本发明属于糖尿病研究领域，具体涉及一种诱导2型糖尿病灵长类动物动物模型的高糖高脂半流质膳食及其诱导方法。
背景技术：
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随着人类生活水平的提供，糖尿病的发病率也越来越高，糖尿病及其并发症已经成为威胁人类健康的一类重要疾病。因为糖尿病的发病率居高不下，所以降糖药的研发一直是药物研发中的热点，而降糖药物的研发离不开良好的动物疾病模型。目前用于降糖药研发的动物疾病模型主要有转基因疾病模型和发化学法诱导的高血糖动物模型，转基因动物模型如小鼠糖尿病模型(db/db、KK小鼠等)、大鼠糖尿病模型(GK、ZDF大鼠等)。化学药物(四氧嘧啶、链脲佐菌素)诱导的高血糖模型包括单独诱发和/或配合高脂饲料诱发的小鼠、大鼠、猴糖尿病模型。由于人类糖尿病的成因多数与饮食不节(与生活条件提高后高糖、高脂大量摄入有关)有关，但上述模型多数为啮齿类动物疾病模型，虽然与人类的同源性较高，但其疾病形成原因以及基因组与人类还是存在较大差异，在生物技术药物迅猛发展的今天，由于药物的特异性(如生物药有动物种属的选择特异性)上述模型已经不能满足药物研发的需求。啮齿类疾病动物模型的应用领域正逐渐转向降糖药物的筛选方面。而化学药物诱发的灵长类动物糖尿病模型是成因也与人类糖尿病成因具有明显的差别，如人类2型糖尿病患者多数伴有胰岛素抵抗、高胰岛素血症等特点，而化学药物诱发的灵长类动物糖尿病模型无上述该特征，其成因为化学药物损伤胰岛细胞后导致的胰岛素绝对不足。因此，建立与人类糖尿病发病相似的灵长类动物模型对新型降糖药物的研发具有非常重要的意义。
高糖高脂膳食，指的是通过人工的行为，将人类饮食结构中最常见的糖类和脂肪按一定比例混合所得的混合物。
通过高糖高脂饲料诱发灵长类动物糖尿病模型已有报道，但其制作方法为将高糖高脂加入到猴饲料中，猴通过摄入饲料而将高糖高脂成分摄入体内，日久成模。该法的不足之处为未充分考虑到灵长类动物喜爱用饲料玩耍的生活习性，饲养过程中，多数的饲料被其玩耍丢弃而浪费，不能准确的计算每个动物每天摄入高糖高脂的数量，无法量化。且由于饲料含热量较高、油腻感强，且饲料本身的口感发生了较大的变化，动物在摄入一定量的饲料后会有饱涨感，出于自我保护的作用，动物会停止摄入更大量的高糖高脂饲料，导致高糖高脂的摄入量会相对减少，从而使得造模时间大大延长。
技术实现要素：
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本发明的第一个目的是提供一种能量化、快速诱导出2型糖尿病灵长类动物动物模型的高糖高脂半流质膳食。
本发明的诱导2型糖尿病灵长类动物动物模型的高糖高脂半流质膳食，其特征在于，是通过以下方法制备的：按质量比将蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热搅拌均匀乳化制备成半流质状膳食，即为诱导2型糖尿病灵长类动物动物模型的高糖高脂半流质膳食。按照各成分的最大质量比配制的高糖高脂其流动性已达极限，即再增加各成分的质量所配制的膳食将不具备流动特性，难以通过灌胃器具送达动物的胃部。按照低于各成分最小质量比配制的高糖高脂膳食流动性较好，长期将其灌胃给予灵长类动物理论上可复制2型糖尿病灵长类动物造模，但需要耗费的时间也将会明显延长。
本发明的第二个目的是提供一种2型糖尿病灵长类动物的诱导方法，其特征在于，将上述诱导2型糖尿病灵长类动物模型的高糖高脂半流质膳食灌入灵长类动物胃部，诱导灵长类动物产生2型糖尿病，而得到2型糖尿病模型灵长类动物模型。
优选，是将诱导2型糖尿病灵长类动物模型的高糖高脂半流质膳食按照9.2-17.2g/kg灵长类动物的体重的量通过鼻饲管灌胃给予，每天一次，每周6天，连续给予25个月。
优选，所述的灵长类动物优选为食蟹猴。
本发明的第三个目的是提供一种用于筛选和评价抗2型糖尿病类药物筛选和评价研究的方法，其特征在于，根据候选药物的特点，按照一定的剂量和频率给予上述2型糖尿病灵长类动物模型，根据效果评价候选药物是否具有抗2型糖尿病作用，从而为候选药物提供筛选和/或评价研究结果。
