一种用于多羟基化合物定性或定量分析的衍生化方法

专利名称：：一种用于多羟基化合物定性或定量分析的衍生化方法
技术领域：
：本发明涉及一种多羟基化合物的衍生化方法，特别涉及一种用于多羟基化合物定性或定量分析的乙酰化衍生化方法。
背景技术：
：自然界中存在的单糖可被分为中性单糖(醛糖和酮糖)、酸性单糖(糖醛酸)、糖醇、糖胺和硫代糖等，在用气相色谱法对其分析时由于其羟基的存在需要进行衍生化。目前常用于单糖衍生化的方法主要有甲基硅烷化(三甲基硅垸化)、酰基化(糖肟乙酰化和糖醇乙酰化)和甲基化等方法。目前常用的单糖衍生化方法中，硅烷化方法由于其衍生化试剂和衍生化产物遇水分子极易分解，因此要求严格的无水操作环境才能防止实验失败。在此方法中，将单糖溶于溶剂吡啶，也会发生异构现象，这将直接影响该单糖的定性定量分析；糖肟乙酰化方法无法解决酮糖检测的问题；糖醇乙酰化则由于将醛糖和酮糖都还原成相应的糖醇，导致其结果与天然存在的糖醇重叠，最终影响这些糖的定性定量。叶方挺等(叶方挺、严晓军等(2005年)利用差异衍生同步分析酸糖和酮糖，分析化学，第11期，第33巻，15691572〕曾利用糖肟乙酸酯衍生化和单糖的硅烷化两种方法进行差异衍生化达到分析酮糖醛糖的目的。但该方法需要两次不同的衍生化实验才能达到分析的目的，无疑增加了实验的操作难度以及工作的强度。我们根据单糖晶体在特定溶剂中能够保持唯一环状构型的特点，仅通过乙酰化，即可将天然构型的醛糖、酮糖、糖醇等同步定性定量分析。一、常用衍生化方法在衍生化机理方面的存在的问题1、糖肟乙酰化衍生化机理存在的问题将单糖的醛基先用盐酸羟胺肟化后再乙酰化(如图l)。此方法可较好的用于醛糖和糖醇衍生化分析，但对于酮糖，如果糖等，则无法有效肟化衍生化，原因是由于盐酸羟胺无法完全肟化酮基，导致衍生化产物不单一而产生多产物共存现象(如图2)造成此方法无法检测酮糖。2、糖醇乙酰化衍生化机理存在问题该方法对糖醇具有较好的乙酰化衍生作用，但对醛糖和酮糖则需先用硼氢化钠将其还原成相应的糖醇后再行衍生化，导致不能准确分析和测定酮糖、醛糖和醇糖同时存在时的样品。(1)、醛糖问题利用硼氢化钠将糖的醛基或酮基还原成为羟基，然后再乙酰化。也就是将酮糖和醛糖还原成糖醇，然后再对其羟基进行乙酰基衍生化，因此衍生化完全、产物单一、色谱峰形较好。〔BlakeneyA.B.,HarrisP.J.,HenryR丄andStoneB.A.(1983)Asimpleandrapidpreparationofalditolacetatesformonosaccharideanalysis.CarbohydrateResearch113,291-299.〕但此方法缺点是，醛糖被还原为糖醇(如图3和图4所示)〔孔繁祚编著(2005年)，糖化学(现代化学基础丛书05)，科学出版社，第2章，第112页)。这些由醛糖和酮糖还原后生成的糖醇，大部分在自然界中存在，并且具有重要生理意义。由于醛糖还原的糖醇掩盖了自然界真实存在的具有重要生理功能的糖醇，不仅造成了无法准确测定天然醛糖含量，也直接导致这些天然存在的糖醇无法检测。(2)、酮糖问题-一该方法无法直接检测酮糖。直链酮糖经硼氢化钠还原后，由于C-2差向异构体存在，生成两种同分异构体产物，而这些产物通常也是自然界中常见的糖醇。例如，果糖经还原后生成甘露醇和葡萄糖醇(山梨醇)(如图5、图6、表l所示)，〔孔繁祚编著(2005年)，糖化学(现代化学基础丛书05)，科学出版社，第2章，第112页)而细胞内通常就含有这两种糖醇。此外，甘露糖和葡萄糖经硼氢化钠还原后，也会对应生成甘露醇和葡萄糖醇(山梨醇)。该方法产生的还原产物与样品中原有的相应组分化合物相互重叠，因此使用该方法进行单糖分析常常会影响检测结果的真实性。表l.果糖经还原后生成甘露醇和葡萄糖醇的比率<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>二、常用衍生化方法在衍生化反应条件方面的问题…温度要求高、时间长、反应溶剂不合适1、常用衍生化方法对温度的要求1)硅烷化方法需要在70-9(TC，甚至更高温度条件下完成，否则易造成衍生化反应不完全(叶方挺、严晓军等(2005年)利用差异衍生同步分析醛糖和酮糖，分析化学，第11期，第33巻，15691572)。2)糖肟乙酰化方法中，肟化反应需要在8(TC完成，否则易造成衍生化反应不完全(叶方挺、严晓军等(2005年)利用差异衍生同步分析醛糖和酮糖，分析化学，第11期，第33巻，15691572)。3)糖醇乙酰化方法中，硼氢化钠还原反应中需要在4(TC完成，否则易造成衍生化反应不完全(BlakeneyA.B.,HarrisP.J.，HenryR丄andStoneB.A.(1983)Asimpleandrapidpreparationofalditolacetatesformonosaccharideanalysis.CarbohydrateResearch113,291-299.〕。2、常用衍生化方法对反应时间的要求1)硅垸化方法需要在高温下反应至少l小时，比较费时间〔叶方挺、严晓军等(2005年)利用差异衍生同步分析醛糖和酮糖，分析化学，第11期，第33巻，15691572〕。2)糖肟乙酰化方法中，肟化反应需要在高温下反应至少5分钟，反应步骤较多〔胡磊等(2004年)植物组织中糖与糖醇乙酰化及毛细管气相色谱分析，植物学通报，21(6),689699)。3)糖醇乙酰化方法中，硼氢化钠还原反应需要至少60-90分钟，反应步骤和化学试剂较多，浪费了宝贵时间(BlakeneyA.B.,HarrisP.J.,HenryRJ.andStoneB.A.(1983)Asimpleandrapidpreparationofalditolacetatesformonosaccharideanalysis-CarbohydrateResearch113,291-299.〕。3、常用衍生化方法所选用的溶剂的问题在硅烷化方法需用无水吡啶作为反应溶剂，而将单糖晶体溶于吡啶后会发生异构现象(如图7)，在色谱分离时出现一种单糖多个色谱峰的现象，影响对单糖的定性定量分析。三、常用衍生化试剂及衍生化产物稳定性方面的问题水分对衍生化反应及其产物的影响1)甲基硅垸化是将单糖与衍生化试剂六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅垸等反应，单糖上的羟基被甲基硅垸化。该衍生化方法需在无水环境中完成，最终生成挥发性较强的甲基硅烷衍生物。