专利名称：具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物的制作方法
具有超延迟时效特征的新型胰岛素衍生物本发明涉及具有基础时效特征的新型胰岛素类似物、其制备及用途。糖尿病发病率近些年逐年增高，几近流行的程度。该病能严重缩短预期寿命。糖 尿病患者必须频繁补充外源胰岛素。优化胰岛素治疗是合情理的。现在可获得具有特定药 理性质的不同胰岛素。实际上，根据作用持续时间，不同胰岛素可区分为短效胰岛素、速效 胰岛素、长效胰岛素和混合型胰岛素。长效胰岛素也称为慢效胰岛素(slow insulin)、贮库 型胰岛素(cbpot insulin)或基础胰岛素(basal insulin)。在许多这些胰岛素产品中的 活性成分是所谓的胰岛素类似物，其通过取代、删除和/或添加一个或更多个氨基酸而从 人胰岛素制得。术语“胰岛素类似物”和“胰岛素”在此处具有相同的意思。强化的胰岛素治疗策略试图通过针对稳定控制血糖水平而降低健康风险，该稳 定控制血糖水平通过早期施予基础胰岛素而实现。现有的一个基础胰岛素例子是药物 LantUS (活性成分甘精胰岛素=Gly(A21)，Arg(B31)，Arg(B32)人胰岛素)。开发新 型的改良型基础胰岛素的一般目标是将低血糖事件降至最低。关于这一点，理想的基础胰 岛素是在每一位患者中可靠地作用至少24小时的胰岛素。理想的胰岛素效力应延迟开始 且时效特征应尽可能平缓，以使短暂的低血糖症风险明显降到最低并甚至可在未提前进食 的情况下施予胰岛素。当胰岛素效力以相同水平持续尽可能长时间时基础胰岛素供应良 好，即身体得到了恒定量的胰岛素供应。因此低血糖事件风险得以降低并将患者特异的差 异和日期特异的差异降至最低。因此，理想基础胰岛素的药物动力学谱的特征是作用延迟 开始且作用延迟，即作用长效且均一。然而，尽管已经获得了治疗上的优点，截至目前公开的慢效胰岛素均未显示出理 想基础胰岛素的药物动力学性质。目标胰岛素的时效特征应尽量平缓且长效，以使患者的 低血糖事件风险和日期依赖的差异风险进一步降低并使作用时间进一步延长，以便在某些 环境下不必再每日施予胰岛素。这可简化糖尿病患者的治疗，特别是均不再能自己注射胰 岛素的老年糖尿病患者和需要照料的糖尿病患者，因此也将具有重大的经济利益。此外，这 样的基础胰岛素也有利于早期II型糖尿病。临床医师报道，许多人对注射存在恐惧感从而 不能及时开始进行胰岛素治疗。结果不能很好的控制血糖，导致后期的胰岛素后遗症。基 础胰岛素减少了注射给与的胰岛素剂量数，使胰岛素治疗更为患者所接受。Kohn等(ρ印tides 28(2007)935-948)描述了如何能通过制备胰岛素类似物优化 胰岛素药效动力学的做法，与人胰岛素的等电点(Pl = 5.6)相比，通过在B链末端或A链 和B链的N末端添加赖氨酸或精氨酸，所述胰岛素类似物的等电点向碱性方向移动，因此降 低了在生理条件下的溶解度并使时效特征得以延长。关于这一点，Kohn等人文中的化合物 18 (Arg (AO) ,Gly (A21) ,Arg(B31) ,Arg(B32)人胰岛素(实验测定的 pi = 7. 3 ；计算的 pi = 7.58)被描述为上下文中理想的最佳化合物。因此，Kohn等把设计新型胰岛素类似物的主 要目标理解为将带正电荷的氨基酸添加到人胰岛素的氨基酸序列，以将等电点从pi = 5. 6 增加到中性范围。然而，现在惊奇地发现，用胰岛素类似物获得了所描述的目标基础时效特征，所述 胰岛素类似物的特征为
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·Β链末端由如赖氨酰胺或精氨酰胺(argininamide)的酰胺化碱性氨基酸残基组 成，即，在B链末端的酰胺化碱性氨基酸残基上，末端氨基酸的羧基以其酰胺化形式存在， 及· A8氨基酸位置被组氨酸残基所占据，及·Α21氨基酸位置被甘氨酸残基、丙氨酸残基、丝氨酸残基或苏氨酸残基所占据，及·包含45、々15、418、8-1、80、81、82、83和財的组中不超过一个的氨基酸残基对 应于Asp或Glu0令人惊奇地，恰好是该所述的胰岛素类似物具有接近理想的目标时效特征优点， 即延迟的平缓作用开始和更长的作用持续时间。因此，低血糖事件风险被明显降低。该延 迟是如此显著以至于可以令人惊奇地在大鼠实验模型中检测到该效力。如图2中所示，作 为对比，不能在大鼠中明确地观察到甘精胰岛素的延迟作用。图1显示了本发明的化合物 YKL202和YKL203的低血糖作用。大鼠实验中获得的结果在犬类实验中得到了确认。再一 次观察到该化合物的作用持续时间明显长于甘精胰岛素的作用持续时间。因此，提供了可 以以明显低的频率施予的新型基础胰岛素。除了这些所述的药物动力学优点，与甘精胰岛 素相比，本发明的胰岛素类似物具有更好的药理学性质。此外，请求保护的胰岛素也具有理 化优点。现在惊奇地发现，通式I的胰岛素类似物具有目标药理学特征，即作用延迟开始、 效力更持久且均一
SS
15 丨10 丨1520
A-I AO Al I V E Α5 C C H S ICS LY Al5 L E A18 Y C A21
, A 链
SEO ID ΝΟ:1
\
s
I
B-I B0B1VB3B4 HLCGSHLVEALYLV 151015
T PB29 B30 B31 B32
30其中A-I对应于Lys、Arg或氨基；AO对应于Lys、Arg或化学键；Al 对应于 Arg 或 Gly ；A5 对应于 Asp、Glu 或 Gln ；A15 对应于 Asp、Glu 或 Gln ；A18 对应于 Asp、Glu 或 Asn ；
SEQ ID NO:2
Y 链
7 5 F 2
F
B
G R E
G20 S——C
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A21 对应于 Ala、Ser、Thr 或 Gly ；B-I对应于Asp、Glu或氨基；BO对应于Asp、Glu或化学键；Bl对应于Asp、Glu、Phe或化学键；B3 对应于 Asp、Glu 或 Asn ；B4 对应于 Asp、Glu 或 Gln ；B29 对应于 Arg, Lys 或选自包含 Phe, Ala、Thr、Ser、Val、Leu、Glu 或 Asp 的组的 氨基酸，或化学键；B30对应于Thr或化学键；B31对应于Arg、Lys或化学键；B32对应于Arg-酰胺或Lys-酰胺。其中，包含A5、A15、A18、B_l、B0、Bi、B2、B3和B4的组中不超过一种的氨基酸残 基对应于Asp或Glu。因此，本发明涉及这些胰岛素类似物。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物，其中包含A5、A15、A18、B-l、B0、Bi、 B2、B3和B4的组的一种氨基酸残基对应于Asp或Glu。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物，其中，优选地，A-I对应于Arg，A0对 应于Arg、A5对应于Glu、A15对应于Glu、A18对应于Asp、A8对应于His、A21对应于Gly、 BO对应于Glu、B3对应于Asp、B4对应于Glu、B30对应于Arg或B30对应于Lys。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物选自Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，Asp (A18)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，Asp (A18)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Asp (A18)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Asp (A18)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B31)，Arg(B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素，
