所述受试者施用诊断有效量的如本文所述的抗体、其抗原结合部分或药物组合物。优选地，受试者是人。抗体或其抗原结合部分(优选地经标记的)可以用于检测生物样品例如血清或血浆中抗原的存在，或升高的抗原(例如TNF-cx)水平，使用常规的免疫测定法，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学。优选地，嵌合抗体或其抗原结合部分所结合的抗原在性质上是肽、蛋白质、碳水化合物、糖蛋白、脂质或糖脂，选自肺瘤相关抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受体，涉及免疫或炎性疾病或病症的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI类、MHCII类、GM-CSF、千扰素-y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-ot和IgE，在宿主细胞上表达的抗原，包括糖蛋白IIb/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受体和粘附受体，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144，包含细胞因子、趋化因子、生长因子或其他可溶性生理学调节剂或其受体的抗原，包括嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受体，涉及中枢神经系统疾病或病症的抗原，包括p-淀粉样蛋白和感染性蛋白质，非人源的抗原例如微生物、纳米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、响尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗体充当激动剂或拮抗剂，或者对于通过与补体或杀伤细胞(例如NK细胞)一起作用来消除(杀死或去除)不希望的细胞(例如，抗CD4)来说是有活性的，或者对于作为细胞毒剂或引起吞噬细胞对Fc受体的结合来说是有活性的，或者中和其靶的生物活性。根据本发明的抗人TNF-ot抗体或其抗原结合部分还可以在其中希望抑制TNF-oc活性的细胞培养应用中使用。本发明还提供了用于在人受试者中治疗特征在于人TNF-oc活性的疾病或病症的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用根据本发明的如本文所述的抗体、其抗原结合部分或药物组合物，其中所述抗体或其抗原结合部分结合TNF-cx。如本文所使用的，术语"特征在于人TNF-a活性的疾病或病症"意欲包括这样的疾病或病症，即其中在患有所述疾病或病症的受试者中TNF-a的存在已显示负责或参与或被怀疑负责或参与所述疾病或病症的病理生理学，或者已显示是或被怀疑是促成所述疾病或病症恶化的因素。因此，其中TNF-ot活性有害的疾病或病症是其中预期TNF-此类疾病或病症可以由例如患有所述疾病或病症的受试者中生物学液体中的TNF-oc浓度增加(例如，受试者的血清、血浆、滑膜液等中的TNF-oc浓度增加)而得到证明，这可以例如使用对于TNF-ot特异的本发明抗体来检测。特征在于人TNF-ct活性的疾病或病症意欲包括这样的疾病或病症，即其中在患有所述疾病或病症的受试者中TNF-ot的存在已显示负责或被怀疑负责所述疾病或病症的病理生理学，或者已显示是或被怀疑是促成所述疾病或病症恶化的因素。优选地，特征在于人TNF-ot活性的疾病或病症选自败血症，包括败血症性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性败血症和中毒性休克综合征；自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、类风湿性脊推炎、骨关节炎、牛皮癣和痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化症、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾病综合征；传染病，包括由于感染和感染后继发的恶病质而引起的发热和肌痛；移植物抗宿主病；肿瘤生长或转移；肺部疾病，包括成人呼吸窘迫综合征、休克肺、慢性肺部炎性疾病、肺结节病、肺纤维化和硅肺病；炎性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎；心脏病；炎性骨病，肝炎，凝血紊乱，烧伤，再灌注损伤，瘢痕瘤形成和瘢痕组织形成。还可以将补充的活性化合物掺入所述组合物中。抗体或抗原结合部分可以与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或与一种或多种另外的治疗剂同时、分开或顺次施用，所述另外的治疗剂例如为与其他靶例如细胞因子或细胞表面分子结合的抗体，或者备选地为抑制人TNF-a产生或活性的一种或多种化学试剂。在另一个方面，本发明提供了试剂盒，其包含治疗有效量的本发明的抗体或抗原结合部分，或者含有治疗有效量的抗体或其抗原结合部分的药物组合物，以及包装和使用说明书。在某些实施方案中，使用说明书包括关于如何有效地施用治疗量的本发明抗体或抗原结合部分的指导。在本说明书自始至终，单词"包含"或者变化形式"包括"或"含有，，应当理解为暗示包括所述元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。本说明书中提及的所有出版物引入本文作为参考。