专利名称：新型噬菌体及包含该新型噬菌体的抗菌组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型噬菌体，更具体而言，涉及对选自下列的一种或更多种沙门氏菌 具有特异性杀菌活性的噬菌体肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis)、鼠伤寒沙门氏 菌(Salmonella Typhimurium)、鸡沙门氏菌禾口 (Salmonella Gallinarum)鸡白病沙门氏菌 (SalmonellaPullorum)。进一步，本发明涉及预防或治疗感染性疾病的组合物，所述感染性 疾病包括由肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的沙门氏菌病和沙门氏菌食物中毒、由鸡 沙门氏菌引起的鸡伤寒和由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢，所述组合物包含所述噬菌体作 为活性成分。而且，本发明涉及饲料添加剂、饮用水、清洁剂和卫生消毒剂，其包含所述噬菌 体作为活性成分。
背景技术：
沙门氏菌是肠杆菌科的一个属，其特征为革兰氏阴性、兼性厌氧、非产芽孢、杆状 细菌，并且大部分菌株通过鞭毛活动。沙门氏菌(Salmonella)具有50-52 %的平均基因 组GC含量，类似于大肠杆菌(Escherichia coli)和志贺氏菌属(Shigella)。沙门氏菌 属是引起家畜以及人感染的病原微生物。肠道沙门氏菌——沙门氏菌的一个种——具有 多种血清型，包括鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门 氏菌(Salmonella Typhi)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)和德比沙门氏 菌(Salmonella derby) (Bopp CA, Brenner Fff, Wells JG, Strokebine ΝΑ. Escherichia, Shigella, Salmonella.In Murry PR, Baron EJ, et al eds Manual of Clinical Microbiology. 7th ed. Washington DC American Society for Microbiology 1999 ； 467-74；RyanKJ. Ray CG(editors)(2004). Sherris Medical Microbiology(4th ed). McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.)。其中，鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌是家禽适合的 病原体，伤寒沙门氏菌是人适合的病原体，猪霍乱沙门氏菌和德比沙门氏菌是猪适合的病 原体，以及肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌是人和动物的病原体。每种血清型在分别的物 种中引起疾病，给农民或消费者带来极大的损害。沙门氏菌引起的家禽疾病是禽伤寒(FT)，其由病原体鸡沙门氏菌(下文中称为 SG)引起。禽伤寒(FT)是家禽如鸡和火鸡的败血性疾病，该过程可以是急性或慢性的并 且具有高死亡率。最近，据报道，在欧洲、南美洲、非洲和东南亚频繁出现禽伤寒，并且损害 在逐渐增加。自从1992年已有报道在韩国FT的爆发并且在棕色产蛋鸡中FT造成的经济 损失非常严重(Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on aviandiseases. Information publication by National Veterinary Research &Quarantine Service. March,2001 ；Kim Ae-Ran et al. ， The prevalence ofpullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock inKorea，2003，Korean J Vet Res(2006)46(4) :347 353)。沙门氏菌之一一鸡白痢沙门氏菌(下文中称为SP)—一也引起鸡白痢。鸡白 痢发生在任意年龄或季节，但小鸡特别易患该病。在上个世纪中，其已经在1-2周龄或更 小的小鸡中成为严重的疾病。从20世纪80年代起，该病的发生已大大地减少。然而，从20世纪90年代中期起，该病已经开始增加(Kwon Yong-Kook. 2000 annual report on aviandiseases. Information publication by National Veterinary Research &Quarantine Service. March,2001 ；Kim Ae-Ran et al. , The prevalence ofpullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock inKorea,2003,Korean J Vet Res (2006) 46 (4) :347 ；353)。在韩国，从20世纪90年代起，禽伤寒和鸡白痢的爆发已经增加，给农民造成经济 损失。