专利名称：一种适用于从人尿中大规模富集白蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及从人尿液中富集人血白蛋白的方法。
背景技术：
人血白蛋白(Human serum albumin, HSA)正常存在于人血浆中，具有十分重要的生理功能。从人血浆提取的人血白蛋白对于抢救治疗休克、烧伤、创伤是不可替代的药物， 在战伤、工伤事故以及外科手术等场所被大量应用；在临床上人血白蛋白还被用于慢性肾 炎、肝炎、肝硬化和晚期恶性肿瘤、营养不良水肿症、低白蛋白血症等病症的治疗；人血白蛋 白还用作赋形剂和稳定剂、生产疫苗的免疫佐剂、无血清细胞培养基的组分等；也被用作药 物载体，赋予药物更好的理化特性。白蛋白也是常用而又昂贵的生物试剂，在大量生物活性 检测实验中，缓冲液常加入白蛋白，用以稳定活性蛋白质。在人血白蛋白应用范围的不断扩大的背景下，制备人血白蛋白的血源日趋紧张， 血浆缺口越来越大。扩展人血白蛋白的来源成为医药界普遍关注并努力解决的问题。目 前，人血白蛋白的基因工程取得了较大的进展，已在大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、植物和转基 因动物等系统中进行了重组白蛋白的表达，Delta的重组白蛋白(Recombumin )已经上市， 用作疫苗、生物技术药物等蛋白药物的赋形剂，但还远不能满足市场需要。研究证明，人尿液中的白蛋白与人血白蛋白的分子结构和生物学性质相同，是同 一物质(Poortmars, J. etal.，Biochemica et Biophysica Acta，43 (1966)，380—389)。尽 管尿液中白蛋白浓度很低，只有约10_20mg/L，但巨量的尿液来源，使其中的白蛋白含量也 成为一个巨量。医药界从人尿液中提取蛋白质的做法由来已久，最有代表性的尿蛋白产品是尿 激酶。提取尿激酶等尿蛋白的传统方法是，在男性成人排尿处设置容器收集尿液，运输到 加工点或生物化学制药机构集中进行后续处理。因为人尿中白蛋白浓度很低，仅及血浆 的1/2000-4000，即便在人口密度较高的城市的公共厕所收集尿液，其收集与运输成本也很 高，而且在收集、运输过程中很难避免尿液抛洒，对城市卫生造成损害。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种从人尿液中富集、纯化白蛋白的方法，该方 法适合大面积、大规模使用，收集与处理成本较低，符合城市卫生化要求，能得到质量达到 药典要求的高纯度白蛋白制品。本发明目的是按以下技术方案实现的采用阴离子交换剂制作过滤装置，称尿液过滤装置，将其置放于尿斗或小便池内， 用以承接尿液从过滤装置流过。尿液过滤装置的形状、大小与尿斗或小便池相适应，保证如 厕人所排尿液全部或大部流经过滤装置。定时回收尿液过滤装置，对其中的阴离子交换剂 作集中解吸、过滤处理，收集白蛋白，并对阴离子交换剂作再生处理备作再用。离子交换剂亦称离子吸附剂。可以使用任何一种阴离子交换剂充填于尿液过滤装置，包括各种树脂和凝胶为载体的阴离子交换剂，交换基团包括伯胺、仲胺、叔胺、季胺基的 阴离子基团。其中优选大孔型阴离子树脂，再优选配基为季胺基-N+(CH3)3的强碱性阴离子 交换树脂。在将阴离子交换剂充填于尿液过滤装置之前应先对其进行再生处理用碱再生， 水冲至中性。尿液过滤装置的一种结构形式是，以通透性良好的滤布包裹阴离子交换剂制作尿 液过滤垫，置放于尿斗或小便池内，用以承接尿液从过滤垫流过。尿液过滤垫的形状、大小 与尿斗或小便池相适应。尿液过滤装置的另种结构形式是管柱形尿液过滤装置。