本说明书中包括的文件、行为、材料、装置、物品等的任何讨论仅用于提供本发明的背景的目的。它不应被视为承认任何或所有这些内容构成现有技术基础的一部分或者是在与本发明相关的领域中的公知常识，当它在本申请的每项权利要求的优先权日期前存在于澳大利亚或其他地方时。为了能够更清楚地理解本发明的本质，现在将参考下述非限制性实施例来描述其优选形式。实施例1狨可变区与人恒定区的融合材料和方法差西合4斧义發将MOG特异性狨衍生抗体的VH链(登记号AAM54057，SEQIDNO:l)与人恒定区(人IgGl重链CHl，铰链，Ch2和Ch3結枸域)(例如NCBI登记号P01857)(SEQIDNO:2))—起表达。这通过将氨基酸序列回译成DNA序列来完成，所述DNA序列通过〗吏用GeneOptimizer技术对于哺乳动物细胞表达进行优化，并通过装配合成的寡核苷酸(GeneArt，Germany)而从新合成。在DM序列优化过程中，包括入特异性限制酶位点heI和7Y力1111以允许对Vh区迭行以后的操作。在基因合成后，将包括Kozak序列的完整序列克隆到pEE6.4GS附属载体(LonzaBiologies)的多克隆位点内。将MOG特异性狨衍生抗体的W链(登记号AAM54058，SEQIDN0:3)与人k轻链的恒定区(例如NCBI登记号AAA58989)(SEQIDNO:4))—起表达。如上文对于重链所描述的，制备编码轻链(Vl-k)氨基酸序列的DNA。在DM序列优化和合成过程中，包括入特异性限制酶位点&iWI/hrII以允许对Vl区迸行以后的操作。在基因合成后，将包括Kozak序列的完整序列克隆到PEE12.4GS表达载体(LonzaBiologies)的多克隆位点内。为了稳定的表达，将2个单基因栽体(pEE6.4-V「IgG！和pEE12.4-Vl-k)组合成双基因载体。这通过使用#WI和&/bHI从pEE6.4主链中消化出重链表达盒(hCMV-MIE启动子，Kozak序列，狨VH，人恒定区和SV40polyA位点)来完成。使用iVofI和AMII位点将所得到的片段于轻链表达盒(hCMV-MIE启动子，Kozak序列，狨VL，人k恒定区和SV40polyA位点)的下游亚克隆到pEE12.4-Vl-k载体中，从而产生表达AB138的重链和轻链(SEQIDN0s:5和6)的载体。脊染对于每次转染，将175julLipofectamine2000加入至6孑L平板的一个孔中的5mLOptimemI培养基(Invitrogen目录号11668-027和31985-062)中。在第2个孔中，将70p1表达载体(70g)加入至5mLOptimemI培养基中。在5分钟室温孵育后，将所述2个孔的内容物混合在一起并进一步进行20分钟孵育。这该第二次孵育后，将全部转染混合物加入至包含CH0K1SV细胞的T175组织培养瓶中。将细胞孵育72-96小时并收获上清液。使上清液在4,000xg下离心5分钟以使细胞碎片形成粒状沉淀，并通过0.22jam筒式过滤器进行过滤灭菌。使上清液以1mL/分钟的流速3次流经HiTrapA蛋白柱(AmershamBiosciences,目录号17-0402-01)。然后，用20mM磷酸钠以lmL/分钟洗涤柱。用0.1M柠檬酸pH3.5洗脱抗体，收集级分并立即用1MTris-HClpH9.0中和。抗体样品随后在PD-10柱(AmershamBiosciences,目录号17-0851-01)上进行脱盐。通过SDS-PAGE和大小排阻HPLC进行的抗体分析证实了正确的分子量、存在经装配的抗体和抗体的浓度。f醋伊遊为、浙通过蛋白质印迹研究了AB138保留与M26，大鼠MOG(髓磷脂-少突胶质细胞糖蛋白)的抗原结合的能力。将130mg大鼠脊髓(IMVS，Australia)在1.8mlCelLyticMCel1LysisReagent(SIGMA,C2978)中进行匀浆，并于4C孵育30分钟。经由通过27gl/2针几次抽吸裂解液并随后在4t:和13000g下离心30分钟来进行进一步的匀浆。将粒状沉淀和上清液稀释到SDS-PAGE样品緩沖液(I"mMTris-HClpH6.8，5°/。SDS,0.25%溴酚蓝，25°/。甘油)中。连同这200ju1—起，将处于1X1()6存活细胞/ml的CHOKISV细胞在13000xg和4匸下旋转1分钟，并且重悬浮于200piCelLyticMCellLysisReagent(SIGMA)中。在4C和13000xg下离心30分钟后，使上清液与合适量的SDS-PAGE样品緩冲液混合。所有样品连同分子量标记样品一起于120V在4-20%Novex预制凝胶(Invitrogen，Australia)上电泳2小时。然后，使用蛋白质印迹装置在具有20%甲醇的1XTris-甘氨酸緩冲液(BioRad，目录161+-0771)中将蛋白质转移至PVDF(BioRad，Australia),于4"C和250mA下进行2小时。然后，通过与5。/。脱脂奶粉一起在PBS中于室温孵育1小时来封闭该膜。然后，用1XPBS将该膜洗涤3次，随后于4匸与10ug/mL在PBS中的AB138一起孵育过夜。洗涤后，将该膜与在1XPBS中1:5000稀释的山羊抗人IgG(H+L)HRP缀合物(Sigma,Australia)—起于室温孵育1小时。洗涂后，使用ECLWesternBlottingAnalysisSystem(AmershamBiosciences目录RPN2109)来检测结合的抗体。进行平行实验，其中AB138被同种型匹配的无关特异性阴性对照抗体(抗TNFoc单克隆抗体)替换，以便鉴定任何非特异性的结合事件。