该方法受水分影响较大，需在严格无水条件下操作，否则甲基硅烷化试剂及其衍生化产物极易被水降解，影响分析结果的真实〔Marie-christineet.(1997)DeterminationofCarbohydratesintwoferrlliticsoil:analysisbycapiliarygaschromatographyafterderivatizationbysilylation.SoilBiol.Biochem.Vol.29，No.9/10,pp.1585-1589)。2)糖醇乙酰化方法中，硼氢化钠易吸潮变质，保存条件要求较高。四、常用衍生化方法在对单糖种类进行定性定量方面存在的问题1、硅烷化反应中，由于采用吡啶作为溶剂，而单糖在吡啶中会发生变旋现象，产生多种异构体。这势必会造成在检测植物样品时，由于采用吡啶作为溶剂而导致5植物样品中天然存在的单糖产生异构体，既影响该单糖的准确定性定量分析，又会因异构体产生的色谱峰占用色谱分离的宝贵时间而影响其它单糖色谱峰的分离〔Marie-christineet.(1997)DeterminationofCarbohydratesintwoferrlliticsoil:analysisbycapiliarygaschromatographyafterderivatizationbysilylation.SoilBiol.Biochem.Vol.29,No.9/10,pp.l585-1589)。2、在糖醇乙酰化方法中，由于将所有的醛糖和酮糖还原为糖醇来检测，致使无法定性定量具有重要生理意义的糖醇，减小了单糖及其衍生物的检测范围。3、在糖肟乙酰化方法中，盐酸羟胺无法将酮糖的酮基肟化，导致该方法无法有效检测酮糖(叶方挺、严晓军等(2005年)利用差异衍生同步分析醛糖和酮糖，分析化学，第11期，第33巻，15691572)。4、对酸性单糖、糖胺的检测1)目前对酸性单糖如糖醛酸、糖胺如葡萄糖胺仅可以使用硅烷化方法进行衍生化，但由于硅烷化反应条件要求苛刻，硅烷化产物遇水容易分解，致使其定性定量的可靠性大打折扣。2)糖醇乙酰化和糖肟乙酰化相对于硅垸化反应的条件来说较为容易，且乙酰化产物在干燥的条件下比较稳定，可以长期保存，但这两种方法又不能将酸性单糖和糖胺有效衍生化，限制这些方法的使用范围〔Marie-christineet.(1997)DeterminationofCarbohydratesintwoferrlliticsoil:analysisbycapiliarygaschromatographyafterderivatizationbysilylation.SoilBiol.Biochem.Vol.29,No.9/10,pp.l585-1589〕。五、常用衍生化方法对检测材料需求量的问题传统的单糖分析技术的每一次分析通常需要生物样本材料0.5-1.0g，这对于研究微量材料或濒危生物来说无疑会造成很大的损伤。六、常用衍生化方法对环境的影响1、在硅烷化方法中，用吡啶作为溶剂。吡啶对环境污染较严重，对人体健康危害较大有强烈刺激性；能麻醉中枢神经系统。对眼及上呼吸道有刺激作用。高浓度吸入后，轻者有欣快或窒息感，继之出现抑郁、肌无力、呕吐；重者意识丧失、大小便失禁、强直性痉挛、血压下降。误服可致死。慢性影响长期吸入出现头晕、头痛、失眠、步态不稳及消化道功能紊乱。可发生肝肾损害。可致多发性神经病。对皮肤有刺激性，可引起皮炎，有时有光感性皮炎。燃爆危险吡啶易燃，具强刺激性。吡啶危险特性其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热极易燃烧爆炸。与氧化剂接触猛烈反应。高温时分解，释出剧毒的氮氧化物气体。与硫酸、硝酸、铬酸、发烟硫酸、氯磺酸、顺丁烯二酸酐、高氯酸银等剧烈反应，有爆炸危险。流速过快，容易产生和积聚静电。其蒸气比空气重，能在较低处扩散到相当远的地方，遇火源会着火回燃。若遇高热，容器内压增大，有开裂和爆炸的危险。2、糖肟乙酰化使用盐酸羟胺作为肟化试剂，但盐酸羟胺剧毒，对皮肤有刺激性。小鼠经口LD50为400mg/kg3、糖醇乙酰化方法中利用硼氢化钠作为还原剂，而硼氢化钠对人体健康危害严重强烈刺激粘膜、上呼吸道、眼睛及皮肤。吸入后，可因喉和支气管的痉挛、炎症和水肿，化学性肺炎和肺水肿而致死。口服腐蚀消化道。急性毒性LD5018mg/kg(大鼠腔膜内)。硼氢化钠危险特性遇水、潮湿空气、酸类、氧化剂、高热及明火能引起燃烧。从以上分析可以看出，常用的衍生化溶剂、肟化试剂、还原试剂均会对环境、对人体健康造成严重的危害，因此发掘一种毒性小、衍生化反应简便、衍生化效果好的衍生化试剂有很重要的应用价值。
发明内容本发明的目的是提供一种多羟基化合物的衍生化方法。本发明所提供的多羟基化合物衍生化方法，是将含多羟基化合物样品置于以二甲基亚砜为溶剂，以l-甲基咪唑为催化剂，乙酸酐为衍生化试剂的反应体系中，进行乙酰化衍生化反应。所述二甲基亚砜、1-甲基咪唑和乙酸酐的添加体积份数比可为(二甲基亚砜)(乙酸酐)(l-甲基咪唑)=(5000100):(500010):(20001)，优选为50:3-24:2，特别优选为25:3:1。所述含多羟基化合物样品与所述二甲基亚砜的比例为10-lg:1000-10ml，优选为lg:10ml。所述多羟基化合物羟基摩尔数与乙酸酐的摩尔比为1:5-40;优选为1:10。上述多羟基化合物包括醇类(如香豆醇)和糖及糖的衍生物，优选为糖和/或糖的衍生物；其中，糖是指:双糖、单糖、三糖和四糖中的一种或两种以上任一混合。所述单糖为中性单糖(醛糖和酮糖)和酸性单糖(糖醛酸)中的一种或两种以上任一混合；所述醛糖为2-脱氧-核糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖中的一种或两种以上任一混合。所述酮糖为果糖。所述糖的衍生物为糖醇、糖醛酸和糖胺中的一种或两种以上任一混合。所述糖醇为赤藓糖醇、2-脱氧-核糖、鼠李糖醇、核糖醇、岩藻糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、半乳糖醇的一种或两种以上任一混合。所述糖醛酸为葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸的一种或两种以上任一混合。所述糖胺为N-乙酰-葡萄糖胺。