因此，从2004年开始，SG减毒活疫苗已经用于肉鸡(broilers)中，以预防禽伤寒(Kim Ae-Ran et al. ， The prevalence ofpullorum disease-fowl typhoid in grandparent stock and parent stock inKorea，2003，Korean J Vet Res (2006) 46 (4) :347 353)。其 效力受到怀疑，并且活疫苗不可以用于产蛋鸡，是因为存在鸡蛋传播的感染风险。不幸的 是，仍旧没有针对鸡白痢的商业可应用预防性策略，而不像禽伤寒那样。因此，对于预防禽 伤寒和鸡白痢的新方法存在迫切需求。同时，肠炎沙门氏菌(下文中称为SE)和鼠伤寒沙门氏菌(下文中称为ST)是人 畜共患病病原体，其不显示宿主特异性，而不像SG或SP那样(Zoobises Report ；United Kingdom 2003)。SE和ST引起家禽、猪和牛的沙门氏菌病。沙门氏菌引起的沙门氏菌病是家畜 消化道的急性或慢性感染，并且显示的主要症状为发热、肠炎和败血症，偶尔出现肺炎、关 节炎、流产和乳腺炎。沙门氏菌病全世界均发生，并且最经常在夏天发生(T.R. Callaway et al. Gastrointestinal microbial ecology and the safety of the food supply asrelated to Salmonella. J Anim Sci 2008. 86 :E163_E172)。在牛中，典型的症状包括食 欲丧失、发烧、咖啡色痢疾或带血黏液便。小牛的急性感染导致快速死亡，而妊娠期间的感 染由于败血症而导致死胎，引起早期流产(www, livestock, co. kr)。在猪中，沙门氏菌病的 临床特征为三个主要症状——急性败血症、急性肠炎和慢性肠炎。急性败血症发生在2 4月龄的小猪中，并且在症状发作后2 4天内经常出现死亡。急性肠炎发生在育肥期，并 且伴随有痢疾、高烧、肺炎和神经系统体征。在一些严重的病例中可能出现皮肤变色。慢性 肠炎伴随有持续的痢疾(www, livestock, co. kr)。一旦SE和ST引起的沙门氏菌病的爆发出现在家禽、猪和牛中，通过治疗剂治愈是 困难的。原因是沙门氏菌在临床症状出现后显示对各种药物强的抗性并且生存在无法渗透 抗生素的细胞中。到目前为止，没有有效治疗SE和ST引起的沙门氏菌病的方法，包括抗生 素(www, lhca. or. kr) 0如在家畜中一样，SE和ST经由家畜产品引起人感染，导致沙门氏菌食物中 毒。感染的、不恰当烹煮的家畜产品(例如，肉类品、家禽产品、鸡蛋和副产品)的食用 感染人。人沙门氏菌食物中毒通常包括头痛的急促发作、发烧、腹痛、痢疾、恶心和呕 吐。症状一般出现在摄取该生物体后6-72小时内，并且可以持续4-7天之久或甚至更长 (NSW+HEALTH. 2008. 01. 14.)。牛艮据 CDC(The Centers for Disease Control and Prevention, USA) 艮道，在 2005年和2008年之间人食物中毒爆发中的16 %是由于沙门氏菌所致，而其中20 %和18 % 分别由SE和ST引起。对于1973年和1984年之间人沙门氏菌食物中毒，牵涉的食物传播 媒介据报道有鸡肉(5% )、牛肉(19% )、猪肉(7% )、乳制品(6% )和火鸡肉(9% )。在1974 1984年中，在屠宰过程中对肉鸡的细菌污染测试显示出35%或更高的沙门氏菌发 病率。在1983年，在50. 6%的鸡肉、68. 8%的火鸡肉、60%的鹅肉、11. 6%的猪肉和1. 5%的 牛肉中分离出沙门氏菌。进一步，在2007年进行的调查报道了，5. 5%的生家禽肉和1. 1% 的生猪肉中发现了沙门氏菌。特别是，披露了 SE普遍源自污染的蛋或家禽肉，ST源自污 染的猪肉、家禽肉和牛肉(www, cdc. rov)。例如，自1988年，SE引起的食物中毒在美国、 加拿大和欧洲快速增加，流行病学研究证实，这归因于蛋或含蛋食物(Agre-Food Safety Information Service (AGROS). Domestic andforeign food poisoning occurrence and management trend. 2008. 02)。在2002年由FAO和WHO进行的风险评估注意到，通过蛋和 家禽肉传播的沙门氏菌病的发病率似乎与所观察的家禽沙门氏菌流行具有线性关系。这意 味着，当减少家禽沙门氏菌流行时，人沙门氏菌病的发病率将会下降(Salmonella control at the source ；World Health Organization. International Food Safety Authorities Network(INFOSAN) InformationNote No. 03/2007)。最近，有关食物安全性的恐慌已经被 来自下列各种食物的沙门氏菌的爆发所激发花生、菠菜、番茄、开心果、胡椒，以及最近地， 曲奇饼(Jane Black and Ed Keefe. Overhaul of Food SafetyRules in the Works. Washington Post Staff Writers Wednesday, July 8，2009)。由于这些原因，沙门氏菌感染必定在德国有报道(§6md§7of theGerman law on infections prevention, Infektionsschutzgesetz)。在 1990 年禾口 2005 年之间，官方记载 的病例数从大约200，000例减少到大约50，000例。据估计，在德国每五个人中就有一个是 沙门氏菌携带者。在美国，每年报道的沙门氏菌感染有大约40，000例(en. wikipedia. org/ wiki/Salmonella#cite_note_2)。