结果在成功的蛋白质表达和纯化后，对AB138进行蛋白质印迹分析以确定它是否保留了对于大鼠MOG的结合亲和力。AB138结合大鼠脊髄澄清裂解液中存在的大小约25kDa的蛋白质，这是CH0K1SV澄清裂解液中不存在的蛋白质(图1)。阴性对照抗体不与在任一裂解液中存在的蛋白质结合，这表明AB138和大小25kDa的蛋白质之间的相互作用不是由于与人恒定区相关的人造或非特异性结合事件而引起的(图2)。这种蛋白质与大鼠MOG减去信号序列的预期大小(24.9kDa)相匹配。这个结果表明AB138保留了对于在大鼠脊髄裂解液中存在的大鼠M0G的亲和力，并且证实狨人融合抗体可以保留抗原结合能力。本领域技术人员会意识到，大鼠MOG可以使用重组DNA技术来产生，并且AB138结合大鼠M0G的能力可以在结合测定法例如ELISA或Biacore分析中进行观'J定。实施例2单克隆抗体的改造1.术语"供体序列"被定义为衍生自除新世界灵长类外的物种的任何免疫球蛋白序列。"接纳体序列"被定义为衍生自新世界灵长类的免疫球蛋白序列。"共同残基"是当通过与对于物种来说可获得的免疫球蛋白序列进行比较来测定时，在给定氨基酸位置处是共同的(例如〉30。yO残基。"非共同残基"是当通过与对于物种来说可获得的免疫球蛋白序列进行比较来测定时，在给定氨基酸位置处不是共同的(例如<30%)残基。"改造"是这样的过程，即将供体序列的结构结合特征转移到接纳体序列中，从而使得所述结构结合特征维持其结合活性。"构架氨基酸"被定义为位于抗体可变区中但不位于CDR中的氨基酸。2.缩写CDR，互补决定区；M0G，髓磷脂/少突胶质细胞糖蛋白；TNF-ot;肿瘤坏死因子-ot;VH，可变重链；V"可变轻链；BSA，牛血清白蛋白。3.改造过程A.产生单克隆抗体(除新世界灵长类单克隆抗体外)。B.基于高氨基酸序列同源性和预测的低免疫原性，选择衍生自新世界灵长类的接纳体免疫球蛋白序列。C.根据Kabat的编号系统(参见"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"E.Kabat等人,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1983)来鉴定供体和接纳体免疫球蛋白序列的CDRs。D.通过比对供体和接纳体序列来确定构架序列中的差异。E.通过三维建模来预测供体的免疫球蛋白结构，并测定相对于CDRs的构架序列差异的接近性。根据置换标准1和2(下文)用供体残基任选置换接纳体残基。F.用整个供体CDR序列置换整个接纳体CDR序列。G.通过使供体/接纳体构架氨基酸序列与种系和可获得的接纳体免疫球蛋白构架序列相比较来测定共同残基。根据置换标准3和4(下文)用供体残基任选置换接纳体残基。H.产生具有接纳体可变区和人恒定区的嵌合抗体。I.表达经改造的免疫球蛋白。J.对经改造的免疫球蛋白进行测定法分析。置换标准在基于构架序列中的差异来产生改造的抗体中，用相应的供体氨基酸置换接纳体氨基酸可以在落入下述标准中的位置处进行(i)如果基于三维建模，供体残基被预测能够与抗原相互作用；(ii)如果基于三维建模，供体残基被确定位于供体CDRs的3.2A内；(iii)如果供体残基在接纳体物种免疫球蛋白序列中是共同的；(iv)如果供体残基在供体种系中是非共同的。通过基于与等价人序列的氨基酸序列同源性和预测的低免疫原性来选择合适的接纳体序列，经改造的抗体被预测在人中是非免疫原性的或具有低免疫原性。经改造的抗体将与供体免疫球蛋白的抗原结合，其结合亲和力类似于供体免疫球蛋白。经改造的抗体的结合亲和力可以通过亲和力成熟方法而进一步得到增强(R.A.Irving等人，JournalofImmunologicalMethods,248，31-45(2001))。改造鼠类抗体AB164以产生抗体AB1974.供体免疫球蛋白序列使用杂交瘤技术产生分泌针对人TNF-cx的单克隆抗体AB164的鼠类杂交瘤，并且充当供体免疫球蛋白序列(SEQIDNO:7和8)。5.接纳体免疫球蛋白序列的选择针对大鼠M0G(髓磷脂/少突胶质细胞糖蛋白)的单克隆抗体的序列得自PubMed(http:〃謂.ncbi.nlm.nih.gov/)，并且用作接纳体序列。这种单克隆抗体衍生自普通狨(白耳狨)，其为新世界灵长类。使用所有等位基因的10/。阈值分析，通过MHCII类结合预测程序Propred(http://www,imtech.res,in/raghava/propred)，就其经预测的在人中的免疫原性来检查VH链(登记号AAM54057，SEQIDN0:l)和W链(登记号AAM54058，SEQIDNo:3)的构架区。排除MOG特异性抗体的l链(登记号AAM54057,SEQIDNO:1)和l链(登记号AAM54058,SEQIDNo:3)的CDRs的序列的BLAST分析，鉴定出了最接近的人同系物重链序列(登记号AAH19337.1;SEQIDNO:9)和轻链序列(登记号BAC53922.1;SEQIDNO:10)。值得注意的是，这种预测分析表明，所选择的接纳体重链可变构架区可能比其人等价物的免疫原性更少。接纳体重链可变区在构架中具有一种肽LRPEDTAVY，这被预测结合由等位基因DRB1—0101,DRB1—0102,DRB1-0309编码的MHCII类。然而，最接近的人同系物重链在构架中具有3种肽，所述肽被预测与MHCII类结合。这包括肽WVRQAPGQGL,它被预测结合由等位基因DRB1—0101,DRB1—0102和DRB1_0309编码的MHCII类；肽VYMELTS,它被预测结合由等位基因DRB1一0401，DRB1一0408,DRB1一0421，DRB1-0426,DRBl一llOl，DRB1_1128，DRB1-1305编码的MHCII类；和肽LRSEDTAVY，它被预测结合由等位基因DRB1一0401，DRB1一0421，DRB1-0426编码的MHCII类。