为了方便操作，上述二甲基亚砜、1-甲基咪唑和乙酸酐可组成一个试剂盒，可以三个试剂独立包装，也可以分成两个试剂包装，即分成试剂A(DMSO+1-甲基咪唑)，试剂B(DMSO+乙酸酐)，试剂A为DMSO和1-甲基咪唑的混合液，试剂B为DMSO和乙酸酐的混合液，包装时，其中DMS0、乙酸酐与1-甲基咪唑体积比为(5000100):(500010):(20001)，优选为50:3-24:2,特别优选为25:3:1。上述方法可用于不同生长阶段的各植物组织中多羟基化合物如糖类的定性和定量的检测，具有简单、省时，环保，并且使用本发明的方法对糖类如单糖等进行乙酰化衍生化，可以在维持糖的天然构象的基础上进行衍生化，具体可产生如下优点一、解决了常用衍生化方法在衍生化机理方面所存在问题1、对糖肟乙酰化衍生化机理存在的问题的解决在糖肟乙酰化方法中，盐酸羟胺无法有效肟化酮基，造成此方法无法检测酮糖。将酮糖晶体直接溶于DMSO溶剂后，由于酮基参与形成环状构型，因此解决了在糖肟乙酰化方法中盐酸羟胺无法肟化酮基的问题。2、对糖醇乙酰化衍生化机理存在问题的解决方法在糖醇乙酰化方法中，醛糖被还原为糖醇，直链酮糖由于C-2上存在差向异构体，导致在还原过程中产生两种糖醇。这些由醛糖和酮糖还原后生成的糖醇，大部分在自然界中存在，并且具有重要生理意义。糖醇乙酰化方法直接导致这些天然存在的糖醇无法检测。本发明所采用的溶剂为二甲基亚砜(DMSO)，该有机溶剂极性(7.2)略弱于水(10),与单糖分子的极性较为接近，将单糖晶体溶于该溶剂后，可以维持单糖结晶状态下单一的环式结构。在环式醛糖状态下，由于醛糖的醛基形成半縮醛的环状结构，因而减小了醛糖分子的极性，在此状态下，直接对其进行乙酰化，便可形成该醛糖所特有的乙酰化产物，而不必将醛糖还原成为糖醇形式。将酮糖晶体直接溶于该溶剂后，同样由于酮基参与形成环状构型，而无法形成直链状态下以C-2为新的对称中心的差向异构体，因此既解决了在糖肟乙酰化方法中盐酸羟胺无法肟化酮基的问题，又避免了在糖醇乙酰化方法中直链酮糖被还原称为两种对应的糖醇的结果。二、本发明解决了常用衍生化方法在衍生化反应条件方面所存在问题1、对常用衍生化方法中对温度的要求的解决硅烷化方法、糖肟乙酰化方法、糖醇乙酰化均需要较高温度才能使衍生化反应完全，而利用二甲基亚砜(DMSO)为反应溶剂、以l-甲基咪唑为催化剂、乙酸酐为乙酰化试剂，在室温(18-25°C)下就可以完成衍生化反应。其原因是该方法仅有乙酰化，省去了糖肟乙酰化方法中较难掌握的肟化反应、以及糖醇乙酰化方法中温度要求较高的硼氢化钠还原反应。2、常用衍生化方法中对时间的要求的解决硅烷化方法、糖醇乙酰化均需要较长时间(l小时左右)才能使衍生化反应完全，由于利用二甲基亚砜(DMSO)为反应溶剂、以l-甲基咪唑为催化剂、乙酸酐为乙酰化试剂，仅有乙酰化，省去了糖肟乙酰化方法中较难掌握的的肟化反应、以及糖醇乙酰化方法中对时间要求较长的硼氢化钠还原反应，因此仅需五分钟即可完成全部衍生化反应。3、本发明避免了常用衍生化方法中溶剂选择不当的问题硅烷化方法、糖肟乙酰化方法常使用吡啶作为溶剂，而将单糖晶体溶于吡啶中，也会发生变旋现象，产生异构体。这将导致硅垸化反应后，产生单糖的异构峰，占用色谱分离的宝贵时间而影响其它单糖色谱峰的分离。本方法采用二甲基亚砜作为溶剂，该有机溶剂极性(7.2)略弱于水(10)，与单糖分子的极性较为接近，经参考文献和反复实验证明，将单糖溶于此溶剂，温度在18-25"C时，不会发生变旋现象，且各单糖晶体时的环状结构得到维持，在此溶剂中直接乙酰化，各单糖色谱峰型唯一，无异构峰出现。三、本发明对常用衍生化试剂及衍生化产物稳定性方面所存在问题的解决1、在硅垸化方法中，硅烷化试剂及硅垸化产物遇水分子极易分解，导致衍生化A^.六/r-门么、/;小GkU/4^m/rutv"u乂、7乂《H'hfj工ru/乂/i乂、y、人。2、在糖醇乙酰化反应中，还原试剂硼氢化钠也需要避水保存以防变性。本方法中所用到的试剂A(DMSO+1-甲基咪唑)，试剂B(DMSO+乙酸酐)二者化学性质稳定，均不需要特殊环境保存。3、本方法所生成的单糖环式乙酰化产物结构稳定，经干燥后可以长期保存。四、本方法解决了常用衍生化方法在对单糖进行定性定量方面存在的难题1、硅垸化方法采用吡啶作为溶剂，单糖在吡啶中会产生异构体，且硅垸化试剂和硅烷化产物遇水易分解，因此影响色谱检测结果的真实性。本方法选用DMSO作为衍生化溶剂，单糖在该溶剂中不会发生异构，且乙酰化产物不会遇水分解，因此可以对天然生物样品中的单糖进行更为准确的定性定量分析。2、糖肟乙酰化无法检测酮糖，糖醇乙酰化将所有的醛糖和酮糖还原为了糖醇，9因此无法准确定量生物体内原有糖醇的含量。本方法溶剂DMSO维持了各种醛糖和酮糖晶体唯一的环状构型，因此在乙酰化反应后，也能够维持其独有的环式结构，色谱分离时，不会因为结构相同，而使色谱峰重叠在一起。该方法克服了前两种乙酰化方法的缺点，首次实现了用乙酰化方法同时检测醛糖、酮糖和糖醇。3、硅烷化方法虽然可以检测酸性单糖(糖酸)和碱性单糖糖胺，但由于该方法要求严格的无水环境，它的使用受到一定程度的限制。将酸性单糖如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和碱性单糖如葡糖萄糖胺溶于本方法溶剂DMSO中，可以维持酸性单糖的环状内酯结构和碱性单糖糖胺的环状结构，并对其直接乙酰化，可生成用于色谱分析的乙酰化产物，因此本方法也适用于对酸性单糖和碱性糖胺的分析检测。五、本发明解决了常用衍生化方法对检测材料需求量的问题传统的单糖分析技术的每一次分析通常需要材料0.5-1.0g，这对于研究微量材料或濒危生物来说无疑会造成很大的损伤。本方法由于采用DMSO对生物样品进行直接提取，提取后在DMSO溶液中直接进行乙酰化，减少了中间浓縮等步骤，从而减少了单糖的损失，因此可以将生物材料样品用量降低到50mg以下，也可直接取一滴或几滴生物体汁液直接用于该方法进行衍生化分析，该方法结果与传统方法相比，从实验二甲基亚砜与常用方法提取单糖含量和种类差异性统计分析实验结果看出，统计分析无明显差异，本方法大大减小了对生物材料的样品用量，降低了对生物的损害。六、本发明降低了对环境的影响(与常用衍生化方法相比)本发明用二甲基亚砜为溶剂(一种透明、无色、无臭、呈微苦味的液体，毒性极低且环境友好的水溶性的化合物)，能溶解绝大多数有机化合物，主要用于无水有机化学合成反应和医药及中间体合成反应溶剂，使用该溶剂能提高化学反应速度，提高反应物的回收率，縮短反应时间，使合成反应变得更加顺利。与硅垸化、糖肟乙酰化、糖醇乙酰化相比，本方法无吡啶、无盐酸羟胺、无硼氢化钠还原试剂等有毒或剧毒物质，因此本方法最为环保。