因此，对控制引起家畜和人沙门氏菌病的SE和ST存在迫切需求。USDA和FDA的 合作努力已经开发了许多有效预防沙门氏菌病的策略，所述沙门氏菌病在美国引起1百万 多例食源性疾病。其中是FDA颁发的最终规则降低了蛋中的污染。FDA现在要求，蛋生产 商在蛋生产、储存和运输期间定期测试致命性沙门氏菌。结果，每年估计避免了由于污染 的蛋所致的 79，000 例疾病和 30 例死亡(Jane Black and EdO，Keefe. Overhaul of Food Safety Rules in the Works. Washington PostStaffffriters Wednesday, July 8，2009)。 在丹麦，来自比较在生产部门中沙门氏菌控制成本与总沙门氏菌病公共卫生成本的成本 效益分析的保守估计指出，在2001年沙门氏菌控制措挽回了丹麦经济1. 41千万美元。 (Salmonella control at the source. World Health Organization. InternationalFood Safety Authorities Network(INFOSAN) Information Note No. 03/2007)。同时，噬菌体是一种专门只感染和破坏细菌的病毒类型，并且可以只在宿主细菌 中自我复制。噬菌体由呈单链或双链DNA或RNA形式的遗传物质组成，所述单链或双链DNA 或RNA被蛋白质壳包裹。噬菌体分类是基于它们的形态学结构和遗传物质。根据形态学 结构存在噬菌体的三种基本结构形式有尾部的二十面体(二十面)头部，无尾部的二十 面体头部和丝状形式。基于它们的尾部结构，具有二十面体头部和作为它们的遗传物质的 双链、线性DNA的噬菌体被分三个科肌病毒科、长尾病毒科和短尾病毒科，他们的特征分 别是可收缩尾、长的不可收缩尾和短的不可收缩尾。具有无尾部的二十面体头部和作为它 们遗传物质的RNA或DNA的噬菌体基于它们的头部形状和组分以及壳的存在来进行分类。 具有作为它们遗传物质的DNA的丝状噬菌体基于它们的大小、形状、壳和丝组分进行分类(H. W. Ackermann. Frequency of morphological phage descriptions in the year 2000 ； ArchVirol(2001) 146 :843-857 ；Elizabeth Kutter et al. bacteriophages biologyand application ；CRC press)0在感染期间，噬菌体吸附到细菌并且将其遗传物质插入到细胞中。其后，噬菌体进 行两种生命周期——溶解性周期或溶原性周期——之一。溶解性噬菌体利用细胞器产生噬 菌体组分。然后，它们破坏或溶解该细胞，释放新的噬菌体颗粒。溶原性噬菌体将它们的核 酸掺入宿主细胞的染色体中并且用其作为单元进行复制而不破坏该细胞。在某些条件下， 溶原性噬菌体可以被诱导来进行溶解性周期(ElizabethKutter et al. Bacteriophages biology and application. CRC press)。在噬菌体发现后，大量的努力开始集中于它们在传染性疾病治疗中的用途。然 而，当广谱抗生素进入日常应用时，认为不需要噬菌体，原因在于具有特异性靶谱。但是， 抗生素的错误使用和过度使用导致更多关于抗生素抗性和食物中残留抗生素的有害影响 的担忧(Cislo，Met al. Bacteriophage treatment of suppurative skin infections. ArchImmunol. Ther. Exp. 1987. 2 175-183 ；Kim sung-hun et al.，Bacteriophage ；New Alternative Antibiotics. Biological research information center (BRIC))。具体而 言，已知添加到动物饲料以提高生长的抗微生物生长促进剂(AGP)诱导抗生素抗性，因此， 最近已经禁止使用抗微生物生长促进剂(AGP)，在欧盟，从2006年禁止使用抗微生物生长 促进剂(AGP)。从2009年，韩国已经禁止使用一些AGP，并且正在考虑于2013 2015年全 面限制使用AGP。这些对抗生素使用的越来越多的关注已经导致兴起对噬菌体作为抗生素替代品 的兴趣。美国专利6，485，902中公开了 7种用于控制大肠杆菌0157:H的噬菌体(2002 年授权，Use of bacteriophages for control ofEscherichia coli 0157)。美国专利 6，942，858中公开了 2种用于控制多种微生物的噬菌体(Nymox在2005年授权)。许多公 司已经积极地设法开发使用噬菌体的多种产品。EBI食物系统(欧洲)开发了一种食物添 加剂，用于预防单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，名称为Listex-PlOO) 引起的食物中毒，其是获得US FDA批准的第一个噬菌体产品。基于噬菌体的产品LMP-102 也被开发，作为针对单核细胞增生李斯特菌的食物添加剂，被批准为GRAS (公认安全)。在 2007年，OmniLytics生产的基于噬菌体的洗涤剂被开发来预防在屠宰期间牛肉的大肠杆 菌0157污染，其获得USDA的食品安全监督服务局(FoodSafety and Inspection Service, FSIS)批准。在欧洲，生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)噬菌体NCIMB 30008和酪丁酸梭 菌(Clostridiumtyrobutiricum)噬菌体 NCIMB 30008 分别于 2003 年和 2005 年被注册为 针对饲料梭菌污染的饲料防腐剂。