MOG特异性轻链可变构架区和最接近的人同系物被预测是非免疫原性的。6.供体/接纳体可变区中的CDRs的鉴定^f吏用Kabat的规贝'J(参见"SequencesofProteinsofImmunologicalInterest"E.Kabat等人，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,1983)，测定AB164的Vh和Vl鍵(分别为SEQIDNOs:7和8)以及狨MOG特异性免疫球蛋白的Vh和、链(分别为SEQIDNOs:1和3)的CDRs(表1)。表l:AB164的Vh和W链(SEQIDNO:7和8)以及MOG-特异性免疫球蛋白的VH和Vt链(SEQIDNO:l和3)的CDRs的氨基酸位置<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>7.供体和接纳体序列的比对VH链比对使AB164和MOG特异性免疫球蛋白的VH链的氨基酸序列(SEQIDNO:7和1)进行比对(图3)。残基数目的不同在于位于MOG特异性免疫球蛋白L链的CDR3中的额外氨基酸。这两条序列之间的序列同一性为63.6%。如所预期的，CDRs的氨基酸序列不同而产生供体和接纳体抗体的不同抗原特异性。在构架区中所述序列之间存在22个氨基酸的差异。W链比对使AB164和MOG特异性免疫球蛋白的l链的氨基酸(SEQIDNO:8和3)进行比对(图4)。残基数目的不同在于位于AB164的CDR1中的4个另外氨基酸。这两条序列之间的序列同一性为62.3%。如所预期的，CDRs的氨基酸序列不同而产生供体和接纳体抗体的不同抗原特异性。在构架区中所述序列之间存在23个氨基酸差异。8.AB164的Vh和VL链的预测三维建模使用SWISS-PROT三维预测建模软件和DeepView(http:〃swissmode1.expasy.org/),测定AB164的Vh和Vt链的三维模型。鉴定出CDRs。如通过先前描述的比对所测定的，鉴定构架区中于供体和接纳体序列之间的氨基酸差异，并且关于其对CDRs的接近性进行预测(表3和4)9.用供体CDRs置换接纳体CDRsM0G特异性免疫球蛋白的Vh和W链的CDRs用AB164的Vh和^链的CDRs替换(表2)。表2:用供体序列(AB164)的CDRs替换<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>10.测定鼠类种系和狨Ig序列中的共同残基并选择改造的构架序列VH链VH区的鼠类种系比对可以在http:〃蘭.ibt.unam.mx/vir/vh-mice一directory.html#GL处找到。通过搜索来自普通狨的所有VH氨基酸序列并比对这些序列，从http:〃丽，ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb-Protein&itool=toolbar可以获得狨VH序列。使用比对工具，于在供体和接纳体序列之间在构架序列中的氨基酸存在差异的每个氨基酸位置处测定鼠类种系和可获得的普通狨序列中的共同残基(表3)。表3:供体/接纳体序列中的VH构架差异，它们与CDRs的接近性以及在供体/接纳体物种中它们的相关的共同残基。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>进行在分别的鼠类种系和可获得的狨Vh序列中每个位置处的共同残基的测定。在满足特定标准的所选择的位置处，接纳体氨基酸用供体氨基酸替换，并且那种标准的编号在下面给出1.如果基于三维建模，供体残基被预测能够与抗原相互作用；2.如果基于三维建模，供体残基被确定位于供体CDRs的3.2A内；3.如果供体残基在接纳体物种免疫球蛋白序列中是共同残基；4.如果供体残基在供体种系中是非共同的。在不满足所述标准的位置处，使用接纳体序列并且将标准列为无。注非共同残基为灰色阴影，并且置换为斜体。*鼠类种系在第113位处不包含序列数据，并且照此在此使用狨序列。总之，存在8个构架氨基酸置换，其中接纳体序列用供体序列替换。存在4个氨基酸，其中接纳体序列用供体序列替换，因为基于三维建模，供体残基被测定为位于供体CDRs的3.2A内。制备2个氨基酸置换，因为供体残基被预测能够与位于环的转弯处的抗原相互作用，所述环与CDR-2紧密接近(尽管不小于3.2A)。此外，制备2个氨基酸置换，因为供体残基被发现在可获得的接纳体物种免疫球蛋白序列中是共同的。还可以在第97位处进行进一步的改变。、链VL区的鼠类种系比对可以在http:〃www.ibt.u画.mx/vir/vk—mice-directory.html#GLvk处找到。通过搜索来自普通狨的所有氨基酸序列并比对这些序列，从http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgidb=Protein&itool=toolbar可以获得狨VL序列。使用比对工具，于与在供体和接纳体序列之间在构架序列中的氨基酸差异相关的每个氨基酸位置处测定鼠类种系和可获得的狨免疫球蛋白序列中的共同残基(表4)。表4:供体/接纳体序列中的、构架差异，它们与CDRs的接近性以及在供体/接纳体物种中它们的相关的共同残基。