本发明的诱导2型糖尿病灵长类动物模型的高糖高脂半流质膳食中使用的糖类和脂肪分别为人类日常生活中摄入量比较大的蔗糖、猪油、胆固醇和胆酸盐，将上述四种物质按一定的比例混合，制备成半流质膳食，将其通过鼻饲管将其灌入灵长类动物胃部，这样就可以使得灵长类动物按照体重、被动地按照一定的时间和频率精准的摄入上述高糖高脂混合物，模拟人类因物质生活条件提高而导致的饮食失节而产生的2型糖尿病。
本发明可以量化每个动物每天摄入高糖高脂的数量，并且无口感变化造成动物摄入量不足的担忧，能定时定量的摄入高糖高脂，从而大大加快了2型糖尿病模型的发病进程。本发明制作的2型糖尿病灵长类动物模型具有啮齿动物、化学药物诱发的猴糖尿病模型无法比拟的优势，可用于各种类型降糖类药物(特别是生物技术类抗糖尿病药物)的研发及评价。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.实验材料
1.1蔗糖：500g/瓶，分析纯，西陇化工。
1.2猪油：15kg/桶，食品级，海南省鼎升食品有限公司。
1.3胆固醇：500g/瓶，分析纯，上海博奥生物科技有限公司。
1.4胆酸盐：500g/瓶，分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
1.5葡萄糖：500g/瓶，分析纯，天津市北联精细化学品开发有限公司。
1.6食蟹猴：3-7岁10只，8-20岁，26只雄性，普通级，从广东蓝岛生物技术有限公司购入。
1.7胰岛素ELISA测定试剂盒，猴血浆/血清专用，从大连泛邦试剂有限公司购入，96T，原装进口。
1.8胰高血糖素ELISA测定试剂盒，，猴血浆/血清专用，从大连泛邦试剂有限公司购入，96T，原装进口。
1.9血糖测定试剂：浙江伊利康生物技术有限公司。
1.10糖化血清白蛋白测定试剂：50T/48样，南京建成生物工程研究所。
1.11胰岛素：诺华公司产品。
2.主要仪器
2.1 7020生化分析仪：7020型，日本日立公司。
2.2糖化血红蛋白测定仪：NycoCard Reader II型，挪威NycoCard公司
2.3血糖仪：强生公司产品。
2.4分光光度计：722N型，上海菁华科技仪器有限公司。
2.5恒速泵：SN-50C6型，深圳圣诺医疗设备有限公司。
2.6酶标仪：ELX808型，美国伯腾仪器有限公司
3.实验方法
3.1半流质高糖高脂膳食的制备：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐按质量百分比为下述比例混合：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5～15:5～15:0.5～1.5:0.1～1.0进行混合，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化，即制备成半流质状膳食，即为本发明的诱导2型糖尿病灵长类动物横下的高糖高脂半流质膳食。
3.2选取正常的8-20岁的雄性中老年食蟹猴26只，按体重随机分为5组，分别为高糖高脂组、高糖低脂组、低糖高脂组、低糖低脂组，每组6-7只，另外选用10只年龄为3-7岁的成年雄性猴，5只为阴性对照组，5只为高糖高脂成年组。高糖高脂组膳食质量比配方为：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝10：10：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为17.2g/kg；高糖低脂组膳食质量比配方为：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝10：5：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