这些研究显示，对噬菌体用作针对家畜产品中人畜共患 病病原体的抗生素的研究目前正在进行。然而，大部分噬菌体生物控制研究聚焦于控制大肠杆菌、李斯特菌和梭菌。沙门 氏菌也是人畜共患病病原体，并且由该病原体带来的损失没有减少。如上所述，由于SE和 ST显示多种抗药性，因此在韩国全国性抗微生物剂抗性监察接触性传染病预防法的执行法 令(Executive Order 16961)、接触性传染病预防法的执行条例(Ministry ofHealth and Welfare's Order 179)禾口 National Institute of Health(ExecutiveOrder 17164)的组 织下已经进行。因此，对于用来控制沙门氏菌的噬菌体开发存在需求。
发明内容
技术问题为了解决使用广谱抗生素所产生的问题，本发明人从自然来源分离了新型的沙门 氏菌噬菌体并且鉴定了其形态学、生物化学和遗传性质。本发明人发现，该噬菌体具有对肠 炎沙门氏菌(SE)、鼠伤寒沙门氏菌(ST)、鸡沙门氏菌(SG)和鸡白痢沙门氏菌(SP)的特异 性杀菌活性而不影响有益菌，并且具有优良的耐酸性、耐热性和耐干燥性，因此可以用于预 防和治疗肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的家畜沙门氏菌病和沙门氏菌食物中毒以 及鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌引起的禽伤寒和鸡白痢。还有，本发明所述的噬菌体可以 应用于各种产品以控制沙门氏菌，所述产品包括家畜饲料添加剂和饮用水、畜棚卫生消毒 剂和肉类品清洁剂，从而完成本发明。技术方案本发明的目的是提供对选自下列的一种或更多种沙门氏菌具有特异性杀菌活性 的新型噬菌体肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。本发明的另一个目的是提供预防或治疗感染性疾病的组合物，所述感染性疾病由 选自下列的一种或更多种沙门氏菌引起肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡 白痢沙门氏菌，其包含所述噬菌体作为活性成分。本发明的又一个目的是提供家畜饲料添加剂或家畜饮用水，其包含所述噬菌体作 为活性成分。本发明的又一个目的是提供卫生消毒剂或清洁剂，其包含所述噬菌体作为活性成 分。本发明的又一个目的是提供预防或治疗感染性疾病的方法，所述感染性疾病由选 自下列的一种或更多种沙门氏菌引起肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白 痢沙门氏菌，其使用所述噬菌体或包含所述噬菌体作为活性成分的组合物。有益效果本发明的新型噬菌体对选自下列的一种或更多种沙门氏菌具有特异性杀菌活性 肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌，并且具有优良的耐酸性、 耐热性和耐干燥性。因此，该新型噬菌体可以用于预防和治疗由肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门 氏菌、鸡沙门氏菌或鸡白痢沙门氏菌引起的感染性疾病，包括沙门氏菌病、沙门氏菌食物中 毒、禽伤寒和鸡白痢，并且还可以用于控制肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和 鸡白痢沙门氏菌。
图1是C5CJ3的电子显微镜照片，其中OCJ3属于肌尾噬菌体科的形态型组，其特 征在于等轴衣壳和可收缩长尾；图2是分离的噬菌体OCJ3的SDS-PAGE结果，其中噬菌体的蛋白质模式被显示 为45kDa、62kDa和80kDa的主蛋白以及17kDaJ8kDa、IlOkDa和170kDa的其它蛋白质(参 见 _ 乍为标i己物白勺 blue plus2prestained-standard (Invitrogen))；图3是分离的噬菌体OCJ3的PFGE结果，其显示出大约1581Λρ的总基因组大小(5kbp DNA大小标准物(Bio-rad)作为大小标记物)；图4是通过使用ΦCJ3基因组DNA的每个引物组进行的PCR的结果，其中(Α 使用 SEQ ID NO. 5和6的引物组的PCR扩增；B 使用SEQ ID NO. 7和8的引物组的PCR扩增；C 使用SEQ ID NO. 9和10的引物组的PCR扩增；D 使用SEQ ID NO. 11和12的引物对的PCR 扩增)所有A、B、C和D泳道均具有约1. Okbp的PCR产物；图5至8是噬菌体OCJ3的一步生长实验的结果，其中所述噬菌体具有在鸡沙门 氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌中2Xl(^pfu或更高的裂解量；图9是噬菌体OCJ3耐酸性试验的结果，其显示噬菌体在pH 2. 1、2. 5、3. 0、3. 5、 4. 0,5. 5,6. 4,6. 9,7. 4,8. 0、9. 0下的存活数，其中噬菌体OCJ3直到pH 3. 5才失去活性，但 与对照相比，其在PH 3. 0或更低下才完全失去活性；图10是噬菌体OCJ3耐热性试验的结果，其显示在37°C、45°C、53°C、60°C、70°C、 80°C和0分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟时间点下噬菌体存活数，其中噬菌体 OCJ3即使在60°C下暴露2小时后也不失去活性，并且在70°C或更高下暴露IOmin完全失 去活性；和图11是噬菌体OCJ3耐干燥性试验的结果，其通过使用喷雾干燥器和添加糊精和 糖作为稳定剂进行，其中比较干燥之前和之后滴度的改变以考查相对稳定性，以及其活性 被降低至约5Χ103。