<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>进行在分别的鼠类种系序列和可获得的狨VL序列中每个位置处的共同残基的测定。在每个位置处应用上文给出的关于选择构架序列中的差异的标准。在满足特定标准的所选择的位置处，接纳体氨基酸用供体氨基酸替换，并且那种标准的编号在下面给出1.如果基于三维建模，供体残基被预测能够与抗原相互作用；2.如果基于三维建模，供体残基被确定位于供体CDRs的3.2A内；3.如果供体残基在接纳体物种免疫球蛋白序列中是共同残基；4.如果供体残基在供体种系中是非共同的。在不满足所述标准的位置处，使用接纳体序列并且将标准列为无。注非共同残基为灰色阴影，并且置换为斜体。*鼠类种系在第104位处及以后不包含序列数据，并且照此在此使用狨序列。总之，存在l个构架氨基酸置换，其中接纳体序列用供体序列替换，因为基于三维建模，供体残基被测定为位于供体CDRs的3.2A内。材料和方法采用标准方法通过使来自用人TNF-oc免疫的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14融合来产生AB164杂交瘤(FazekasdeSt.Groth，S.等人，JournalofImmunologicalMethods35:1-21(1980);Sugasawara，R.,JournalofTissueCultureMethods12:93-95(1989))。11.单克隆抗体AB164的测序使用RNeasyMini或Midi柱(QIAgen)并才艮据制造商的说明书从1x107-1x108存活细胞中提取总RNA(tRNA)。定量后，将tRNA用作模板以用于第一链cDNA合成，其中使用oligo(dT)引物和SuperscriptII逆转录酶(Invitrogen)并根据制造商的说明书。最终，使用RM酶H来降解tRNA,并且通过使用末端转移酶和dGTP(Roche)用poly-G尾来给剩余的单链cDNA加上标签。使用Herculase(Stratagene)(高保真度聚合酶的混合物)来进行PCR反应。在每种情况下，oligo(dC)用作正向引物，使用IgG重链特异性或K轻链特异性反向引物。30个循环后，将PCR反应体系在Taq聚合酶存在下进行孵育以添加突出A碱基。然后，将所得到的PCR产物克隆到pGemT-Easy(Promega)中，并且转化到感受态Top10大肠杆菌细胞(Invitrogen)中。使用QIAquickMiniprep柱(QIAgen)从单个菌落的过夜培养物中提取质粒并进行定量。将100—500ng—式两份地与6.4pmolpUC3正向或pUC3反向引物混合，并且提交用于使用BigDyev3，1化学(AppliedBiosystems)的循环测序。在ABIPRISM3700DNA分析仪上解析电泳图，并且进行随后的衍生序列的比对，异常碱基调入(calling)的人工校正。一旦获得4个匹配序列(2个正向和2个反向)，就确认了抗体可变区的序列。然后，将这些序列翻译成AB164的重和轻链的氨基酸序列(SEQIDNO:7和8)。12.AB138(MOG特异性狨衍生可变区-人恒定区嵌合体)和AB103(抗TNFcc鼠类可变区-人恒定区嵌合体)的形成使接納体序列的Vh区(登记号AAM54057,SEQIDNo:1)与人恒定区(人IgGl重链CHl、铰链、ch2和ch3结构域)(例如NCBI登记号P01857)(SEQIDNo:2)—起表达。使接納体序列的Vl区(登记号AAM54058，SEQIDNo:3)与人k轻链恒定结构域(例如NCBI登记号AAA58989)(SEQIDNo:4)—起表达。所得到的嵌合抗体被命名为AB138(SEQIDNO:5和6)。将这种抗体用作模板，在其中制造Vh和VL链的改变。使来自完整鼠类AB164的Vh和VL区(SEQIDNo:7和8)与如上所述的相同人恒定区一起表达。这种嵌合抗体被命名为AB103。AB103的克隆将来自完整鼠类AB164的Vh和Vl区(SEQIDNo:7和8)回译成DNA序列，所述DNA序列通过4吏用GeneOptimizer才支术对于哺乳动物细胞表达进行优化，并通过装配合成的寡核苷酸(GeneArt，Germany)而从新合成。对于Vh基因，在5，末端，每个序列的侧翼为^cl位点、Kozak序列(GCCACC)和人IgGy前导序列(氨基酸序列MEWSWVFLFFLSVTTGVHS)。在3，末端，对DNA序列进行操作以引入TY力1111限制酶位点而不损害所需氨基酸序列。对于VL基因，在5，末端，每个序列的侧翼为万s/WI位点、Kozak序列(GCCACC)和人k前导序列(氨基酸序列MSVPTQVLGLLLLWLTDARC)。在3，末端，对DNA序列进行操作以引入hrll限制酶位点而不损害所需氨基酸序列。在从新基因合成后，将可变区克隆到pCRScript载体(Stratagene)内，并且对于Vh和VL序列分别通过J"I/7YA1111和WI/"rII消化而释放出来。将释放出的序列连接到衍生自被形成用于表达经由1/7Y力111I(对于pEE6.4-VIgG!)和^/Wl/^rll(对于pEE12.4-V「k)消化而制备的AB138的载体的单基因载体主链中。使用来自Promega的LigaFastRapidDNALigationSystem(目录号M8221)将每个基因连接到所制备的主链内。然后，将连接物转化到OneShotTop10(化学感受态细胞(Invtrogen目录号C4040-03))中，并且通过标准技术鉴定阳性菌落。用于稳定表达的双基因载体如上所述(实施例1)进行制备。使用QIAfilter中等制备(midiprep)柱(QIAgen目录号l"43)通过过夜培养物的中等制备来制备大量所产生的载体。