它以硬质材料制作管筒， 管腔内充填阴离子交换剂，管筒的上下口以滤布或滤膜封闭，或是制作为网状结构；管壁可 以是致密的，也可以是液体通透结构。如此管柱形尿液过滤装置置放于尿斗内，或安装在小 便池尿液出口处，用以承接尿液从管柱内流过。管柱形尿液过滤装置的形状、大小与尿斗或小便池出口相适应。用以制作尿液过滤装置的滤布应通透性良好，保证尿液快速透过，同时又不使离 子交换剂从袋中漏出。适宜的滤布为筛号300目以下，50目以上孔径的滤布，优选筛号50 目-100目孔径的滤布。尿液过滤装置所承接的尿液可以是男性所排出的尿液原液，也可以是被水稀释后 的尿液。尿液过滤装置每次在尿斗或小便池中留置并作置换的时间周期，根据尿液过滤垫 中阴离子交换剂装料的多少、所承接的尿液流过量多少以及环境温度等因素酌情而定，一 般在城市公共厕所放置8-48小时回收是适宜的。其中，以一昼夜为优选周期时间。按本发明方法，尿液原液或被水稀释的尿液流过作为阴离子交换剂的树脂，白蛋 白被吸附在树脂上，实现尿液中白蛋白的富集。尿液过滤装置经过对吸附剂作再生处理后 可以多次反复使用。就运输和后加工而言，相当于将尿液浓缩了 100倍，大大降低了收集和 处理成本，提高了工作效率，而且不产生对环境的不利影响。发明人分别使用多种阴离子交换剂对不同稀释度尿液进行白蛋白吸附实验，表 明，本发明方法对尿液原液和稀释倍数低于20倍的尿液都可以得到良好的尿液白蛋白吸 附，吸附率可达到70%以上。每公斤树脂吸附的人尿白蛋白通过解吸、硫酸铵沉淀等步骤所 能制备的白蛋白粗制品约1.5克，白蛋白含量大于60%。经过后续的层析纯化与病毒灭活 过程，可得到约0. 6克纯度达到96%以上的白蛋白，各种指标均可达到中国药典要求，可在 多种领域作为人血浆来源白蛋白的替代品应用。虽然尿液白蛋白浓度仅及血浆的1/2000-4000，约10_20mg/L，但尿液来源较血浆 广泛得多。如果每天收集1000吨尿液，其中的白蛋白含量约10-15公斤。按40%收率计 算，可年产2吨白蛋白制品，为替代人血浆来源白蛋白展示了良好前景。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1制作尿液过滤垫尿液过滤垫由起包裹作用的布袋和布袋内填充的阴离子交换树脂构成。其制作 方法为，取通透性良好，又能牢靠包裹吸附剂颗粒的滤布缝制布袋。滤布适宜的筛号为300目以下，50目以上孔径，优选筛号50目-100目孔径。过滤垫的形状和大小与尿斗或便池的底部相适应，可以为方形、圆形、多边形等形状；用于尿斗使用的过滤垫其边长或直径在10-40cm为宜；用于小便池使用的过滤垫又可以分为两种类型一是平铺于小便池的底部，其大小应能全面覆盖小便池底；另种类型是装置于小便池尿液流出口处，能填塞并覆盖尿液流出口，使尿液在流出小便池前流经过滤垫。 取大孔型阴离子交换树脂，例如配基为〔-N+ (CH3) 3〕的丙烯酸树脂、配基为-N(CH3) 30H的苯乙烯-二乙烯苯共聚体等，经过2% NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。过滤垫中阴离子交换树脂的装料量根据安置过滤垫处一置换周期内尿液流量多少决定。该处单位时间尿液流量由测量或估算获得。优选的阴离子交换树脂装量为每24小时尿液流量100L-200L使用1公斤树脂。实施例2制作管柱形尿液过滤装置选用壁厚1mm左右的塑料管，以白色为优；管的截面为圆形、矩形或多边形；管的周径与尿斗或小便池出口相适应；管壁的高度根据置放场所选择放置在尿斗的过滤管柱优选圆柱型，高度宜2-lOcm;安装在小便池出水口处的过滤管柱，其具体尺寸根据出水口的形状、大小和深度确定，管壁高度宜3cm 30cm。