具体实施例方式根据一个方面，本发明涉及对选自下列的一种或更多种沙门氏菌具有特异性杀菌 活性的新型噬菌体肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌，其中 所述噬菌体属于肌尾噬菌体科的形态型组，并且具有157-1591Λρ的总基因组大小和大小 为 44-46kDa、61-63kDa 和 79_81kDa 的主结构蛋白。具体而言，本发明的噬菌体具有选择性感染鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒 沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的能力，即，种属特异性。本发明的噬菌体遗传上具有157-1591Λρ，优选约1581Λρ的总基因组大小，并且在 整个基因组内可以包括一种或更多种核酸分子，其选自SEQ ID Ν0. 1、2、3和4，优选在整个 基因组内包括由SEQ ID NO. 1至4代表的核酸分子。当将本发明的噬菌体使用一种或更多种选自SEQ ID N0. 5和6、SEQ ID NO. 7和8、 SEQ ID NO. 9和10以及SEQ ID NO. 11和12的引物组进行PCR时，得到的每个PCR产物为 约ΙΙΛρ。优选地，当使用所有引物组进行PCR时，得到的每个PCR产物为约ΙΙΛρ。本发明的噬菌体属于肌尾噬菌体科的形态型组，其特征在于等轴衣壳和可收缩长 尾，以及优选图1中描述的形态学。 如本文所用，术语“核酸分子”包括DNA (gDNA和cDNA)和RNA分子，以及作为核酸 基本结构单位，术语核苷酸包括天然核苷酸和其糖或碱基修饰的类似物。本发明的噬菌体遗传上具有大小为44-46kDa、61_63kDa和79_81kDa，以及优选大 小为约45kDa、62kDa和80kDa的主结构蛋白。进一步，本发明的噬菌体具有一种或更多种耐酸性、耐热性和耐干燥性的生物化 学性质。
更具体而言，本发明的噬菌体可稳定地生存在从pH 3. 5至pH 9. 0的宽范围pH环 境中，以及从37°C至60°C的高温环境中。另外，本发明的噬菌体对干燥有抵抗力，以便甚至 在高温干燥后(例如60°C下120min)也保持生存。这些耐酸性、耐热性和耐干燥性的性质 允许本发明的噬菌体在各种温度和PH条件下应用于生产污染家畜引起的家畜疾病或人类 疾病的预防或治疗组合物。本发明人收集了在鸡屠宰场的污水样品，并且分离了具有对SE、ST、SG和SP 的特异性杀菌活性和上述特征的本发明的噬菌体，其被命名为。CJ3并且以登录号 KCCM10977P于2008年12月17保藏在韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms)(361-221，Honje 1，Seodaemun, Seoul)。根据本发明的具体实施例，本发明人收集了在鸡屠宰场的污水样品，以分离溶解 宿主细胞ST的噬菌体，并且他们证实该噬菌体能够溶解SE、ST、SG和SP。进一步，他们在 电子显微镜下考察了该噬菌体(Φ 3)，并且发现其属于肌尾噬菌体科的形态型(图1)。进一步，还分析了噬菌体OCJ3的蛋白质模式，结果是其具有大小为45kDa、62kDa 和80kDa的主结构蛋白(图2)。而且，也分析了噬菌体OCJ3的总基因组大小，结果是其具有约1581Λρ的总基因 组大小(图3)。对其遗传特征分析的结果显示，该噬菌体在总基因组内包括SEQ ID NO. 1 至4代表的核酸分子。基于这些结果，比较了与其它物种的遗传相似性。发现该噬菌体显 示与已知噬菌体非常低的遗传相似性，这表明该噬菌体是新型噬菌体(表2)。更具体而言， OCJ3-特异性引物组，SP，SEQ ID N0.5 和 6、SEQ ID N0.7 和 8、SEQ ID N0.9 和 10 以及 SEQ ID NO. 11和12被用于进行PCR。发现每种PCR产物具有约IlAp的大小(图4)。进一步，当用OCJ3感染SE、ST、SG和SP时，噬菌斑(通过一个噬菌体对宿主细胞 溶解在软琼脂上产生的透明区域)显示相同的大小和浑浊度。而且，在各种温度和pH条件下考查了 OCJ3的稳定性，结果是，0以3在从？!1 3. 5 至PH 9.0的宽范围pH环境中(图9)和从37°C至60°C的高温环境中(图10)，以及甚至在 高温干燥后(图11)稳定地维持。这些结果表明本发明的噬菌体Φ 3可以应用于各种产 品，以控制沙门氏菌。根据另一个方面，本发明涉及预防或治疗感染性疾病的组合物，所述感染性疾病 由一种或更多种选自鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌引起， 所述组合物包含所述噬菌体作为活性成分。优选地，肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病包括沙门氏菌病和沙 门氏菌食物中毒，鸡沙门氏菌引起的感染性疾病包括禽伤寒，而鸡白痢沙门氏菌引起的感 染性疾病包括鸡白痢，但不限于这些。本发明的噬菌体对鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏 菌具有特异性杀菌活性，因此可以用于预防或治疗由这些细菌引起的疾病的目的。具体而 言，在优选的实施方式中，可以包括抗生素。如本文所用，术语“预防”含义是通过施用所述组合物来遏制或延缓疾病进展的所 有行为。如本文所用，术语“治疗”含义是通过施用所述组合物患者的状况已经好转或向有 利转变的所有行为。