通过在含有1/10体积的3M乙酸钠(pH5，2)的100%乙醇(Sigma目录号分别为S2889和E7023-500ML)中沉淀20iag来制备载体以用于转染。在70%乙醇中洗涤后，以0.5ILXg/pl的工作浓度将载体重悬浮于40plT.E.pH8.0(Sigma目录号T9285-10亂)中。13.经改造的单克隆抗体AB197的制备使用MOG特异性免疫球蛋白作为接纳体序列以及通过将构架中的CDRs和指定残基替换为供体序列(AB164)的那些，确定了经改造的VH和Vl抗体序列。使这些可变区蛋白质序列与人恒定区一起表达(SEQIDNO:2和4)。所得到的经改造的抗体被命名为AB197(SEQIDNO:11和12)。表5描述了关于每种抗体的CDRs、VH/VL构架和恒定区的物种来源。表5:关于AB138、AB164、AB197、AB103的CDRs、VH/^构架和恒定区的物种来源<table>tableseeoriginaldocumentpage45</table通过将接纳体序列的构架中的CDRs和指定残基替换为供体序列的那些，确定了经改造的Vh和W抗体序列(SEQIDNo:11和12)。将抗体序列回译成DNA序列，并通过装配合成的寡核苷酸(GeneArt,Germany)而从新合成。在合成过程中，如前所述(实施例1)，将相关的限制酶位点掺入该序列中以允许克隆和产生表达AB197的双基因栽体。14.AB103、AB197和AB164的表达AB103和AB197的转染对于每次转染，将175jilLipofectamine2000加入至6孔平板的一个孑L中的5mLOptimemI培养基(Invitrogen目录号11668-027和31985-062)中。在第2个孔中，将70m1表达栽体(70pg)加入至5mLOptimemI培养基中。在5分钟室温孵育后，将所述2个孔的内容物混合在一起并进一步进行20分钟孵育。这该第二次孵育后，将全部转染混合物加入至包含CH0K1SV细胞的T175组织培养瓶中。将细胞孵育72-96小时并收获上清液。使上清液在4,000xg下离心5分钟以使细胞碎片形成粒状沉淀，并通过0.22jum筒式过滤器进行过滤灭菌。鼠类单克隆抗体AB164的产生使用标准组织培养方法培养来表达AB164的杂交瘤细胞，并且收获上清液并在4，000xg下离心5分钟，以使细胞碎片形成粒状沉淀，随后通过O.22jum筒式过滤器进行过滤灭菌。AB103、AB197和AB164的抗体纯化使上清液以1mL/分钟的流速3次流经HiTrapA蛋白柱(AmershamBiosciences,目录号17-0402-01)。然后，用20mM磷酸钠以1mL/分钟将柱洗涤40分钟。用0.1M柠檬酸pH3.5洗脱抗体，收集级分并立即用1MTris-HClpH9.0中和。抗体样品随后在PD-10柱(AmershamBiosciences,目录号17-0851-01)上进行脱盐。通过SDS-PAGE和大小排阻HPLC对抗体进行的分析证实了正确的分子量、经装配的抗体的存在和抗体的浓度。15.亲和力结合测定法方法ELISA方法在碳酸盐包被緩沖液(10mM磷酸二钠，MmM磷酸氢二钠pH9.6)中将TNF-oc(Peprotech目录号:300-01A)稀释至1ng/mL。将100juL这种溶液加入至96孔平板的每个孔中并在增湿的容器中于4匸孵育过夜。平板随后用洗涤緩冲液(0.01MPBSpH7.2，0.05°/。Tween-20)洗涤3次，然后用0.01MPBSpH7.2洗涤3次。通过向每个孔中加入200jiL封闭緩沖液(在0.01MPBSpH7.2中的1%w/vBSA)并使平板在增湿的容器中于25t!孵育1小时来封闭孔。将抗体在抗体稀释剂(1%w/vBSA，0.05%Tween-20，在0.01MPBSpH7.2中)中充分稀释以产生覆盖6.00ng/mL至0.0578ng/mL的滴定曲线。使孔与抗体一起于251C孵育1小时。然后如前所述洗涤平板。使用在抗体稀释剂中1:2000的100nL抗IgGH+L抗体HRP缀合物(Zymed，目录号81-71200)来检测结合的AB197和AB103。使用在抗体稀释剂中l:2000的100jLiL抗鼠类免疫球蛋白抗体HRP缀合物(Dako，目录号P0260)来检测结合的AB164。只含抗体稀释剂的孔用于测量本底吸光度。于25"C在增湿的容器中孵育1小时后，再次如前所述洗涤平板。向每个孔中加入100nLTMB底物溶液(Zymed，目录号00-2023)并允许显色4分钟。加入100nL1MHC1以终止显色反应并在450nm处测定吸光度(参照620nm)。ELISA结果使用ELISA来比较AB164、AB197和AB103与包被在固相中的TNF-oc的结合。根据这些结果，所有抗体显示对于TNF-oc的强烈结合，其中所有EC50值小于或等于0.68|ig/ml(图5，表6)。如通过使抗体AB164和AB103的结合特性图镨相比较而可见的，用人Igd恒定区(AB103)替换鼠类恒定区(AB164)不会显著降低结合亲和力。如通过使抗体AB164和AB197的结合特性图谱相比较而可见的，改造AB164以产生AB197不会导致TNF-ot结合的任何显著丧失。