尿液过滤管柱上下口以滤布或滤膜封闭，滤布筛号优选50目；管腔内充填阴离子交换树脂。阴离子交换树脂的用料和预处理同实施例1。实施例3测试尿液过滤垫富集白蛋白效果使用按实施例1方法制作的尿液过滤垫，过滤垫大小为20CmX30Cm，制作过滤垫的滤布孔径为50目；阴离子交换树脂使用配基为〔-N+(CH3)3)的大孔型阴离子交换树脂丙烯酸树脂2公斤，经过2% NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫，放置在尿斗中。以倾倒方式，将备好的男性尿液原液200L，以大体均勻的流速，在30分钟倒入尿斗中，尿液流经尿液过滤垫。之后，从过滤垫取出树脂，用自来水冲洗后，装入层析柱，再用含IMNaCl的醋酸缓冲液(50mM，pH4. 5)进行解吸；收集洗脱峰5200ml，测定尿液、残尿、解吸液的白蛋白含量和总蛋白量，白蛋白测定应用Raybio尿微量白蛋白测定试剂盒进行，总 蛋白含量应用Lowry法测定。结果尿液中白蛋白含量为13mg/L，残尿中约2mg/L，洗脱溶液中白蛋白380mg/L，得到1.97克白蛋白，收率约76%。实施例4以孔径为80目的滤布缝制30cmX 30cm大小滤袋，取用配基为-N(CH3) 30H的大孔型阴离子交换树脂苯乙烯-二乙烯苯共聚体2公斤，经过2% NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。将尿液过滤垫放置尿斗中，24小时后置换过滤垫，收集树脂，按照实施例3所述方法解吸。洗脱溶液中含白蛋白0. 91克，收率约35 %。实施例5以孔径为150目的滤布缝制30CmX30Cm大小滤袋，取用同时具有伯胺、仲胺、叔胺、季胺配基的弱碱性环氧树脂2公斤，经过2% NaOH处理，水冲至中性，装入滤布袋中，制成尿液过滤垫。
将尿液过滤垫放置尿斗中，24小时后置换过滤垫，收集树脂，按照实施例3所述方法解吸。洗脱溶液中含白蛋白0.61克，收率约24%。实施例6取用大孔型阴离子交换树脂丙烯酸树脂2公斤，其配基为-N+ (CH3) 3，经过2% NaOH 处理，水冲至中性，装入孔径为100目，直径20cm的圆形滤布袋中，制成过滤垫，置放于卫生 间的尿斗中，24小时后收集树脂，按照实施例3所述方法解吸，洗脱溶液中含白蛋白1.62 克，收率约63%。实施例7尿液收集处为大型厕所的三个小便池。据测算，每个小便池一昼夜尿液流量约 1500L。选取孔径为60目的滤布缝制大小为30cmX30cm的滤布袋15个；取配基为 〔-N+(CH3) 3〕的大孔型阴离子交换树脂丙烯酸树脂30公斤，经过2% NaOH处理，水冲至中性， 分别装入滤布袋中，每个滤布袋装填2kg，制成15个尿液过滤垫。按照相当于“每24小时 流过约150L尿液/1公斤树脂”比例，每个小便池置放5个尿液过滤垫，特别覆盖小便池出 水口附近。24小时后收集树脂，用水冲洗，再用含IMNaCl的醋酸缓冲液(50mM，pH4. 5)进行 解吸，将洗脱液(解吸)超滤浓缩60倍，加硫酸铵粉末至饱和，静置2小时，加硅藻土过滤 收集沉淀，得到白蛋白粗制品200克，其中白蛋白含量为29克，总蛋白含量为40克。其中， 白蛋白测定利用尿微量白蛋白测定试剂盒进行，总蛋白含量利用凯氏定氮法测定。实施例8对按实施例4-7方法制取的白蛋白粗制品后续纯化步骤将白蛋白粗制品溶解，过滤，经过Phenyl疏水层析
,收集上样和冲洗峰，超滤 后用SP-S印harose FF吸附[50mM醋酸缓冲(pH3. 8)]，再用0. 5MNaCl溶液(50mM醋酸缓 冲，pH 5.0)，进行洗脱，收集蛋白峰，60°C加热10小时处理，DEAE阴离子层析(平衡液 50mMPBS，pH 6. 0)，低盐冲洗后收集洗脱峰，洗脱液为平衡液加0. 5MNaCl。超滤浓缩，过 0. 22 μ m的滤膜除菌，冷冻干燥，得到15克白蛋白冻干粉。对该冻干粉分析=SDS-PAGE为单一条带，等电聚焦测定其等电点约4. 8，两项均与人血白蛋白对照品一致。其它指标符合中国药典指标。