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Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B30) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2-人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8), Gly (A21), Arg (B30)-NH2-人胰岛素，Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Arg(Al)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B30)-NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Arg(Al)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2-人胰岛素，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH2-人胰岛素。在提及的胰岛素类似物命名中说明的术语“人胰岛素”指人胰岛素A链和B链的氨 基酸序列，在给定名称的胰岛素类似物中指明人胰岛素的所有衍生物(添加、取代、删除)。本发明进一步涉及制备如上所述的胰岛素类似物的方法，其中重组制备胰岛素类 似物前体，该前体酶法加工为双链胰岛素，在存在具有胰蛋白酶活性的酶的情况下与精氨 酰胺偶联，分离胰岛素类似物。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物在制备用于治疗糖尿病，特别是I型 或II型糖尿病的药物中的用途。本发明进一步涉及包含如上所述的胰岛素类似物和/或其生理上可接受的盐的 药物。本发明进一步涉及包含如上所述的胰岛素类似物的药物，其用于治疗软骨再生。本发明进一步涉及包含如上所述的胰岛素类似物的药物，其治疗性用于协助β 细胞再生。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是包含溶解的胰 岛素类似物的水性溶液形式。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是粉末形式，特 别是结晶形式和/或非结晶形式。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是悬浮液形式。本发明进一步涉及如上所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂额外包含化学伴 侣分子。本发明进一步涉及编码如上所述的胰岛素类似物前体的DNA。本发明进一步涉及编码如上所述的胰岛素类似物A链的DNA。本发明进一步涉及编码如上所述的胰岛素类似物B链的DNA。本发明进一步涉及包含如上所述的DNA的载体。本发明进一步涉及包含如上所述的DNA或如上所述的载体的宿主生物。本发明进一步涉及前胰岛素原类似物，其中C肽在其N末端带有精氨酸残基，其C 末端特征为 Arg Arg、Arg Lys 或 Lys Arg Arg0
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本发明进一步涉及如上所述的制剂，其额外包含胰高血糖素样肽1 (GLPl)或其类 似物或衍生物，或胰高血糖素样肽的抑制剂_3或4或其类似物或衍生物，优选胰高血糖素 样肽的抑制剂_4。本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂_4的类似物 选自H-desPro36-胰高血糖素样肽的抑制剂Kys6-NH2,H-des (Pro36'37)-胰高血糖素样肽的抑制剂-4-Lys4-NH2或H-des (Pro36'37)-胰高血糖素样肽的抑制剂-4-Lys5-NH2，或其药学上可耐受的盐。本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂_4的类似物 选自desPro36[Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)，desPro36[IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂_4 (1-39)，desPro36 [Met (0)14，Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)，desPro36 [Met (0)14，IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)，desPro36 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _2 (1-39)，desPro36 [Trp (O2)25, IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _2 (1-39)，desPro36 [Met (0) 14Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)或desPro36 [Met (0) 14Trp (O2)25, IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)，或其药学上可耐受的盐。本发明进一步涉及如前面段落中所述制剂，其中肽-Lys6-NH2被连到胰高血糖素 样肽的抑制剂_4类似物的C末端。本发明进一步涉及如上所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂-4类似物选 自H- (Lys) 6-des Pro36 [Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39) -Lys6-NH2des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH2,H-(LyS)6-deS Pro36, Pro37, Pro38[Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4(1-39)-NH2,H-Asn-(Glu) 5des Pro36, Pro37, Pro38[Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39) - (Lys) 6_NH2，H-(LyS)6-deS Pro36, Pro37, Pro38[Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-Asn-(Glu)5-Cles Pro36, Pro37, Pro38[Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36[Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-Lys6-NH2,H-des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38[Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,