(图5)表6<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>使用活细胞的TNF-cc细胞毒性中和测定法(L-929中和测定法)方法在RPMI1640(Invitrogen目录号:21870-076)中培养L929细胞(ATCCNo:CCL-1)直至细胞达到70%水平的汇合，所述RPMI1640包含10%胎牛血清、50ng/mL青霉素/链霉素(Sigma目录号P0781)、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen目录号25030-081)和10pM2-巯基乙醇(Invitrogen目录号21985-023)。向96孔培养平板的每个孔内加入50jiL培养基。为了研究TNF-oc对L929细胞的细胞毒性，一式三份地向平板的第1列中加入50juLTNF-oc工作溶液/孔(30ng/mL)，经过平板进行系列半对数稀释，达到9fg/mL的终浓度。还制备含50)LiL无TNF-cc的培养基的对照孔(V=100%)。以5X1(T细胞/mL向所有孔中加入50pLL929细胞。还制备包含100jiL无另外的细胞或TNF-ot的培养基的其他对照孔(本底)。向所有孔中以40pg/mL加入放线菌素D(Sigma目录号A1410)。为了研究经改造的抗体针对TNF-a的中和作用，执行中和测定法。一式三份地向分开的平板的第1列中加入23nL10jug/mL的抗体，并且经过平板进行系列对数稀释，达到30.4pg/mL的终浓度。以5X1(T5细胞/mL向这些孔中加入50mLL929細胞。向所有孔中加入另外的25pL放线菌素D。所有平板于37t!与5%c02—起孵育20小时。孵育后，向所有孔中力口入25uLMTS/PESCellTiter96AQue0USOneSolutionReagent(Promega目录号G358B)，并且于37n孵育2小时。使用ELISA平板阅读器在492nm处读取吸光度(参照630nm)。从无细胞和无TNF的对照孔(本底)的平均吸光度中减去所有重复的处理的平均吸光度。由此，L-929细胞的生存力％计算为A492实验孔%生存力=A492V-10o%存活的xl(H)使用活细胞的TNF-oc细胞毒性中和测定法(L-929中和测定法)结果AB164、AB197和AB103能够中和TNF-ot诱导的细胞毒性(图6，表7)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>本领域技术人员将会意识到，可以对如具体实施方案中所示的本发明进行众多改变和/或修饰，而不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。因此，这些实施方案在所有方面被视为举例说明性的而非限制性的。权利要求1.抗体或其抗原结合部分，其具有可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区，其中所述构架区是新世界灵长类构架区或衍生自新世界灵长类构架区，并且其中至少一个所述CDRs是非新世界灵长类CDR。2.根据权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含3个CDRs和4个构架区。3.根据权利要求1或权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含至少一个鼠类CDR序列。4.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含至少一个小鼠CDR序列。5.根据权利要求1-4中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含至少一个大鼠CDR序歹'J。6.根据权利要求1-5中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含至少一个人CDR序列。7.根据权利要求1-6中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含至少一个合成的CDR序列。8.根据权利要求1-7中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含至少一个兔CDR序列。9.根据权利要求1-8中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含来自不同来源的CDRs的组合。10.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含3个鼠类CDR序列。11.根据权利要求10的抗体或其抗原结合部分，其中所述3个鼠类CDR序列是小鼠CDR序列。12.根据权利要求1-3中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含3个人CDR序列。13.根据权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含4个新世界灵长类构架序列。14.根据权利要求1-12中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述可变区包含4个构架区，其中所述构架区衍生自新世界灵长类构架区。15.根据权利要求1-14中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分是结构域抗体。16.根据权利要求1-15中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分进一步包含人或非人旧世界灵长类恒定区序列。17.