图1为肟化反应过程图2为果糖(Fructose)肟化后乙酰化产物总离子流图图3为葡萄糖(Glucose)经硼氢化钠还原为山梨醇(Sorbitol)的分子方程式图4为葡萄糖(Glucose)经硼氢化钠还原为山梨醇(Sorbitol)后再乙酰化的总离子流图图5为果糖(Fructose)在硼氢化钠还原下生成山梨醇(Sorbitol)和甘露醇10(Mannitol)的分子方程式图6为果糖(Fructose)经硼氢化钠还原后再乙酰化生成山梨醇(Sorbitol)和甘露醇(Mannitol)的总离子流图图7为葡萄糖(Glucose)溶于吡啶后直接乙酰化生成a呋喃型葡萄糖、0呋喃型葡萄糖的总离子流图图8为环式果糖(Fructose酮糖)乙酰化反应(DMSO中直接乙酰化)图9为环式果糖(Fructose酮糖)乙酰化产物(DMSO中直接乙酰化)总离子流图图IO为环式葡萄糖(Glucose醛糖)乙酰化反应(DMSO中直接乙酰化)图ll为环式葡萄糖(Glucose醛糖)乙酰化产物(DMSO中直接乙酰化)总离子流图图12为环式果糖(Fructose)乙酰化反应(DMSO中直接乙酰化)图13为环式果糖(Fructose)乙酰化产物(DMSO中直接乙酰化)总离子流图图14为半乳糖醛酸环状内酯(糖醛酸)乙酰化产物(DMSO中直接乙酰化)图15为N-乙酰葡萄糖胺(糖胺)环状乙酰化产物(DMSO中直接乙酰化)图16为24种糖色谱图，即GC-DSQ-MS检测24种糖总离子流图。图17为脱氧核糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图18为阿拉伯糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图19为岩藻糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图20为鼠李糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图21为木糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图22为半乳糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图23为葡萄糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图24为果糖乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。11图25为肌醇乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图26为糖胺乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图27为半乳糖醛酸乙酰化产物质谱图与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图比较图谱，此图证明了该单糖在二甲基亚砜中，维持了单糖结晶状态下的环状构型。图28为DMSO、1-甲基咪唑与乙酸酐以不同比例混合对衍生化反应的影响具体实施例方式下述方法中的方法，如无特别说明，均常规方法。实施例1、本发明用于糖类定性或定量分析的羟基衍生化方法的确定一、单糖衍生化方法的筛选针对
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所述目前糖类(如酮糖、醛糖、醇糖等)定性或定量分析存在的种种问题，本发明的发明人对乙酰化衍生化方法进行确定，以解决目前存在问题。以下述24中单糖及其衍生物进行衍生化实验，并分析其效果，筛选衍生化技术方案。具体方法如下所述1、实验仪器与材料真空浓縮仪、真空冷冻干燥仪、Finnigan气相色谱质谱连用仪，微量注射器等。24种单糖标样均购买自Sigma(USA)公司，分别是脱氧核糖(纯度>99.0%)、鼠李糖(纯度>98.0%)、岩藻糖(纯度>99.0%)、木糖(纯度>99.0%)、阿拉伯糖(纯度>99.0%)、半乳糖(纯度>99.0%)、葡萄糖(纯度>99.0%)、赤藓糖醇(纯度〉99.0%)、脱氧核糖醇(纯度>99.0%)、鼠李糖醇(纯度>99.0%)、岩藻糖醇(纯度>99.0%)、木糖醇(纯度>99.0%)、阿拉伯糖醇(纯度>99.0%)、半乳糖醇(纯度>99.0%)、葡萄糖醇(纯度>99.0%)、甘露醇(纯度>99.0%)、核糖醇(纯度>99.0%)、肌醇(纯度>99.0%)、果糖(纯度>99.0%)、半乳糖醛酸(纯度〉99.0%)、葡萄糖醛酸(纯度>99.0%)、^乙酰葡萄糖胺(纯度>99.0%)、蔗糖(纯度>99.0%)、海藻糖(纯度>99.0%)。二甲基亚砜(色谱纯)、l-甲基咪唑(分析纯)、乙酸酐(分析纯)、硼氢化钠(分析纯)、乙酸乙酯(色谱纯)均购买自国内试剂公司。2、24种糖衍生化实验选用二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，1-甲基咪唑为催化剂，乙酸酐为乙酰化试剂，对上述7种醛糖(脱氧核糖、鼠李糖、岩藻糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖)、ll种糖醇(赤藓糖醇、脱氧核糖醇、鼠李糖醇、岩藻糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、葡萄糖醇、甘露醇、核糖醇、肌醇)、l种酮糖(果糖)、2种糖醛酸(半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸)、1种糖胺(N-乙酰葡萄糖胺)、2种双糖(蔗糖、海藻糖)进行了衍生化实验，以衍生化产物进行定性分析及24种糖总离子流图的制作，具体方法为分别称取10mg各糖标样，加入lml二甲基亚砜，作为母液保存。对24种单糖定性分析时，各取单糖母液分别加入24个2ml离心管中，然后分别加入350ul二甲基亚砜、60ul乙酸酐、20ull-甲基咪唑使DMSO:乙酸酐:l-甲基咪唑二25:3:l，使糖浓度使单糖羟基数与乙酸酐摩尔数之比为1:10。将上述反应体系分别在室温下反应5分钟后，分别加入500ul乙酸乙酯和500ul水，蜗旋5分钟后，取lul有机相上GC/MS检测，制作24种糖离子流图和24种糖总离子流图。