本发明的组合物包括5 X IO2至5Χ 1012pfu/ml，以及优选IX IO6至1 X 101Qpfu/ml的 OCJ3。本发明组合物可以应用的优选的感染性疾病实例包括鸡沙门氏菌引起的禽伤寒、 鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢和肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的沙门氏菌病或沙 门氏菌食物中毒，但不限于这些。如本文所用，术语“沙门氏菌病”指沙门氏菌感染引起的症状，包括发烧、头痛、痢 疾和呕吐，即沙门氏菌属的细菌引起的疾病，其被定义为两种临床形式——类似伤寒症的 急性败血症病形式、以及急性肠胃炎形式，包括，肠炎、食物中毒和急性败血症。本发明的组合物可以另外包括药学上可接受的载体，并且与所述载体一起配制， 以提供食物、药物和饲料添加剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指对有机体不引起明显刺激和不消除被 施用化合物生物活性和性质的载体或稀释剂。对于将组合物配制成液体制剂，可以使用无 菌且生物相容的药学上可接受的载体，如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲生理盐水、白蛋白 注射溶液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油和乙醇。这些物质可以单独使用或以其任何组 合使用。如果需要，可以添加其它传统的添加剂，如抗氧化齐 、缓冲齐 、抑菌剂等。进一步， 可以另外将稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘结剂和润滑剂添加到组合物，以制备可注射制 剂如水溶液、悬浮液和乳状液，或口服制剂如丸剂、胶囊、颗粒剂或片剂。本发明的预防或治疗组合物可以被施用或喷雾到患病区域(afflicted area)，或 通过口服或肠胃外途径给药。肠胃外给药可以包括静脉内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、 皮下给药或局部给药。适于施用、喷雾或给药本发明组合物的剂量取决于多种因素，包括配制方法、给药 方式、被治疗患者或动物的年龄、体重、性别、状况和饮食、给药时间、给药途径、排泄速度和 反应敏感性。具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出所需组合物的有效量。适于本发明组合物的口服制剂的实例包括片剂、含片、锭剂、水性或乳状悬浮液、 粉末或颗粒、乳状液、硬或软胶囊、糖浆或酏剂。对于诸如片剂和胶囊的制剂，有用的是粘结 剂如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、支链淀粉、纤维素或凝胶，赋形剂如磷酸二钙，崩解 剂如玉米淀粉或甘薯淀粉，润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂富马酸钠或聚乙二醇蜡。对 于胶囊，除上述化合物之外，可以进一步使用诸如脂质的液体载体。对于非口服给药，本发明组合物可以配制成皮下、静脉内或肌肉内途径的注射剂、 栓剂或经由呼吸道可吸入的喷雾剂，如气雾剂。注射制剂可以通过这样获得将本发明组合 物与稳定剂或缓冲剂一起溶解或悬浮在水中以及将溶液或悬浮液包装在安瓿或小瓶单元 中。对于喷雾剂，如气雾剂，用于喷射水分散的浓缩物或湿粉末的推进剂可以结合添加剂使 用。如本文所用，术语“抗生素”含义是施用于动物以杀死病原体的任何药物，并且在 本文其被用作防腐剂、杀菌剂和抗菌剂的一般术语。所述动物是包括人在内的哺乳动物，以 及优选家禽。与传统的抗生素不同，本发明的噬菌体对沙门氏菌具有高度特异性，以便杀死 特异性病原体而不影响有益菌，并且不诱导抗性，使得其使用周期(Iifecycling)比较长。根据本发明的一个具体实施方式
，对噬菌体Φ 3防止禽伤寒的毒性测试通过 评价其安全性和对产蛋鸡产蛋的影响，包括其在肌肉和鸡蛋中的残留量来完成。发现，对照和Φ 3-治疗组之间产蛋率没有差别(表4)，在收集的鸡蛋中没有分离到Φ 3(表 5)，以及在用OCJ3治疗SG-感染的鸡时，OCJ3-治疗组显示明显高于未治疗组的保护率 (protection rate)(表7)，这显示出其预防和治疗效果。根据又一个方面，本发明涉及动物饲料或饮用水，其包含所述噬菌体作为活性成 分。用于水产业和家畜业的饲料添加剂抗生素被用于预防感染的目的，但导致细菌的 抗性菌株增加并且家畜产品中的残留抗生素可以被人摄取，促使人病原体中抗生素抗性和 疾病传播。另外，因为存在多种饲料添加剂抗生素，所以抗多药菌株的全球性出现逐渐增 加，这受到严重关注。因此，本发明的噬菌体可以用作饲料添加剂抗生素，其对生态环境更 友好并且能够解决上述问题。本发明的噬菌体可以单独制备成饲料添加剂，然后添加到动物饲料中，或直接添 加到动物饲料中。本发明的噬菌体可以作为液体或以干燥的形式，优选以干燥的粉末包含 在动物饲料中。干燥过程可以通过风干、自然干燥、喷雾干燥和冷冻干燥来完成，但不限于 这些。本发明的噬菌体可以以基于动物饲料重量按重量计0. 05 %至10 %，优选按重量计 0. 至2%的量作为粉末形式添加。除了本发明的噬菌体，动物饲料还可以包括用于长期 保存的其他传统添加剂。本发明的饲料添加剂可以另外包括其它非病原微生物。另外的微生物可以选自可 以产生蛋白酶、脂肪酶和转化酶的枯草杆菌(Bacillussubtilis)、在厌氧条件下具有分解 有机化合物的能力和生理活性的乳杆菌(LactcAacillus sp.)