根据权利要求1-16中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中所述新世界灵长类构架区来自新世界灵长类，所述新世界灵长类选自狨、糈、松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、绒毛猴、悬猴、秃猴、狐尾猴、夜或枭猴和吼猴。18.根据权利要求17的抗体或其抗原结合部分，其中所述新世界灵长类是狨。19.根据权利要求1-18中任一项的抗体或抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分与抗原结合，所述抗原在性质上是肽、蛋白质、碳水化合物、糖蛋白、脂质或糖脂，选自肿瘤相关抗原，包括癌胚抗原、EpCAM、Lewis-Y、Lewis-Y/b、PMSA、CD20、CD30、CD33、CD38、CD52、CD154、EGF-R、Her-2、TRAIL和VEGF受体，涉及免疫或炎性疾病或病症的抗原，包括CD3、CD4、CD25、CD40、CD49d、MHCI类、MHCII类、GM-CSF、千扰素-Y、IL-1、IL-12、IL-13、IL-23、TNF-oc和IgE,在宿主细胞上表达的抗原，包括糖蛋白IIb/IIIa、P-糖蛋白、嘌呤能受体和粘附受体，包括CDlla、CDllb、CDllc、CD18、CD56、CD58、CD62或CD144，包含细胞因子、趋化因子、生长因子或其他可溶性生理学调节剂或其受体的抗原，包括嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-6、IL-8、TGF-P、C3a、C5a、VEGF、NGF及其受体，涉及中枢神经系统疾病或病症的抗原，包括p-淀粉样蛋白和感染性蛋白质，非人源的抗原例如微生物、纳米生物或病毒抗原，或者毒素，包括呼吸道合胞病毒蛋白F、炭疽毒素、响尾蛇毒和地高辛；其中所述嵌合抗体充当激动剂或拮抗剂，或者对于通过与补体或杀伤细胞(例如NK细胞)一起作用来消除(杀死或去除)不希望的细胞(例如，抗CD4)来说是有活性的，或者对于作为细胞毒剂或引起吞噬细胞对Fc受体的结合来说是有活性的，或者中和其靶的生物活性。20.根据权利要求19的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原是人TNFot。21.根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中至少一个构架区的序列被修饰以增加结合。22.根据权利要求1-20中任一项的抗体或其抗原结合部分，其中至少一个构架区的序列被修饰以减少预测的在人中的免疫原性。23.试剂盒，其包含根据权利要求1-22中任一项的抗体或其抗原结合部分，或其药物组合物，包装，和使用说明书。24.经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其结合细胞表面抗原或细胞因子，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区，其中对所述CDRs进行选择，从而使得所述抗体或抗原结合部分与所述细胞表面抗原或所述细胞因子结合。25.权利要求24中所要求保护的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与选自下述的细胞表面抗原结合CD3、CD20、CD33、EGF-R、Her-2和CD25。26.权利要求24中所要求保护的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与TNFot或VEGF结合。27.根据权利要求24-26中任一项的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中所述抗原结合部分是结构域抗体。28.根据权利要求24-27中任一项的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或抗原结合部分进一步包含人或非人旧世界灵长类恒定区序列。29.根据权利要求24-28中任一项的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中所述新世界灵长类选自狨、糈、松鼠猴、青猴、蜘蛛猴、绒毛猴、悬猴、壳猴、狐尾猴、夜或枭猴和吼猴。30.根据权利要求29的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中所述新世界灵长类是狨。31.根据权利要求24-30中任一项的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中至少一个构架区的序列被修饰以增加结合。32.根据权利要求24-31中任一项的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，其中至少一个构架区的序列被修饰以减少预测的在人中的免疫原性。33.试剂盒，其包含根据权利要求24-32中任一项的经设计的新世界灵长类抗体或其抗原结合部分，或其药物组合物，包装，和使用说明书。全文摘要本发明提供了抗体或其抗原结合部分，其具有可变区，所述可变区包含至少2个互补决定区(CDRs)和至少3个构架区。所述构架区是新世界灵长类构架区或衍生自新世界灵长类构架区，并且至少一个所述CDRs是非新世界灵长类CDR。文档编号C07K16/18GK101287762SQ200680038157公开日2008年10月15日申请日期2006年8月15日优先权日2005年8月15日发明者A·G·多伊尔,A·W·克拉克,P·A·詹宁斯,R·D·盖伊申请人:阿拉纳治疗有限公司