制作24种单糖总离子流图时，分别取100ul上述24种单糖有机相混合于l支试管中，低温抽干后，用100ul乙酸乙酯复溶，取lul进GC/MS检测，以上处理均为三个重复。其中，色谱及质谱分析条件为美国热电Finnigan气相色谱质谱连用仪，色谱条件DB-17柱(30mX0.318mmi.d，0.25umfilmthickness)，进样口温度250°C，载气为99.999%的高纯He,流速1ml/min，初始柱前压26.3kPa，柱温度100°C(保持3.5min)，15°C/min至160°C(保持20min)，15°C/min至200°C(保持15min)，20°C/min至280°C(保持5rain)。分流进样l(il(分流比IO)。质谱条件用电子轰击(electronimpactEI)源分析,电子能量为70eV，离子源温度26(TC,接口温度250°C。选取全离子碎片扫描模式时，质量扫描范围为50-600，溶剂延迟3.5min。24种糖总离子流图如图16所示，部分单糖离子流图如图9、图11、图13所示，色谱图结果如图16所示，7种醛糖、1种酮糖、1种糖醇、1种糖胺和1种糖醛酸乙酰化产物质谱图(位于上方的图)与标准质谱库环式单糖乙酰化标准谱图(位于下方的图)比较图如图17-27所示脱氧核糖(图17)、阿拉伯糖(图18)、岩藻糖(图19)、鼠李糖(图20)、木糖(图21)、半乳糖(图22)、葡萄糖(图23)、果糖(图24)、肌醇(图25)、糖胺(图26)、半乳糖醛酸(图27)。以下述果糖的肟化和果糖、葡萄糖等的硼氢化钠还原后乙酰化方法作为对照果糖的肟化操作方法如下，取10mg果糖标样溶于lml水中配成母液，取10ul母液置于玻璃毛细管中，抽真空干燥后，加入10ul盐酸羟胺溶液(l-甲基咪唑溶解，100mg/ml)，80。C水浴5分钟，然后加入10ul乙酸酐，混匀，反应5分钟。加入10ul水和10ul乙酸乙酯，振荡5分钟后，静置取有机相lul进GC/MS。制作离子流图。结果如图2所示。果糖、葡萄糖等的硼氢化钠还原后乙酰化方法如下取10mg单糖标样溶于lml水中配成母液，取200ul母液，加入2ml硼氢化钠溶液(二甲基亚砜配置，0.02g/ml)，振荡混匀后4(TC摇床中反应90分钟。加入0.2ml冰醋酸，混匀反应5分钟，将以上溶液加入0.4m11-甲基咪唑，再逐渐加入4ml乙酸酐，搅拌10分钟，加入8ml乙酸乙酯，并用20ral水洗三次，取有机相旋干，最后用lml乙酸乙酯复溶，取lul进GC/MS检测。制作离子流图。结果如图4、图6所示。上述结果表明，在环式醛糖状态下，由于醛糖的醛基形成半縮醛的环状结构，因而减小了醛糖分子的极性，在此状态下，直接对其进行乙酰化，便可形成该醛糖所特有的乙酰化产物，而不必将醛糖还原成为糖醇形式。将酮糖晶体直接溶于该溶剂后，同样由于酮基参与形成环状构型，而无法形成直链状态下以C-2为新的对称中心的差向异构体，因此既解决了在糖肟乙酰化方法中盐酸羟胺无法肟化酮基的问题，又避免了在糖醇乙酰化方法中直链酮糖被还原称为两种对应的糖醇的结果。具体如下所述1)对常用糖肟乙酰化衍生化无法检测酮糖的问题的解决早在1968年，Pigman和Isbdl研究发现每种糖的结晶具有单一的构象。二甲基亚砜(DMSO)能维持单糖的环式构型。本发明针对对当前单糖衍生化方法中所存在的问题，利用DMSO能维持单糖晶体状态环式构型这一特点，在DMSO中直接进行乙酰化衍生化。将酮糖晶体直接溶于DMSO溶剂后，由于酮基参与形成环状构型，而无法形成直链状态下以C-2为新的对称中心的差向异构体，因此解决了在糖肟乙酰化方法中盐酸羟胺无法肟化酮基的问题。在DMSO溶剂中酮糖反应式如图8所示，环式果糖乙酰化产物(DMSO中直接乙酰化)总离子流图如图9所示，结果表明，由于果糖结晶状态的环式结构在DMSO中得到很好的维持，没有异构峰的出现，因此乙酰化后在色谱分离时，峰型唯一，保留时间提前。2)对糖醇乙酰化衍生化机理存在问题的解决采用二甲基亚砜(DMSO)为溶剂，该有机溶剂极性(7.2)略弱于水(10)，与单糖分子的极性较为接近，将单糖晶体溶于该溶剂后，可以维持单糖结晶状态下单一的环式结构。在环式醛糖状态下，由于醛糖的醛基形成半縮醛的环状结构，因而减小了醛糖分子的极性，在此状态下，直接对其进行乙酰化(反应式如图IO所示)，便可形成该醛糖所特有的乙酰化产物，而不必将醛糖还原成为糖醇形式(如图11所示)。图11表明，将葡萄糖晶体溶于DMSO溶液中，晶体的环状结构得到维持，色谱分析时，峰型唯一，与山梨醇(葡萄糖醇，图4)色谱峰无重叠。将酮糖晶体直接溶于二甲基亚砜(DMSO)后，同样由于酮基参与形成环状构型，而无法形成直链状态下以C-2为新的对称中心的差向异构体(图12)，因此既解决了在糖肟乙酰化方法中盐酸羟胺无法肟化酮基的问题，又避免了在糖醇乙酰化方法中直链酮糖被还原称为两种对应的糖醇的结果(如图5、图6、表l所示)。如图12、13所示，由于果糖结晶状态的环式结构在DMSO中得到很好的维持，没有异构峰的出现，因此乙酰化后在色谱分离时，峰型唯一。3)硅烷化方法虽然可以检测酸性单糖(糖酸)和碱性单糖糖胺，但由于该方法要求严格的无水环境，它的使用受到一定程度的限制。将酸性单糖如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和碱性单糖如葡糖萄糖胺溶于本方法溶剂DMSO中，可以维持酸性单糖的环状内酯结构和碱性单糖糖胺的环状结构(如图14、图15)并对其直接乙酰化，可生成用于色谱分析的乙酰化产物，因此本方法也适用于对酸性单糖和碱性糖胺的分析检测。二、本发明的单糖衍生化定性分析的标准曲线及最低检测限分别取100ul步骤一的步骤2获得的24种单糖用二甲基亚砜、乙酸酐和1-甲基咪唑乙酰衍生化后得到的有机相混合于1支试管中(共设3个重复)，低温抽干后，用100ul乙酸乙酯复溶，然后逐级稀释为100ng/ul、50ng/ul、25ng/ul、12.5ng/ul、6.25ng/ul、lng/ul、0.5ng/ul、0.25ng/ul、0.1ng/ul。各浓度分别取lul从低到高进GC/MS检测。标准曲线分别取100ng/ul、50ng/ul、25ng/ul、12.5ng/ul、6.25ng/ul、1ng/ul六个点做，每个点重复三次。最低检测限分别为各单糖在GC/MS检测基线三倍信噪比的浓度，最低定量检测限分别为各单糖在GC/MS检测基线十倍信噪比的浓度。其中，色谱及质谱分析条件如步骤一的步骤2所述，结果如表2所示，由表2可以看出24种糖分离度好，24种糖的之间的分离度均大于1.5，最低(理论)检测限可达fmol级，最低检测限达到10-15fmol，线形范围好，在0.05-50mg/L的范围内线性良好。