权利要求
一种从人尿中富集白蛋白的方法，特别适合于大规模使用，其特征在于，采用阴离子交换剂制作尿液过滤装置，将其置放于尿斗或小便池内，用以承接尿液从过滤装置流过；尿液过滤装置的形状、大小与尿斗或小便池相适应；定时回收尿液过滤装置，对其中的阴离子交换剂作集中解吸，收集含白蛋白的组份，并对阴离子交换剂作再生处理备作再用。
2.根据权利要求1所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，尿液过滤装置内所充填的 阴离子交换剂为以树脂或凝胶为载体的任何一种阴离子交换剂。
3.根据权利要求2所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，所述阴离子交换剂的交换 基团为伯胺基、仲胺基、叔胺基、季胺基中任何一种阴离子基团。
4.根据权利要求3所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，所述阴离子交换剂的配基 为季胺基-N+(CH3)3基团。
5.根据权利要求2所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，所述阴离子交换树脂为大 孔型树脂。
6.根据权利要求1 5任一权利要求所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，尿液过滤 装置是以通透性良好的滤布包裹阴离子交换剂制作尿液过滤垫，置放于尿斗或小便池内， 尿液过滤垫的形状、大小与尿斗或小便池相适应。
7.根据权利要求1 5任一权利要求所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，尿液过滤 装置为管柱形，是以硬质材料制作管筒，管壁是致密的或是液体通透的，管腔内充填阴离子 交换剂，管筒的上下口以滤布或滤膜封闭，置放于尿斗内或安装在小便池尿液出口处，其形 状、大小与尿斗或小便池出口相适应。
8.根据权利要求8所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，用以制作尿液过滤垫的滤 布为筛号300目以下，50目以上孔径的滤布。
9.根据权利要求1所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，尿液过滤装置垫所承接的 尿液为男性所排尿液。
10.根据权利要求14所述的富集白蛋白的方法，其特征在于，尿液过滤装置所承接的 尿液是尿液原液或经水稀释的尿液。
全文摘要
本发明涉及一种从人尿中富集白蛋白的方法，特别适合于大规模使用，它是采用阴离子交换剂制作尿液过滤装置，将其置放于尿斗或小便池内，用以承接尿液从过滤装置流过；尿液过滤装置的形状、大小与尿斗或小便池相适应；定时回收尿液过滤装置，对其中的阴离子交换剂作集中解吸，收集含白蛋白的组份，并对阴离子交换剂作再生处理备作再用。经后续的纯化处理，可制得各种指标均达到药典要求的白蛋白，在多种领域作为人血浆来源白蛋白的替代品应用。
文档编号C07K14/76GK101798344SQ20101010630
公开日2010年8月11日 申请日期2010年2月5日 优先权日2010年2月5日
发明者俞恒, 傅和亮, 傅和祥, 苗丕渠 申请人:扬州艾迪生物科技有限公司;扬州维普生物科技有限公司