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H-Asn-(Glu)5-Cles Pro36, Pro37, Pro38[Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-Asn-(Glu)5-Cles Pro36, Pro37, Pro38[Trp (O2)25，Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36 [Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂 _4(1_39)-Lys6-NH2,des Met (0)14 Asp28Pro36, Pro37, Pro38 胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39) -NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,H-Asn-(Glu)5-Cles Pro36, Pro37, Pro38[Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,des Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂 _4(1_39)-Lys6-NH2, H-Asn- (Glu) 5des Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14，Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(LyS)6-deS Pro36 [Met (0)14, Trp(O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂 _4(1_39)-Lys6-NH2,des Asp28Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp(O2)25]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑 制剂 _4 (1-39)-NH2，H-Asn-(Glu) 5-des Pro36, Pro37, Pro38[Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,des Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp(O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑 制剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-Asn- (Glu) 5_des Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14，Trp (O2)25，Asp28]胰高血糖素样肽 的抑制剂 _4 (1-39) - (Lys) 6_NH2或其药学上可耐受的盐。本发明进一步涉及如上所述的制剂，其额外包含Arg34，Lys26 (Νε( γ谷氨酰基 (Na-十六酰基)))GLP-l(7-37)[利拉糖肽]或其药学上可耐受的盐。关于这一点本领域技术人员清楚，本发明的胰岛素可以是施予后具有有益效应的
12药物制剂产品。就这一点而言，水性溶液是起点。相应地，其他组分必须是易混的。将病毒 性动物污染风险降至最低，因为该制品不应含有任何动物源组分。进一步有利的是加入防 腐剂以阻止微生物污染。可通过加入等张剂消除该制剂对施予位点组织细胞生理的可能的 不良影响。加入鱼精蛋白可具有稳定效应，所以可通过向制剂中加入鱼精蛋白获得基本不 含盐的胰岛素制品。加入酚组分可稳定使用的胰岛素类似物的结构，因此额外带来除其它 之外的对作用开始的延迟作用。也可向制剂中加入稳定本发明的慢效胰岛素空间结构的物 质并使热稳定性更高。这样的化学分子伴侣可例如是短的合成肽，其也可包含氨基酸类似 物或包括例如胰岛素C肽来源的肽序列。可将本发明的胰岛素装入纳米颗粒以开发贮库型胰岛素。也可能是所谓的缓释制 剂，其中本发明的慢效胰岛素可逆地结合到多聚体载体。本发明的胰岛素可与下述药物平行施予速效胰岛素如Apidra 、诺 和锐 (NovoRapid )、优泌乐 (Humalog )或在研的胰岛素衍生物或
具有适当时效特征的制剂或吸入型胰岛素，或在研的经鼻或经口给药的胰岛素。本领域技 术人员清楚，在这一点上也可将进行适当配制的速效胰岛素和本发明的慢效胰岛素的混合 物用于该目的。本发明的胰岛素类似物能进一步用于药物制品中，所述制品包含具有可与 GLP-I (胰高血糖素样肽1)或胰高血糖素样肽的抑制剂-4或胰高血糖素样肽的抑制剂-3 相比的活性的肽。这样的肽的例子是GLP-I (7-37)、依泽那太(exenatide) (Byetta )或 在专利申请WO 2006/058620,WO 2001/04156,WO 2004/005342 和 WO 98/08871 中公开了制 备方法的肽。在这一点上特别有利的制剂是那些包含这些肽的贮库型剂型的制剂。在II 型糖尿病初发期特别有利的治疗类型是那些提供平行施予本发明的药物的类型，其增加了 胰岛素效力，如二甲双胍。如与增加胰腺胰岛素分泌的磺脲类药物的联用一样，也可能采用 与增加肠降血糖素水平的二肽基肽酶_4抑制剂的联合治疗。当通过施予分化因子启动来 源于适当干细胞的β细胞再生时，使用本发明的慢效胰岛素特别有利。通过治疗糖尿病的 例子提及了所有这些应用，本发明同样涉及这些应用。因此，本发明进一步涉及本发明的胰 岛素与其他活性成分联合用于治疗糖尿病，特别是I型或II型糖尿病的用途。本发明也进一步涉及本发明的胰岛素在涉及骨骼例如软骨再生的再生过程中的 用途。该用途中的重点在于控制利用胰岛素的促有丝分裂潜能，同时没有诱发强代谢反应。本发明进一步涉及包含本发明的类似物的药物，其特别表现为水性溶液制剂或粉 末。该药物是优选用于注射目的的溶液或悬浮液的药物制品；其特征在于包含至少一 种本发明的胰岛素类似物，和/或至少一种其生理上可耐受的盐，该胰岛素类似物和/或盐 为溶解、非结晶和/或结晶形式，优选溶解形式。该制品的ρΗ优选介于约2. 5至8. 5，特别是介于4. 0至8. 5，包含合适的张度剂、 合适的防腐剂，及，在适当的情况下，合适的灭菌缓冲水溶液，也优选特定锌离子浓度的灭 菌缓冲水溶液。除了活性成分外的其他全部制品成分构成了制品的载体。合适的张度剂的 例子如甘油、葡萄糖、甘露醇、NaCl、钙化合物或镁化合物如CaCl2等。张度剂和/或防腐剂 的选择可影响本发明胰岛素或其生理上可耐受的盐在弱酸性PH值条件下的溶解度。合适防腐剂的例子是酚、间-甲酚、苯甲醇和/或对-羟基苯甲酸酯。能特别用于调节ρΗ使之介于约4. 0 8. 5的缓冲物质的例子是醋酸钠、柠檬酸
13钠、磷酸钠等。此外，生理上可接受的稀酸(一般为HCl)或稀碱(一般为NaOH)也适于调 节pH。如果制品含有锌，优选1 μ g/ml 2mg/ml，特别是1 μ g/ml 200 μ g锌/ml的浓 度。令人惊奇的是，加入锌可令人满意地影响本发明胰岛素类似物的作用特征。这允许生 产总作用持续时间、作用开始速度和效力曲线特征不同的制品，因此能个体化稳定患者。为了改变本发明制品的活性成分特征，也可混合未修饰的胰岛素，优选牛胰岛素、 猪胰岛素或人胰岛素，特别是人胰岛素，或其胰岛素类似物和衍生物。同样可能混合一种或 更多种胰高血糖素样肽的抑制剂_4衍生物或肽，其特征在于其活性可与GLP-I (胰高血糖 素样肽1)相比。本发明同样涉及这样的药物(制品)。优选的活性成分浓度为约1-1500，更优选约5-1000，特别是约40-400国际单位/ ml的那些。本发明的胰岛素类似物利用生物技术最初制备为尚未包括酰胺的前体。技术人员 熟知大量制备胰岛素的技术。用于此目的的宿主细胞系统是通过发酵用于培养的细菌、酵 母和更高等的植物或植物细胞。假如费用方面的考虑允许，也可使用以动物细胞作为宿主 系统的表达系统。然而，其先决条件是确保不含动物病毒。因此，清楚的是，利用范例描述 的表达系统仅代表了开发用于重组制备蛋白质的宿主/载体系统的一小部分。例如，基于 酵母或植物系统的生物技术未在本申请中描述，所述酵母或植物系统如藓类、藻类或更高 等植物如烟草、豌豆、红花、大麦、玉米或油菜(oilseed rape)。然而，本发明同样包括允许 在合适的生物技术表达系统中制备目标肽的宿主/载体系统和编码DNA序列。因此，宿主 生物可具体选自植物界，选自包含裂殖菌纲、细菌或蓝藻的第一门裂殖植物门的生物，第二 门藻类植物V纲绿藻纲的生物，第二门藻类植物VII纲红藻纲的生物，第三门真菌植物门的 生物，第五门苔藓植物门的生物和第七门种子植物门的生物。欧洲专利申请EP-A 1 222 207公开了编码包括修饰的C肽的前胰岛素原的质粒 pINT358d。现在可借助聚合酶链式反应(PCR)特定地修饰编码胰岛素原的序列，从而能表 达可作为本发明胰岛素前体的前胰岛素原。相应的融合蛋白不必在细胞内制备。技术人员 清楚，也可利用随后分泌至周质和/或培养基上清的细菌表达系统制备这样的蛋白质。欧 洲专利申请EP-A 1 364 029利用实施例公开了这一点。本发明同样涉及可产生本发明的 类似物的胰岛素原前体。原则上，可将如此制备的胰岛素原转变成胰岛素类似物前体，其在位置AO包括赖 氨酸或精氨酸并在B链C末端携带赖氨酸或精氨酸。另外可能的是，如果尚未存在赖氨酸 或精氨酸，可利用半合成的方法将带正电荷的氨基酸加到A链的N末端。假如本发明的胰岛素原在细菌胞内表达后为包涵体或可溶形式，在进行加工和生 化修饰前必须利用体外折叠技术将这些前体折叠为正确构象。在这一点上，公开的融合蛋 白在用尿素或盐酸胍变性后可直接折叠，本发明同样涉及折叠中间体。使用生化方法浓缩单个中间体，尤其是采用了已出版的及事实上为教科书主题的 原理的分离方法。技术人员清楚，这样的原理可以因此组合并产生先前并未以此结果公开 的方法。因此，本发明同样涉及可纯化本发明的类似物的方法。本发明进一步涉及制备本发明的胰岛素类似物的方法，其中利用重组方法制备胰 岛素类似物前体并利用酶法将其转变为双链的胰岛素前体，其在涉及A链氨基酸1的N末