表2.单糖及其衍生物质谱学特征<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>三、加标回收率标准样品、植物样品(植物材料取自北京林业大学校园内生长约IO年的毛白杨新鲜叶片，取下后立即液氮速冻备用)和植物样品中添加标准样品分别经过提取后以仪器(仪器及色谱质谱分析条件如步骤一的步骤2所述)检测得到色谱峰的峰面积，用标准曲线公式分别计算这些峰面积对应的进样量，分别记为幼、S1和S2，回收率=("-Sl)/別xl00。/。。本次实验在植物样品毛白杨新鲜叶片粉末中添加24种标准样品三个浓度，分别为每毫克植物样品中分别加入24种糖5ng、10ng、20ng标准样品。然后分别加入二甲基亚砜、乙酸酐和1-甲基咪唑的混合物(DMSO:乙酸酐:l-甲基咪唑=25:3:1)，具体操作如下所述称取九份植物样品，每份50mg，分别加入24种糖5ng、10ng、20ng标准样品，三种标准样品浓度均分三个重复。然后加入衍生化试剂(二甲基亚砜、乙酸酐和1-甲基咪唑=25:3:1)580ul，提取并衍生化1小时，加入500ul乙酸乙酯和500ul水，振荡混匀5分钟后静置分层，取有机相lul进GC/MS分析。结果如表3所示，由表3可以看出植物样品中加入单糖或双糖，单糖回收率高，重复性好。表3单糖及其衍生物加标回收率及精密度检测(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>上述步骤一、步骤二、步骤三的结果表明，24种糖在二甲基亚砜、乙酸酐和l-甲基咪唑衍生化方法下可以得到有效乙酰化，醛糖、酮糖、糖醛酸、糖胺的天然环状结构得到维持，且在色谱分离时，24种糖的之间的分离度均大于1.5，最低检测限达到10-15fmol，在0.05-50mg/L的范围内线性良好，三种不同浓度加标平均回收率在90%以上，相对标准偏差在0.01%-5%之间。结果表明24种糖分离度好，线形范围好，最低(理论)检测限可达fmol级；24种糖回收率高，重复性好。四、本发明衍生化方法中各试剂的成分及其配比筛选以葡萄糖-半乳糖-果糖为例，对溶剂DMSO、催化剂1-甲基咪唑和乙酰化试剂乙酸酐最佳配比进行筛选，具体方法如下所述实验仪器与材料真空浓縮仪、真空冷冻干燥仪、Finnigan气相色谱质谱连用仪，微量注射器等。以植物样品中常见的3种单糖为例，葡萄糖(纯度>99.0%)、半乳糖(纯度>99.0%)、果糖(纯度>99.0%)标样均购买自Sigma(USA)公司。二甲基亚砜(色谱纯)、1-甲基咪唑(分析纯)、乙酸酐(分析纯)、乙酸乙酯(色谱纯)均购买自国内试剂公司。实验方法以植物样品中常见的3种单糖葡萄糖、半乳糖、果糖为例，分别取三种单糖0.5mg，加入四组不同试剂配比的溶液中进行衍生化，每组三个重复。在第一组中，三种单糖共1.5mg，其总羟基数与乙酸酐比例为1:5，DMSO:乙酸酐:l-甲基咪唑=25:1.5:1,分别加入500ul、30ul、20ul。在第二组中，三种单糖共1.5mg，其总羟基数与乙酸酐比例为1:10，DMSO:乙酸酐:1-甲基咪唑二25:3:1，分别加入500ul、60ul、20ul。在第三组中，三种单糖共1.5mg，其总羟基数与乙酸酐比例为1:20，DMSO:乙酸酐:1-甲基咪唑=25:6:1，分别加入500ul、120ul、20ul。在第一组中，三种单糖共1.5mg，其总羟基数与乙酸酐比例为1:40，DMSO:乙酸酐:l-甲基咪唑25:12:l，分别加入500ul、240ul、20ul。室温反应5分钟后，对四组实验中分别加入500ul乙酸乙酯和500ul水，蜗旋五分钟后，静置分相后，取有机相lul进GC/MS检测。其中，色谱及质谱分析条件如步骤一的步骤2所述。结果如表3和图28所示，由实验结果可以得到，当单糖羟基数与乙酸酐摩尔比为1:10，DMS0、乙酸酐与l-甲基咪唑以25:3:1混合时，衍生化效果最佳。表3.DMSO、M3基咪唑与乙酸，汗以不同比例混合对衍生化反应的影响编号Glc-Gal-Fru总量(mg)乙酸酐(uL)Mol比(单糖羟基数与乙酸酐)1-甲基咪唑(uL)二甲亚砜(uL)三糖总峰面积(rAU)11.5301:52050037292840±581045021.5601:102050041709920±460156731.51201:202050035364329±394196441.52401:402050030239701±4728519为了使用方便，上述三种试剂可组成一个试剂盒，试剂盒中三种试剂独立包装或者分两种试剂包装保存试剂A(DMSO+l-甲基咪唑)和试剂B(DMSO+乙酸酐)；试剂A为DMSO和1-甲基咪唑的混合液，试剂B为DMS0和乙酸酐的混合液包装时，使其中DMS0、乙酸酐与1-甲基咪唑以25:3:1。18实施例2、本发明方法对新鲜毛白杨叶片可溶性糖进行衍生化并定量检测利用实施例1的衍生化方法(DMSO、乙酸酐与1-甲基咪唑以25:3:1混合)对毛白杨新鲜叶片中可溶性单糖及其衍生物的检测，具体方法如下所示l.实验仪器与材料24种糖标样均购买自Sigma(USA)公司，分别是脱氧核糖(纯度>99.0%)、鼠李糖(纯度>98.0%)、岩藻糖(纯度>99.0%)、木糖(纯度>99.0%)、阿拉伯糖(纯度>99.0%)、半乳糖(纯度>99.0%)、葡萄糖(纯度〉99.0%)、赤藓糖醇(纯度>99.0%)、脱氧核糖醇(纯度>99.0%)、鼠李糖醇(纯度>99.0%)、岩藻糖醇(纯度>99.0%)、木糖醇(纯度>99.0%)、阿拉伯糖醇(纯度>99.0%)、半乳糖醇(纯度>99.0%)、葡萄糖醇(纯度〉99.0%)、甘露醇(纯度>99.0%)、核糖醇(纯度>99.0%)、肌醇(纯度>99.0%)、果糖(纯度>99.0%)、半乳糖醛酸(纯度〉99.0%)、葡萄糖醛酸(纯度>99.0%)、N-乙酰葡萄糖胺(纯度〉99.0。/。)、蔗糖(纯度〉99.0%)、海藻糖(纯度>99.0%)。甲醇(分析纯)、氯仿(分析纯)、乙酸乙酯(色谱纯)均购买自国内试剂公司，去离子水、电子天平。二甲基亚砜(色谱纯)、1-甲基咪唑(分析纯)、乙酸酐(分析纯)分别独立包装，或者按照实施例1所述分为试剂A和试剂B保存，其中试剂A中为二甲亚砜(DMSO)与乙酸酐按25:6混合的混合液，试剂B为二甲亚砜(DMSO)与l-甲基咪唑按25:2混合的混合液。