为13.2g/kg；低糖高脂组膳食质量比配方为：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5：10：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为13.2g/kg；低糖低脂组膳食质量比配方为：蔗糖、猪油、胆固醇、胆酸盐＝5：5：1：0.5，将各组份按其含量混合均匀，加热至约70摄氏度，搅拌均匀乳化即得，膳食给予量为9.2g/kg；各试验组动物分组后按照设定的方案灌胃给予高糖高脂膳食，每天一次，每周6天，连续19个月。按要求测定食蟹猴空腹血糖、糖化血清白蛋白、糖化血红蛋白、糖耐量、胰岛素、胰高血糖素、胰岛素抵抗等指标。
血糖测定方法：(1)食蟹猴使用氯胺酮麻醉后，从头静脉和/或隐静脉采血约1.0ml，离心后取血清，用日立7020生化分析仪测定。(2)食蟹猴保定后，手指常规消毒，用针头扎破后挤掉第一滴血液后，用血糖试纸条蘸取血液，然后强生血糖仪测定血糖和/或静脉采血后用生化分析仪测定血糖含量。造模期间0、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19个月猴的空腹血糖情况。
糖化血清白蛋白测定方法：食蟹猴麻醉后从头静脉和/或后肢隐静脉取出血液，离心后取血清，用南京建成生物研究所研发的测定试剂盒测定，测定流程严格执行试剂盒说明书。造模前、造模期间7、13、19个月猴的血清糖化白蛋白情况。
糖化血红蛋白测定方法：食蟹猴麻醉后从头静脉和/或后肢隐静脉取血，EDTA抗凝，用挪威小旋风血红蛋白测定仪测定，测定过程严格执行试剂盒说明书。测定造模前、造模期间7、13、19个月猴的糖化血红蛋白含量。
口服糖耐量测定(OGTT)方法：食蟹猴禁食不禁水过夜，保定后按体重灌胃给予50％的葡萄糖溶液(5g/kg)10ml/kg。测定给药后30min、60min、120min各试验组猴的血糖变化情况并计算曲线下面积。测定造模前、造模期间7、13、19个月猴的口服糖耐量。
胰岛素、胰高血糖素测定方法：食蟹猴麻醉后从头静脉和/或后肢隐静脉取血，EDTA抗凝，分离血浆，按照ELISA试剂盒说明书严格执行，然后使用酶标仪进行测定。测定造模期间13、19个月猴的血清胰岛素、胰高血糖素情况。
胰岛素抵抗测定方法：食蟹猴空腹12h后测定空腹血糖和胰岛素水平，然后建立两条静脉输注通道，静脉输注胰岛素和葡萄糖，5min测定血糖一次，并依靠此数据调节胰岛素的输注量，使血糖维持在正常水平，维持1.5小时，该状态下胰岛素输注量越少，胰岛素抵抗就越小。测定造模期间13、19个月猴胰岛素抵抗情况。
4.实验结果
4.1血糖研究结果(具体见表1)：研究结果表明，高糖高脂成年组、低糖低脂中老年组、低糖高脂中老年组、高糖低脂中老年组、高糖高脂中老年组在造模第11月开始血糖均明显升高，并随着造模时间的延长血糖上升的更高。各试验组血糖上升的幅度大小为：高糖高脂中老年组>低糖高脂中老年组>低糖高脂中老年组>低糖低脂中老年组>高糖高脂成年组，虽然高糖高脂成年组在成模速度方面最慢，但其使用的为正常成年动物，因此，其应用价值也最大。
表1-1食蟹猴血糖含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
表1-2食蟹猴血糖含量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.2糖化血清白蛋白研究结果(具体见表2)：研究结果表明，阴性组糖化血清白蛋白(GSP)含量试验期间相对平稳，未见明显异常。与阴性对照组相比，高糖高脂成年猴组、低糖低脂中老年组、低糖高脂中老年组、高糖低脂中老年组、高糖高脂中老年组造模第13月至19月GSP均明显升高。
表2食蟹猴糖化血清白蛋白变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