14端携带有精氨酸或赖氨酸，在B链的C末端带有赖氨酸或精氨酸，其在存在具有胰蛋白酶活 性的酶时用精氨酰胺或赖氨酰胺(Iysinamide)转变成酰胺并因此转变成本发明的慢效胰 岛素，然后利用生化纯化方法以高纯度制得本发明的胰岛素类似物。蛋白质“类似物”指通过用其他氨基酸残基取代相应的或相同的天然蛋白质的至 少一个天然氨基酸残基和/或添加和/或删除相应的或相同的天然蛋白质的至少一个氨基 酸残基而不同的蛋白质。就这一点而言，也可添加非天然氨基酸残基和/或用非天然氨基 酸残基取代氨基酸残基。蛋白质“衍生物”指利用化学修饰起始蛋白质的某些氨基酸残基而获得的蛋白质。 化学修饰可例如由向一个或更多个氨基酸添加一个或更多个特定化学基团组成。
图1 本发明的胰岛素类似物在大鼠中的降血糖效力图2 甘精胰岛素在大鼠中的降血糖效力下述实施例意图说明本发明的概念而非限制本发明。实施例1 制备编码Gly (A21)-胰岛素和在C/A链交界带有Arg Arg的修饰C肽 的衍生载体PINT3580欧洲专利申请EP-A 1 222 207公开了质粒pINT358d、pINT91d和引物序列Tir。 使用这些产品的DNA构建质粒pINT3580。质粒pINT358d的特征还包括编码具有特定性质 的修饰C肽的基因序列。合成了三条引物序列pint3580_glya21rev5' -CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTTCTCCAGCTGG-3' (SEQ ID NO 3)该引物用于在pINT358d编码的胰岛素原序列A链的位置21引入甘氨酸(粗体、 加下划线)而不是天冬酰胺。arg_c juncf5' -GTCCCTGCAGCGTCGCGGCATCGTGGAGCAG-3' (SEQ I D NO 4)该引物与引物arg_CjimC_reV的作用一样，用于在胰岛素A/B链交界处引入精氨 酸而不是赖氨酸。arg_c junc_rev5' -CCACGATGCC GCGACGCTGC AGGGACCCCT CCAGCG-3' (SEQ ID NO 5)在两条引物中，待引入的精氨酸密码子均以粗体表示。按照欧洲专利申请EP-A 1 222 207 的方法，分别用弓 I物对 Tir/arg_cjunc_rev 禾口 arg_cjuncf/pint3580_glya21rev 禾口 质粒pINT358d的DNA作为模板进行PCR。组合两个反应产物的等份样品并在第三个PCR中 与引物对Tir/pint3580_glya21rev共同使用。按照厂商说明书在一个或相同反应中，在用 凝胶电泳分离该反应混合物后纯化该反应产物，用限制酶Sall/Ncol消化该反应产物，利 用凝胶电泳分离该反应混合物，分离编码胰岛素原序列的DNA片段。然后，利用DNA连接酶 反应将该片段插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。用连接混合物转化大肠杆菌感受态细胞。将转化混合物涂布在含25mg/l氨苄青 霉素的选择平板上。从长出的克隆中分离质粒DNA并用DNA序列分析进行鉴定。正确的质 粒称为PINT3580。
实施例2:构建编码见8仏8)，617仏21)-前胰岛素原的质粒？1附3581如实施例1中所述，用3个聚合酶链式反应完成该构建。将第三个反应的产物 用Ncol/Sall酶切后插入用Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA中。使用了引物Tir和 pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物pint3580_Ha8f5，-AGCAGTGCTGCCACAGCATCTGCTCCCTCTAC-3，(SEQ ID NO 6)pint3580_Ha8rev5，-GAG CAGATGCT GTG GCAGCACTG CTCCACGATG-3，(SEQ ID NO 7)通过加粗每个字母强调了编码A链位置8组氨酸的密码子。按实施例1中所述的 方法完成该构建。PCRl和2的模板为质粒pINT3580的DNA。分别用引物对Tir/pint3580_ Ha8rev 和 pint3580_Ha8f/pint3580_glya21rev 进行 PCRl 和 PCR2。PCR3 使用了 引物对 Tir/pint3580_glya21rev。该反应的模板为PCRl和PCR2反应产物的混合物。正确的质粒 称为 pINT3581。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202的前体，该前体的特征为Arg(AO)， His(AS)，Gly (A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH2-人胰岛素，且其用精氨酰胺进行了酰胺化。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202b的前体，该前体的特征为Arg(AO)， His(AS)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺进行了酰胺化。实施例3 构建编码His(A8)，Glu (A5)，Gly (A21)-前胰岛素原的质粒pINT3582按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成该构建过程。第三个反应 的产物用Ncol/Sall酶切后插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和 pint3580-glya21rev。另外合成了两条引物。pint3581_Ea5f5' GCATCGTGGAGGAGTGCTGCCACAGCATCTG 3‘ (SEQ ID NO 8)pint3581_Ea5rev5，-CTGT GGCAGCACTC CTCCACGATG CCGCGACG-3，(SEQ ID NO 9)通过加粗每个字母强调了编码A链位置5谷氨酸的密码子。按实施例1所述方法 完成该构建过程。模板为质粒PINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3582。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-1的前体，该前体的特征为Arg(AO)， Glu(A5)，His(AS)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) NH2-人胰岛素，且其用精氨酰胺进行了酰 胺化。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_lb的前体，该前体的特征为Arg(AO)， Glu(A5)，His(AS)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32)-NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺进行了