二甲亚砜在使用之前用氢氧化钾脱水处理。植物材料取自北京林业大学校园内生长约IO年的毛白杨新鲜叶片，取下后立即液氮速冻备用。使用器材包括真空浓縮仪、真空冷冻干燥仪、烘箱、Finnigan气相色谱质谱连用仪，微量注射器等。2单糖标准溶液的制备分别称取10mg糖标样溶lml二甲亚砜中，配成母液。使用后马上贮存于-8(TC冰箱中。配置标准曲线时，直接将母液配成其他浓度的标准溶液衍生化。3、提取及衍生化处理方法称取六份低温冻干的新鲜毛白杨叶片粉末，每份50mg，取其中三份加入上述试剂A和试剂B共580ul，使其中加入提取液DMSO500ul、乙酰化试剂乙酸酐60ul、催化剂1-甲基咪唑20ul，振荡提取1小时。然后加入500ul乙酸乙酯和500ul水，蜗旋5分钟后，离心5分钟5000转/分钟，取有机相lul直接进GC/MS分析。另外三份分别加入提取液500ul(氯仿:甲醇:水=12:5:3)，振荡提取1小时，离心5分钟5000转/分钟，取出上清抽真空旋干，加入60ul乙酸酐和20ull-甲基咪唑，振荡混匀后，反应5分钟，然后加入500ul乙酸乙酯和500ul水，蜗旋5分分钟后，取有机相lul直接进GC/MS分析。另取新鲜毛白杨叶片称取50mg三份，液氮速冻后，至于研钵中磨碎，取出后加19入DMSO500ul，振荡提取1小时，然后加入乙酸酐60ul、催化剂1-甲基咪唑20ul，振荡混匀后，室温反应5分钟。加入500ul乙酸乙酯和500ul水，蜗旋5分钟后，离心5分钟5000转/分钟，取有机相lul直接进GC/MS分析。利用SPSS软件13.0对三种方法进行t值检验。4、色谱及质谱分析条件美国热电Finnigan气相色谱质谱连用仪，色谱条件DB-17柱(30mX0.318mmi.d，0.25umfilmthickness)，进样口温度250°C，载气为99.999。/。的高纯He,流速1ml/min，初始柱前压26.3kPa，柱温度IO(TC(保持3.5min),15°C/min至160°C(保持20min)，15°C/min至200°C(保持15min)，20°C/min至280°C(保持5min)。分流进样lpl(分流比IO)。质谱条件用电子轰击(electronimpactEI)源分析，电子能量为70eV,离子源温度26(TC,接口温度25(TC。选取全离子碎片扫描模式时，质量扫描范围为50-600，溶剂延迟3.5min。5、结果与讨论结果如表4所示，结果表明，利用本发明的衍生化试剂进行衍生化，单糖种类的检测范围得到由10种左右扩充到24种。糖肟乙酰化方法与糖醇乙酰方法均无法与本方法相比；由检测结果可以看出，本发明的衍生化试剂很好的解决了糖肟乙酰化和糖醇乙酰化无法直接检测的酮糖的问题。由下表4结果可以分析得到，二甲基亚砜提取单糖种类与含量与传统提取方法相比没有显著差异。表4.不同提取方法对毛白杨(Populustomentosa)叶片中可溶性单糖及其衍生物组成及<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表中数据为每100克^&白杨叶片粉末所含单糖量(n=3)±SE;D,未检测到；blSTD:内标实施例3、新鲜毛白杨叶片细胞壁糖组分分析利用实施例1筛选的衍生化方法(DMSO、乙酸酐与1-甲基咪唑以25:3:1混合)新鲜毛白杨叶片细胞壁糖组分分析，具体方法如下所示1、实验材料使用的试剂有二甲亚砜(DMSO)、乙酸酐、l-甲基咪唑、乙酸乙酯等。单糖及糖醇标样为赤藓糖醇、脱氧核糖、岩藻糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、核糖醇、木糖醇、肌醇、甘露醇、山梨醇、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰葡萄糖胺、海藻糖、蔗糖。以上试剂及标准单糖均为分析纯。二甲亚砜在使用之前用氢氧化钾脱水处理。植物材料取自北京林业大学校园内生长约IO年的毛白杨新鲜叶片，取下后立即液氮速冻备用。使用器材包括低温高速离心机、控温摇床、真空冷冻干燥仪、Finnigan气相色谱质谱连用仪，微量注射器等。2、单糖标准溶液的制备分别称取20mg糖标样溶lml脱水二甲亚砜中，配成母液。使用后马上贮存于-80。C冰箱中。配置标准曲线时，直接将母液配成其他浓度的标准溶液衍生化。3、不溶于乙醇粉末(alcohol-insolubleresidue)的制备称取约10g己打碎的自然风干的新鲜叶片，加入约300ml的PBS，置于42"水浴约1小时，离心，弃上清，重复3两次，加入80%乙醇，离心弃上清，重复6次，至上清无颜色，70°C，95%乙醇洗三次,最后一次清洗后，7000rpm，离心15min，弃上清，力m00ml丙酮悬起，7000rpm，离心15min，弃上清即可。最后于烘箱45。C烘干，待除淀粉。除淀粉,用TypeIporcinea-amylase(Sigma-Aldrich23u/mg)，配浓度约为20u/m(50mMTris-HCL，PH7.0)。淀粉酶酶解样品以后，用水洗三次样品。ddH20清洗三次后，加约100-150ml丙酮洗一次，10000rpm，离心7min，去掉上清后，烘箱45t:烘干。粉末待做分级分解。4、细胞壁总糖的测定每个重复称取20mgA丄R(不溶于乙醇粉末)样品置于干燥试管中，加入72%(质量比)硫酸，立即振荡混匀。于25"C摇床200转中水解60min。加入肌醇作为内标。振荡混匀后在灭菌锅中12rC水解90min。冷却后加入浓氨水中和。5、细胞壁分级组分的制备与水解称取A.I.R粉末100mg6个重复。用果胶酶反应溶液(3ul/ml)分解A丄R粉末。摇床中24°C200rpm24小时。收集上清于50ml离心管中。重复三次，用2mlddH20清洗沉淀三次，收集上清过玻璃纤维滤膜。加Na2C03(50mM)和EGTA(5mM)溶液10ml于沉淀中，摇床中24°C12小时。上清过玻璃纤维滤膜并收集于50ml离心管中，重复三次，用2mlddH20清洗沉淀三次，收集合并上清过玻璃纤维滤膜。加1MK0H禾Pl%NaBH4(DMSO溶液)8ml于沉淀中，涡流沉淀后，放于摇床中25t:i2小时。重复三次，用2mlddH20清洗沉淀三次，收集上清过玻璃纤维滤膜。加4MKOH和l%NaBH4(DMSO溶液)8ml于沉淀中，涡流沉淀后，放于摇床中25X:i2小时。重复三次，用2mlddH20清洗沉淀三次，收集合并上清过玻璃纤维滤膜。以上各组分用BaC03中和、透析、水解。