、诸如米曲霉(Aspergillus oryzae) (J AnimalSci 43 :910-926,1976)的丝状真菌，其增加家畜的体重、增强牛奶产生 以及帮助消化和吸收饲料，以及诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (JAnim Sci 56 :735-739,1983)的酵母。包含本发明Φ 3的饲料可以包括基于植物的饲料，如谷物、坚果、食物副产品、 海藻、纤维、药物副产品、油、淀粉、谷物粗粉和谷物副产品，以及基于动物的饲料，如蛋白 质、矿物、脂肪、单细胞蛋白、浮游动物和食物废物，但不限于这些。包含本发明Φ 3的饲料添加剂可以包括粘结剂、乳化剂、和用于防止质量变坏 的防腐剂、氨基酸、维生素、酶、益生菌、调味剂、非蛋白质氮、硅酸盐、缓冲剂、着色剂、提取 物、和用于效率改善的低聚糖，以及其它饲料预混合物，但不限于这些。进一步，混合有本发明噬菌体的饮用水的供应可以减少家畜肠道中沙门氏菌的数 量，从而获得无沙门氏菌的家畜。根据又一个方面，本发明涉及卫生消毒剂和清洁剂，其包含所述噬菌体作为活性 成分。为了清除沙门氏菌，包含所述噬菌体作为活性成分的卫生消毒剂可以用于家畜棚 舍、屠宰场、污染区域和其它生产设备，但不限于这些。进一步，包含所述噬菌体作为活性成分清洁剂可以施用于活动物的污染的皮肤、 羽毛和其它污染的身体部分，以清除沙门氏菌。根据又一个方面，本发明涉及使用所述噬菌体或组合物来预防或治疗感染性疾病 的方法，所述感染性疾病由选自下列的一种或更多种沙门氏菌引起肠炎沙门氏菌、鼠伤寒 沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。
本发明的组合物可以以药物制剂或作为动物饲料组分或以它们的饮用水给予动 物，优选通过作为饲料添加剂混合进动物饲料来给予。本发明的组合物可以以典型方式经由任何途径给予，如口服或肠胃外途径，具体 而言，口服、直肠、局部、静脉内、腹膜内、肌肉内、动脉内、经皮、鼻内和吸入途径。本发明的治疗所述疾病的方法包括施用药学有效量的本发明组合物。总日剂量 应该由医师通过适当的医学判断来确定，这对本领域技术人员而言是显而易见的。患者的 药学有效量可以根据医学领域中公知的各种因素而不同，包括待被实现的应答的种类和程 度、患者的状况如年龄、体重、健康状态、性别和饮食、给药时间和途径、组合物的排泄速率、 治疗持续时间、根据是否与其一起使用其它药剂的具体组成等。在下文中，将参考下述实施例对本发明进行更详细的描述。然而，这些实施例仅仅 是用于说明性目的，本发明不意图受这些实施例限制。发明方式实施例1 沙门氏菌噬菌体分离1-1.噬菌体筛选和单噬菌体分离将50ml来自鸡屠宰场和下水道污水的样品转移到离心管中，并且在4000rpm下离 心10分钟。然后使用0. 45 μ m过滤器过滤上清液。将18ml样品滤液与150 μ 1 ST振荡 培养基(OD6tltl = 2)和anl IOXLuria-Bertani培养基(下文为LB培养基，胰蛋白胨IOg ； 酵母提取物5g ；NaCl IOg ；最终体积为1L)混合。在37°C下将混合物温育18小时，并且在 4000rpm下将培养基离心10分钟。使用0. 2 μ m过滤器过滤上清液。将:3ml 0. 7%琼脂(w/ ν)和150 μ 1 ST振荡培养基(0D_ = 2)混合，并且在LB板上铺板，使其变为固体培养基。 在其上涂布10μ 1培养物滤液，并且在37°C下培养18小时(0. 7%琼脂被用作“顶层琼脂 (top-agar)，，以及噬菌体裂解物的滴定在顶层琼脂上进行，称为软琼脂覆盖法(softagar overlay method))。将含有噬菌体裂解物的样品培养基稀释，并与150 μ 1 ST振荡培养基(0D_ = 2) 混合，接着进行软琼脂覆盖法，以便获得单个噬菌斑。因为单个噬菌斑代表一个噬菌体，所 以，为分离单个噬菌体，将一个噬菌斑添加到400 μ 1 SM溶液(NaCl，5. 8g ；MgS047H20, 2g ； IM Tris-Cl (pH7. 5), 50ml ;H20，最终体积为1L)，以及在室温下放置4小时，以分离单个噬菌 体。为了大量纯化噬菌体，从单个噬菌体溶液取出100 μ 1上清液，并且与12ml 0. 7%琼脂 和500 μ 1 ST振荡培养基混合，接着在LB板上(150mm直径)进行软琼脂覆盖法。当裂解 完成时，将15ml SM溶液添加到该板。轻轻地将该板在室温下振荡4小时，以从顶层琼脂洗 脱噬菌体。回收含有洗脱的噬菌体的SM溶液，并且添加氯仿至最终体积为1%，充分混合 10分钟。在4000rpm下将该溶液离心10分钟。使用0. 2 μ m过滤器过滤获得的上清液，并 且储存在冰箱中。1-2.噬菌体的大规模批量化使用ST大量培养选择的噬菌体。ST被振荡培养，并且将1.5X IOltlCfu(菌落 形成单位)的试样在4000rpm下离心10分钟，并将沉淀重悬浮于細1 SM溶液中。将 7. 5X l(fpfu (噬菌斑形成单位)噬菌体接种到其上(Μ0Ι 感染复数=0. 005)，以及在37°C 放置20分钟。将该溶液接种到150ml LB培养基中，并且在37°C下培养5小时。添加氯仿 至最终体积为1%，将培养溶液振荡20分钟。添加DNase I和RNase A至最终浓度分别为1 μ g/ml。在37°C下放置该溶液30分钟。添加NaCl和PEG(聚乙二醇)至最终浓度分别为 IM和10% (w/v)并且在37°C下再放置3小时。在4°C和12000rpm下将该溶液离心20分 钟，以弃去上清液。将沉淀重悬浮于5ml SM溶液中，并且在室温下放置20分钟。向其中添 加細1氯仿并充分混合，接着在4°C和4000rpm下离心20分钟。使用0. 2 μ m过滤器过滤 上清液，并且通过甘油密度梯度超速离心法(密度40%，5(%甘油，在35，000印111和41下1 小时)来纯化OCJ3。