酰胺化。实施例4 构建编码His (A8)，Asp (Al8)，Gly (A21)-前胰岛素原的质粒pINT3583该构建过程与实施例1不同，仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用 Ncol/Sall酶切后插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir。另外合成了 一条引物pint3580_Dal8rev5' CAAAGGTCGACTATTAGCCGCAGTAGTCCTCCAGCTGGTAGAGGGAG 3‘ (SEQIDN0:10)
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加粗强调了编码A链位置18天冬氨酸的密码子。模板是质粒PINT3581的DNA。 正确的质粒称为PINT3583。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202的前体，其特征为Arg(AO)，Asp(AlS)， His(AS)，Gly (A21)，Arg(B31)，Arg(B32)NH2-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_2b的前体，其特征为Arg (AO)， Asp (A18)，His (A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。实施例5 构建编码His(A8)，Glu (A15)，Gly (A21)-前胰岛素原的质粒pINT3585该构建过程与实施例1不同，仅利用一个聚合酶链式反应完成。该反应的产物用 Ncol/Sall酶切后插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir。另外合成了 一条引物pint3580_Eal5rev5 ‘ -CAAAGGTCGA CTATTAGCCG C A G T A G T T C T C C A G C T C G T A GAGGGAGCAGATGCTG-3‘ (SEQ ID NO: 11)加粗强调了编码A链位置15谷氨酸的密码子。模板是质粒PINT3581的DNA。正 确的质粒称为PINT3585。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-3的前体，其特征为Arg (AO)， Glu (A15)，His(AS)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) NH2-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_3b的前体，其特征为Arg (AO)， Glu (A15)，His (A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。实施例6 构建编码His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)-前胰岛素原的质粒pINT3588按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成了该构建过程。第三个反应 的产物用Ncol/Sall酶切后插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和 pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物pint3581_Db3f5' -GCACGATTTGTGGACCAGCACCTGTGCGGC-3' (SEQ ID NO 12)pint3581_Db3rev5' -CACAGG TGCTGGTCCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3‘ (SEQ ID NO 13)通过加粗每一个字母强调了编码胰岛素B链位置3天冬酰胺的密码子。按实施例 1所述方法完成了该构建过程。模板是质粒PINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3588。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-4的前体，其特征为Arg (AO)， His(AS)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B31)，Arg (B32) NH2-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_4b的前体，其特征为Arg (AO)， His (A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B31)，Lys (B32)NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。实施例7 构建编码His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)前胰岛素原的质粒pINT3593按实施例1和2所述方法用3个聚合酶链式反应完成了该构建过程。第三个反应 的产物用Ncol/Sall酶切后插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。使用了引物Tir和 pint3580_glya21rev。另外合成了两条引物pint3581_Eb4f5' -ACGATTTGTGAACGAGCACCTGTGCGGCTC-3' (SEQ ID NO 14)
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pint3581_Eb4rev5' -CGCACAGG TGCTCGTTCA CAAATCGTGC CGAATTTC-3‘ (SEQ ID NO 15)加粗强调了编码胰岛素B链位置4谷氨酰胺的密码子。按实施例1所述方法完成 了该构建过程。模板是质粒PINT3581的DNA。正确的质粒称为pINT3593。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-5的前体，其特征为Arg (AO)， His(AS)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg (B31)，Arg (B32) NH2-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_5b的前体，其特征为Arg (AO)， His(AS)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg (B31)，Lys (B32) NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。实施例8 构建编码His(A8)，Gly (A21)，Glu (BO)-前胰岛素原的质粒pINT3597利用2个聚合酶链式反应完成了该构建过程。使用了引物pint3580_glya21reV。 另外合成了两条引物pint3581_Eb0fl5' -CAACAGGAA ATTCGGCACG AGAGTTTGTG AACCAGCACC TGTG-3，(SEQID NO 16)pint3581_Eb01f25' TATCGACCAT GG CAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCACG AGAG-3，(SEQ ID NO 17)该实施例中的两条引物有部分重叠。Pint3581_Eb0f2含有NcoI识别序列。用下 划线标出了该序列。通过加粗每一个字母强调了编码B链开始部分位置0谷氨酸的密码子。 PCRl模板是质粒pINT3581的DNA。用引物对pint3581_Eb-lf2/pint3580_glya21rev 进行 PCR1。PCR2 的模板是 PCRl 的产物。用引物对 pint3581_Eb-lf2/pint3580_glya21rev 进行 PCR2。PCR2 的产物包含 完整的前胰岛素原序列。