6、衍生化处理取200ul步骤5制备的各水解液低温冻干，加入实施例2所述的试剂A260ul和试剂B260ul共580ul，使DMSO:乙酸酐l-甲基咪唑25:3:1,反应5分钟后，加入500ul乙酸乙酯和500ul水，蜗旋5分钟后，离心5分钟5000转/分钟，取有机相lul直接进GC/MS分析。7、色谱及质谱分析条件美国热电Finnigan气相色谱质谱连用仪，色谱条件DB-17柱(30mX0.318mmi.d，0.25umfilmthickness)，进样口温度250。C，载气为99.999%的高纯He，流速1ral/min，初始柱前压26.3kPa，柱温度IO(TC(保持3.5min)，15°C/min至160°C(保持20min)，15°C/min至200°C(保持15min)，20°C/rain至280°C(保持5min)。分流进样lul(分流比lO)。质谱条件用电子轰击(electroni即actEI)源分析，电子能量为70eV，离子源温度260°C，接口温度250°C。选取全离子碎片扫描模式时，质量扫描范围为50-600，溶剂延迟3.5min。8、结果与讨论22细胞壁总糖的测定结果如表5，细胞壁分级组分单糖种类及含量的测定结果表6所示，结果表明，采用本发明的衍生化试剂进行衍生化检测到细胞壁中含有比例较高的果糖组分，①这对研究酮糖在细胞壁中的作用具有重要意义。②除检测到细胞壁中含有果糖，还可检测到甘露醇、山梨醇等部分糖醇，这说明如果采用传统糖醇乙酰化方法，将导致分析结果不能反映各真实单糖含量，原因是果糖还原为了甘露醇和葡萄糖醇，而甘露糖和葡萄糖也会分别被还原为甘露醇和葡萄糖醇，而天然细胞壁本身也含有少量的甘露醇和葡萄糖醇。这直接可能导致分析结果失真。采用本发明的衍生化方法进行衍生化对毛白杨新鲜叶片的细胞壁糖组分分析，首次发现该细胞壁中含有较高含量的果糖，这对进一步研究酮糖在细胞壁中的生理作用有重要意义。该方法弥补了以前单糖及其衍生物在乙酰化分析中的缺陷，实现了天然构型的醛糖、酮糖、糖醇、糖醛酸、糖胺和双糖的同步分析。表5.毛白杨(PopMfastowe^0M)叶片细胞壁总单糖组成及含量种类含量(吗mg—1)ScicncGgPChPpiJBCj2-脱氧-核糖0.061±0.005NDNDNDND木糖15.043±0.137NDDeDfDe鼠李糖8.891±0.022NDDDD醛糖岩藻糖2.195±0.017NDDDD阿拉伯糖27.796±1.451NDDDD半乳糖6.934±0.019NDDDD葡萄糖238.085±2.694NDDDD酮糖果糖66.944±1.845NDNDNDND糖醇赤藓糖醇0.088±0.004NDNDNDND2-脱氧-核糖醇NDaNDNDNDND鼠李糖醇0.035±0.009DcDDND核糖醇NDNDNDNDND岩藻糖醇0.026±0.001DDDND阿拉伯糖醇0.129±0細DDDND木糖醇0.358±0.006DDDND肌醇ISTDbDDDND甘露醇0.383±0.005DDDND山梨醇0.489±0,003DDDND半乳糖醇0.632±0.007DDDND糖醛酸葡萄糖醛酸NDNDNDNDND半乳糖醛酸NDDdDDD糖胺N-乙酰-葡糖胺NDNDNDNDND23<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表6.毛白杨(尸o/7"/M叶片细胞壁分级组分中各单糖及单糖衍生物含量及各组分所占比例<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a对从毛白杨(Populustomentosa)叶片中抽提出的酒精不溶性粉沫进行分级处理。首先用特定的内切多聚糖醛酸酶(来自黑曲霉)处理，然后用EGTA/Na2C03抽提，随后用1N的K0H溶液提取，最后采用4N的KOH溶液进行抽提。用冰醋酸中和可溶性组分，然后透析除去盐分，最后低压冻干。各组分采用Saeman方法水解，BaC03中和，取上清低压冻干，DMSO复溶后直接乙酰化，随后进行GC/MS分析。b各组分占总量比例eND,未检测到^STD:内标权利要求1、多羟基化合物衍生化方法，是将含多羟基化合物样品置于以二甲基亚砜为溶剂，以1-甲基咪唑为催化剂，乙酸酐为衍生化试剂的反应体系中，进行乙酰化衍生化反应。2、根据权利要求1所述的衍生化方法，其特征在于所述反应体系中，DMSO、乙酸酐和1-甲基咪唑的添加体积比为(5000100):(500010):(20001)。3、根据权利要求2所述的衍生化方法，其特征在于所述反应体系中，DMSO、乙酸酐和1-甲基咪唑的添加体积比为50:(3-24):2.4、根据权利要求3所述的衍生化方法，其特征在于所述反应体系中，DMSO、乙酸酐和l-甲基咪唑的添加体积比为25:3:1。5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述含多羟基化合物样品与所述二甲基亚砜的比例为10-lg:1000-10ml，优选为lg:10ml。6、根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于所述多羟基化合物为糖和/或糖的衍生物。7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述糖为单糖和/或双糖和/或三糖和/或四糖；优选为单糖；所述糖的衍生物为糖醇、糖醛酸和糖胺中的一种或两种以上任一混合。8、权利要求1-7中任意一项所述的方法在对样品中多羟基化合物定性和/或定量检测中的应用。9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述多羟基化合物为糖和/或糖的衍生物。10、根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述糖为单糖和/或双糖和/或三糖和/或四糖；优选为单糖。全文摘要本发明公开了一种多羟基化合物衍生化方法。该方法是将含糖样品置于1-甲基咪唑为催化剂，乙酸酐为衍生化试剂的反应体系中，进行乙酰化衍生化反应。本发明的方法可以在维持糖的天然构象的基础上进行乙酰化衍生化，衍生化后得到单一衍生化产物，更能够准确进行定性定量分析的各种单糖。文档编号C07C67/00GK101531557SQ20091008265公开日2009年9月16日申请日期2009年4月23日优先权日2009年4月23日发明者科李,蒋湘宁,谭玉朋,陈雪梅申请人:北京林业大学