纯化的噬菌体命名为噬菌体ΦCJ3，并且使其重悬浮在300 μ 1 SM溶 液中，接着进行滴定。于2008年12月17日以登录号KCCM10977P将噬菌体OCJ3保藏于 韩国微生物保藏中心(Korean Culture Center of Microorganisms) (361—221，Honje 1， Seodaemun, Seoul)。实施例2 :对Φ CJ3感染沙门氏菌的考察为考察选择的噬菌体对其它沙门氏菌以及ST的裂解活性，尝试用其它沙门氏菌 进行交叉感染。结果，ΦCJ3不感染SC (猪霍乱血清型肠道沙门氏菌(Salmonella enterica Serotype Choleraesuis))、SD(德比血清型肠道沙门氏菌(Salmonellla enterica Serotype Derby))、SA (肠道沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella enterica subsp. Arizonae))、SB (肠道沙门氏菌邦戈亚种(Salmonella enterica subsp. Bongori))，但特异 性感染SG、SP、ST和SE(参见实施例12)。结果显示在下列表1中。使用SG作为宿主细胞 产生的噬菌体Φ 3显示出与使用ST作为宿主细胞产生的那些相同的噬菌斑大小和噬菌 斑浑浊度，以及相同的蛋白质模式和基因组大小。[表 1]<OCJ3感染沙门氏菌〉
权利要求
1.一种新型噬菌体，其对选自肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis)、鼠伤寒沙门 氏菌(Salmonella Typhimurium)、鸡沙门氏菌(Salmonella Gallinarum)禾口鸡白病沙门氏 菌(Salmonella Pullorum)的一种或更多种沙门氏菌具有特异性杀菌活性，所述噬菌体属 于肌尾噬菌体科的形态型组并且具有157-159 kbp的总基因组大小和大小为44-46 kDa、 61-63 kDa和79-81 kDa的主结构蛋白。
2.权利要求1所述的噬菌体，其中所述噬菌体通过登录号KCCM10977P来确定。
3.权利要求1所述的噬菌体，其中所述噬菌体具有图1中描述的形态学。
4.权利要求1所述的噬菌体，其中所述噬菌体在整个基因组中包括选自SEQID NO. 1、 2、3和4的一种或更多种核酸分子。
5.权利要求1所述的噬菌体，其中在使用选自SEQID NO. 5和6、SEQ ID NO. 7和8、 SEQ ID NO. 9和10以及SEQ ID NO. 11和12的一种或更多种引物组进行PCR后，每个PCR 产物具有IlAp的大小。
6.权利要求1所述的噬菌体，其中所述噬菌体具有下述1)-3)的一种或更多种性质1)在ρΗ3·5至ρΗ9· 0的ρΗ范围内的耐酸性；2)在37°C至60°C的温度范围内的耐热性；以及3)在37°C-60°C、0-120分钟下的耐干燥性。
7.组合物，其用于预防或治疗选自鸡沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和肠 炎沙门氏菌的一种或更多种沙门氏菌引起的感染性疾病，所述组合物包含权利要求1至6 中任一项所述的噬菌体作为活性成分。
8.权利要求7所述的组合物，其中肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的感染性疾病 是沙门氏菌病或沙门氏菌食物中毒，鸡沙门氏菌引起的感染性疾病是禽伤寒，而鸡白痢沙 门氏菌引起的感染性疾病是鸡白痢。
9.权利要求7所述的组合物，其中所述组合物被用作抗生素。
10.动物饲料或饮用水，其包含权利要求1至6中任一项所述的噬菌体作为活性成分。
11.卫生消毒剂或清洁剂，其包含权利要求1至6中任一项所述的噬菌体作为活性成分。
12.预防或治疗感染性疾病的方法，所述感染性疾病由选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门 氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的一种或更多种沙门氏菌引起，所述方法使用权利要 求1至6所述的噬菌体。
13.预防或治疗感染性疾病的方法，所述感染性疾病由选自肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门 氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的一种或更多种沙门氏菌引起，所述方法使用权利要 求7所述的组合物。
全文摘要
本发明涉及新型噬菌体，更具体而言，涉及对选自下列的一种或更多种沙门氏菌具有特异性杀菌活性的噬菌体肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌。进一步，本发明涉及预防或治疗感染性疾病的组合物，所述感染性疾病包括由肠炎沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌引起的沙门氏菌病和沙门氏菌食物中毒、由鸡沙门氏菌引起的鸡伤寒和由鸡白痢沙门氏菌引起的鸡白痢，所述组合物包含所述噬菌体作为活性成分。而且，本发明涉及饲料添加剂、饮用水、清洁剂和卫生消毒剂，其包含所述噬菌体作为活性成分。
文档编号C07K7/00GK102149816SQ200980100079
公开日2011年8月10日 申请日期2009年12月7日 优先权日2008年12月24日
发明者姜寅惠, 崔香, 朴敏兌, 申秀安, 赵英郁 申请人:Cj第一制糖株式会社