第二个反应的产物用Ncol/Sall酶切后插入Ncol/Sall切开的 pINT91d载体DNA。正确的质粒称为pINT3597。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202-6的前体，其特征为Arg (AO)， His(AS)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg (B31)，Arg (B32) NH2-人胰岛素，且其用精氨酰胺酰胺化。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_6b的前体，其特征为Arg (AO)， His(AS)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg (B31)，Lys (B32) NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。用天冬氨酸密码子替换位置BO的谷氨酸密码子并按照本实施例的方法产生了在 位置BO具有天冬氨酸而不是谷氨酸的质粒。实施例9 构建编码His(A8)，Gly (A21)，Lys (BO)-前胰岛素原的质粒pINT3700该构建过程是为了在B链前序列和开始部分间的边界引入赖氨酸密码子而不 是精氨酸密码子。利用两个聚合酶链式反应完成了该构建过程。使用了引物Pint3580_ glya21rev0另外合成了两条引物pint3581_Eb0fl5' -CAACAGGAA ATTCGGCA AAGTTTGTG AACCAGCACC TGTG-3' (SEQ IDNO 18)pint3581_Eb01f25' TATCGA CCAT GGCAACAACA TCAACAGGAA ATTCGGCAGAG-3' (SEQ IDNO : 19)该实施例中的两条引物部分重叠，且pint3581_Eb0f2含有NcoI识别序列。用下划 线标出了该序列。通过加粗每一个字母强调了编码B链开始部分位置0的谷氨酸密码子。 PCRl 的模板是质粒 PINT3581 的 DNA。用引物对 pint3581_Eb_lf2/pint3580_glya21rev 进
18行 PCR1。PCR2 的模板是 PCRl 的产物。用引物对 pint3581_Eb_lf2/pint3580_glya21rev 进行PCR2。PCR2的产物包含完整前胰岛素原序列。第二个反应的产物用Ncol/Sall酶切 后插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。正确的质粒称为pINT3700。该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg (AO)，His (A8)，Gly (A21)，Arg (B30) NH2-人 胰岛素的前体。获得该化合物首先通过利用与胰蛋白酶和赖氨酰内肽酶C的反应制备中 间产物Thr(B30)_人胰岛素的Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，随后通过用精氨酰胺酰胺化 所述中间产物将其转变为目标化合物YKL202-7，其特征为Arg(AO)，His (A8)，Gly (A21)， Arg (B30)-NH2-人胰岛素。该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_7b的前体，其特征为Arg (AO)， His(AS)，Gly (A21)，Lys (B30) NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。实施例10 构建编码Gly (A21) Lys (BO)-前胰岛素原的质粒pINT3701该构建过程用于在B链的前序列和开始部分间的边界引入赖氨酸密码子而不是 精氨酸密码子。按照实施例9的构建策略，但使用质粒pINT358d的DNA作为PCRl的模板 制备了质粒PINT3701，同原始质粒pINT358d —样，该质粒的特征为C肽和A链间的边界由 氨基酸序列Lys-Arg构成。实施例11 构建编码含有实施例10所述C肽的His (A8)，Gly (A21)，Lys (BO)-前 胰岛素原的质粒PINT3702按照实施例2公开的构建策略但使用质粒PINT3701的DNA作为模板制备质粒 PINT3702。该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg (AO)，His (A8)，Gly (A21)，Arg (B30) NH2-人胰岛素的前体。获得该化合物首先通过仅与赖氨酰内肽酶C的反应制备中间产 物Thr (B30)-人胰岛素的Arg(AO)，His (A8)，Gly (A21)，随后通过用精氨酰胺酰胺化所 述中间产物将其转变为目标化合物YKL202-8，其特征为Arg(AO)，His(AS)，Gly(A21), Arg (B30)-NH2-人胰岛素。 该质粒编码的前胰岛素原是化合物YKL202_8b的前体，其特征为Arg (AO)， His(AS)，Gly (A21)，Lys (B30) NH2-人胰岛素，且其用赖氨酰胺酰胺化。实施例12 制备编码His (A8)，Gly (A21)，Lys (BO)-前胰岛素原和在C/A链边界带 有三肽Lys-Arg-Arg的修饰C肽的衍生载体pINT3703将质粒pINT3702的DNA用作模板并使用引物pint3580_glya21rev和Tir。合成 了两条引物。3702_arg_cjuncf5' -TGC AGAAGCGCAGAGGCATCGTG GAGCAGTGC-3，(SEQ ID NO 20)与引物arg_cjUnc_rev —样，该引物用于在胰岛素A/B链边界引入精氨酸。3702_cjunc_rev5' -TCC ACGATGCCTCTGCGCTTCTG CAGGGACCC-3，(SEQ I D NO 21)两个引物中待引入的精氨酸密码子均是黑体。按照欧洲专利申请EP Al 222 207中所述的方法进行了 PCR，引物对分别为Tir/3702_cjunc_rev和3702_arg_cjuncf/ pint3580_glya21rev，模板为质粒pINT3702的DNA。组合两个反应产物的等份样品并在第 三个PCR中与引物对Tir/pint3580_glya21rev共同使用。按照厂商说明书在一个或同一个反应中用凝胶电泳分离该反应混合物后纯化该反应产物，用限制酶Sall/Ncol消化该反 应产物，利用凝胶电泳分离该反应混合物，分离编码胰岛素原序列的DNA片段。然后，利用 DNA连接酶反应将该片段插入Ncol/Sall切开的pINT91d载体DNA。用连接混合物转化大肠杆菌感受态细胞。将转化混合物涂布在含25mg/l氨苄青 霉素的选择平板上。从长出的克隆中分离质粒DNA并用DNA序列分析进行鉴定。正确的质 粒称为pINT3702。该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A-I)，Arg(AO)，His (A8)，Gly (A21)， Arg(B30)NH2-人胰岛素的前体。通过利用与赖氨酰内肽酶C的反应开始制备中间产物 Thr(B30)_人胰岛素的Arg(A-I)，Arg(AO)，His(AS)，Gly (A21)，随后通过用精氨酰胺酰胺 化所述中间产物将其转变为目标化合物而获得该化合物。该质粒编码的前胰岛素原是化合物Arg(A-I)，Arg(AO)，His (A8)，Gly (A21)， Lys (B30) NH2-人胰岛素的前体，且其用赖氨酰胺酰胺化。技术人员清楚，按照实施例3-8的方法可将天冬氨酸或谷氨酸引入A链或B链的 恰当位置。这些胰岛素原是下述化合物的前体
权利要求
通式I的胰岛素类似物其中A 1对应于Lys、Arg或氨基；A 0对应于Lys、Arg或化学键；A1对应于Arg或Gly；A5对应于Asp、Glu或Gln；A15对应于Asp、Glu或Gln；A18对应于Asp、Glu或Asn；A21对应于Ala、Ser、Thr或Gly；B 1对应于Asp、Glu或氨基；B0对应于Asp、Glu或化学键；B1对应于Asp、Glu、Phe或化学键；B3对应于Asp、Glu或Asn；B4对应于Asp、Glu或Gln；B29对应于Arg、Lys或选自包含Phe、Ala、Thr、Ser、Val、Leu、Glu或Asp的组的氨基酸，或化学键；B30对应于Thr或化学键；B31对应于Arg、Lys或化学键；B32对应于Arg 酰胺或Lys 酰胺。其中，包含A5、A15、A18、B 1、B0、B1、B2、B3和B4的组中不超过一种的氨基酸残基同时且彼此独立地对应于Asp或Glu。FSB00000351005500011.tif