4.3糖化血红蛋白研究结果(具体见表3)：阴性对照组试验期间糖化血红蛋白(HbA1c)含量稳定，未见明显异常。与阴性对照组相比，高糖高脂青年组、低糖低脂组中老年组、低糖高脂组中老年组、高糖低脂组中老年组、高糖高脂组中老年组动物造模第13月至19月HbA1c含量均明显升高，有统计差异(P<0.01)；低糖低脂中老年组和低糖高脂中老年组造模第19月HbA1c含量明显升高，有统计差异(P<0.01)，造模19月后各试验组HbA1c平均含量均到达6.3％以上。
表3食蟹猴糖化血红蛋白变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
糖耐量研究结果(具体见表4)：实验结果表明，阴性对照组动物试验期间动物口服糖耐量(OGTT)未见明显异常。高糖高脂青年组造模第13月至19月糖耐量明显降低，曲线下面积明显增加，有统计学差异(P<0.01)；低糖低脂中老年组、低糖高脂中老年组、高糖低脂中老年组、高糖高脂中老年组造模第13月至19月糖耐量明显降低，曲线下面积明显增加，有统计学差异(P<0.01)。
表4食蟹猴糖耐量变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
胰岛素、胰高血糖素研究结果(具体见表5)：实验结果表明，阴性对照组血浆动物胰岛素、胰高血糖素水平实验期间稳定，未见明显异常。高糖高脂青年组动物造模、低糖低脂中老年组、低糖高脂中老年组、高糖低脂中老年组、高糖高脂中老年组动物造模第13月、19月后血浆胰岛素和胰高血糖素水平均明显升高，均有统计学差异(P<0.01)。
表5食蟹猴胰岛素和胰高血糖素变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
胰岛素抵抗研究结果(具体见表6)：实验结果表明，阴性对照组动物胰岛素抵抗实验期间稳定，未见明显异常。高糖高脂青年组、低糖低脂中老年组、低糖高脂中老年组、高糖低脂中老年组、高糖高脂中老年组动物造模第13月、19月后胰岛素抵抗水平均明显升高，均有统计学差异(P<0.05或0.01)。
表6食蟹猴胰岛素抵抗变化表
与阴性对照组相比，*表示P<0.05,**表示P<0.01
由此可见，本发明的高糖高脂组、高糖低脂组、低糖高脂组、低糖低脂组都成功的诱导出2型糖尿病灵长类动物模型。
实施例2：使用多种降糖作用机制的药物验证高糖高脂诱发的2型糖尿病食蟹猴模型及降糖药筛选和评价平台的建立
本发明制备的2型糖尿病食蟹猴模型与人类2型糖尿病模型非常相近，其主要特点为血糖升高，糖耐量受损、胰岛素水平升高和胰岛素抵抗。因此，根据其特点，选用了3种作用机制的药物对模型动物进行干预。第一种为双胍类的代表药物二甲双胍，其作用机制为促使外周细胞加速葡萄糖的摄取；第二类为胰岛素制剂门冬胰岛素30，通过外源性直接给予胰岛素，增加血浆胰岛素水平，从而达到降糖的目的；第三类为胰岛素增敏剂类药物的代表药物罗格列酮，其作用为促进胰岛素和受体结合，具体实验方法如下：
挑选造模成功的食蟹猴20只(2型糖尿病食蟹猴模型)，按空腹血糖值和糖耐量值分为4组，分别为模型对照组、二甲双胍组、胰岛素组、格列本脲组，每组5只。分组后分别进行给药，连续8周。分别测定动物的空腹血糖、糖耐量、糖化血清白蛋白、糖化血红蛋白等指标以评价药物的降糖作用。
首次给药、中期给药、末次给药后动态测定动物的随机血糖值，测定时间给药前、给药后30min、1、2、4、8、12、24h。
每2周测定一次动物给药后1h的随机血糖值。
每4周测定一次动物的糖耐量和糖化血红蛋白、糖化血清白蛋白。
试验结果，二甲双胍、胰岛素、罗格列酮对2型糖尿病食蟹猴模型均具有明显的降糖作用，能够明显降低模型动物的血糖、糖化血清白蛋白、糖化血红蛋白，提高动物的糖耐量。但胰岛素的作用最为明显，罗格列酮和二甲双胍，该结果与上述三种药物的作用机制完全相符。
综上所述，本发明通过高糖高脂膳食诱导2型糖尿病灵长类动物模型研发成功，可用于各类抗糖尿病药物，特别是啮齿类动物无法完成的、具有物种选择性的生物技术类抗糖尿病药物的筛选和评价。