2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中A-I对应于Arg。
3.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中AO对应于Arg。
4.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中A5对应于Glu。
5.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中A15对应于Glu。
6.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中A18对应于Asp。
7.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中A8对应于His。
8.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中A21对应于Gly。
9.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中BO对应于Glu。
10.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中B3对应于Asp。
11.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中B4对应于Glu。
12.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中B30对应于Arg。
13.根据一项或更多项前述权利要求所述的胰岛素类似物，其中B30对应于Lys。
14.根据权利要求1到13的一项或更多项所述的胰岛素类似物，其选自 Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，Asp (Al8)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B30)-NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，Asp (Al8)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B30)-NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg(B30) -NH2 人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Lys (B30) -NH2 人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B31)，Arg(B32)-NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，Glu (A5)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，Asp (Al8)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，Asp (Al8)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，Glu (A15)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B31)，Arg (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Asp (B3)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg(B31)，Arg(B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu (B4)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg(B31)，Arg(B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Glu(BO)，Arg (B31)，Lys (B32) -NH2-人胰岛素， Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Arg (B30)-NH2-人胰岛素，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2-人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B30)-NH2-人胰岛素， Arg(A-I)，Arg(AO)，His(A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2-人胰岛素，Arg(AO)，Arg(Al)，His(A8)，Gly (A21)，Arg(B30)-NH2-人胰岛素， Arg (AO)，Arg (Al)，His (A8)，Gly (A21)，Lys (B30) -NH2-人胰岛素， His(A8)，Gly (A21)，Arg (B31)，Arg (B32)-NH2-人胰岛素。
15.制备根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物的方法。
16.根据权利要求15所述的方法，其中重组制备胰岛素类似物前体，该前体酶法加工 为双链胰岛素，在存在具有胰蛋白酶活性的酶的情况下与精氨酰胺偶联，分离该胰岛素类 似物。
17.根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，用于制备治疗I型或II型糖尿病、软骨再生或协助 β细胞再生的药物。
19.包含根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物和/或其生理上可接受的盐 的药物。
20.根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是包含溶解 的胰岛素类似物的水性溶液形式。
21.根据权利要求1至14任一项所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是粉末形式。
22.根据权利要求21所述的制剂，其中根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似 物是结晶和/或非结晶形式。
23.根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂是悬浮液形式。
24.根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物的制剂，其中该制剂还包含化学 分子伴侣。
25.编码根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物的前体的DNA。
26.编码根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物的A链的DNA。
27.编码根据权利要求1至14任意项所述的胰岛素类似物的B链的DNA。
28.包含根据权利要求25至27—项或更多项所述的DNA的载体。
29.包含根据权利要求25至27—项或更多项所述DNA或根据权利要求28所述载体的 宿主生物。
30.一种前胰岛素原类似物，其中C肽在其N末端带有精氨酸残基且其C末端的特征为 Arg Argλ Arg Lys 或 Lys Arg Arg0
31.根据权利要求20至24—项或更多项所述的制剂，其额外包含胰高血糖素样肽 1 (GLPl)或其类似物或衍生物，或胰高血糖素样肽的抑制剂_3或-4或其类似物或衍生物。
32.根据权利要求31所述的制剂，其额外包含胰高血糖素样肽的抑制剂_4。
33.根据权利要求31所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂-4的类似物选自 H-desPro36-胰高血糖素样肽的抑制剂-4-Lys6-NH2，H-des (Pro36'37)-胰高血糖素样肽的抑制剂Kys4-NH2和 H-des (Pro36'37)-胰高血糖素样肽的抑制剂-4-Lys5-NH2， 或其药理学上可耐受的盐。
34.根据权利要求31所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂-4的类似物选自desPro36[Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)， desPro36[IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)， desPro36[Met(0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)， desPro36[Met(0)14, IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)， desPro36 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-2(1-39)， desPro36 [Trp (O2)25, IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-2(1-39)， desPro36[Met (O)14Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)和 desPro36[Met (O)14Trp (O2)25, IsoAsp28]胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)， 或其药理学上可耐受的盐。
35.根据权利要求31所述的制剂，其中肽-Lys6-NH2被连到胰高血糖素样肽的抑制 剂_4类似物的C末端。
36.根据权利要求31所述的制剂，其中胰高血糖素样肽的抑制剂-4类似物选自 H-(Lys)6-Cles Pro36 [Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-Lys6-NH2des Asp28pro36, Pro37, Pro38 胰高血糖素样肽的抑制剂-4(1-39)-NH2, H-(Lys)6- des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-NH2, H-Asn-(Glu) 5des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-NH2, des Pro36, Pro37, Pro38[Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39) - (Lys) 6_NH2， H-(Lys)6-Cles Pro36，Pro37，Pro38 [Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-Asn-(Glu) 5-des Pro36, Pro37, Pro38 [Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36 [Trp(O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-Lys6-NH2, H-des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-NH2, H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,H-Asn-(Glu) 5-des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-Asn-(Glu) 5-des Pro36, Pro37, Pro38 [Trp (O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36 [Met (O)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-Lys6-NH2, des Met(O)14 Asp28 Pro36，Pro37，Pro38 胰高血糖素样肽的抑制剂 _4 (1-39)-NH2, H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,H-Asn-(Glu)5-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,des Pro36，Pro37，Pro38 [Met (O)14，Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-Lys6-NH2,H-Asn-(Glu) 5des Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36[Met (O)14, Trp(O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-Lys6-NH2,des Asp28 Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp(O2)25]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp(O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2, H-Asn-(Glu)5-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met(O)14, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-NH2,des Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp(O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-(Lys)6-Cles Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14, Trp(O2)25, Asp28]胰高血糖素样肽的抑制 剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2,H-Asn- (Glu) 5-des Pro36, Pro37, Pro38 [Met (0)14，Trp (O2)25，Asp28]胰高血糖素样肽的抑 制剂-4 (1-39)-(Lys)6-NH2, 或其药理学上可耐受的盐。
37.根据权利要求31所述的制剂，其额外包含Arg34，Lys26(NE (γ-谷氨酰基(Na-十六 酰基)))GLP-I (7-37)[利拉糖肽]。
全文摘要
本发明涉及具有基础时效特征的新型胰岛素类似物，其特征在于添加和/或取代带负电荷和带正电荷的氨基酸残基，酰胺化B链的C末端羧基和胰岛素A链的位置8为组氨酸。本发明还涉及其生产和用途。
文档编号C07K14/62GK101970476SQ200980101942
公开日2011年2月9日 申请日期2009年1月6日 优先权日2008年1月9日
发明者G·米勒, G·赛普克, G·钱克, M·佐默费尔德, N·特纳格尔斯, P·哈伯曼, R·库尔勒, U·沃纳 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司