专利名称：：一种鹿筋胶原蛋白的制备方法
技术领域：
：本发明属于胶原蛋白纯化
技术领域：
，具体涉及一种采用盐酸水解和胰蛋白酶酶解的提取纯化工艺制备水溶性很好的鹿筋胶原蛋白的方法。
背景技术：
：胶原的英文是collagen，源自希腊文，意思是“生成胶的产物”，它是一类重要的蛋白质。1940年，Orekhovich等用柠檬酸缓冲液(pH3.O4.5)从大鼠皮中溶解出不溶于水的蛋白质，其中含有角蛋白及弹性蛋白，此外还有一种是胶原的前驱体，这种从酸性盐溶液中提取的胶原被命名为“前胶原”。后来经过许多研究者的努力，发现从中性盐和碱性盐溶液中也能提取出胶原。1953年，Gross把这种构建胶原的蛋白质单体命名为“原胶原”(tropocollagen)，它是胶原的基本结构单位，原胶原分子经过多级聚集，形成了胶原。早先认为胶原只不过是一个结构单一的，既缺少免疫原性又缺乏生物活性的普通结构蛋白。近30年来，由于生物化学、分子生物学和细胞生物学技术的发展，人们对细胞外基质，特别是对其主要成分胶原的兴趣日益浓厚，对其研究方法和结构的认识逐渐提高，现已肯定胶原并不是某一个蛋白质的名称，而是在结构上既有共同特点又有差异的一组蛋白质。现在对胶原的定义是它是细胞外基质(ECM)的一种结构蛋白质，含有一个或几个由α-链组成的三螺旋结构的区域，即胶原域(VictoriaJ.Christiansen.ArchBiochemBiophys.2007,457(2)177-186)。胶原占体内蛋白质总量的25%30%，相当于体重的6%，是构成皮肤、韧带、软骨、肌腱等结缔组织或器官的主要成分，起着支撑器官、保护机体的功能(将挺大，胶原与胶原蛋白[M]，北京，化学工业出版社，2006，2)。胶原具有完整的三螺旋结构，分子量大约为30万，不溶于冷水和热水，不能被蛋白酶利用；明胶是胶原在酸、碱、酶或高温作用下的变性产物，它不是均一的蛋白质，而是一种热可溶性的混合物，温度降到30°C以下形成凝胶，加热则液化；胶原蛋白是胶原或明胶的水解产物，具有较小的分子质量，可溶于冷水，并且更易降解，易被人体消化吸收。近年来胶原蛋白不仅在食品(李二凤，何小维、罗志刚，胶原蛋白在食品中的应用[J]，中国乳品工业，2006，34⑵5759)、化妆品(薛艳丽，胶原蛋白与美容[J]，中国实用医药，2006，1(9)84)等领域应用广泛，现有研究表明其降解产物胶原蛋白尚具有降血压、抗衰老、增加骨密度、降低甘油三酯和胆固醇(李彦春、程宝箴、靳立强，胶原蛋白应用[J]，皮革化工，2002，19(3):1014)，并且可以补充体内某些必需的微量元素等多种生理活性。一般的蛋白质含有20种氨基酸，而胶原蛋白中仅含有18种氨基酸，并且其氨基酸的组成特点为总氨基酸中约1/3是甘氨酸，存在特殊的羟脯氨酸和羟赖氨酸，缺少胱氨酸和色氨酸(将挺大，胶原与胶原蛋白[M]，北京，化学工业出版社，2006，4)。在绝大多数的蛋白质中脯氨酸含量很少，而胶原蛋白中脯氨酸和羟脯氨酸的含量是各种蛋白质中最高的，这两种氨基酸为环状氨基酸，能锁住整个胶原分子，使之很难拉开，故胶原具有微弹性和很强的拉伸强度。鹿筋是鹿科动物梅花鹿CervusnipponTemminck或马鹿Cervus.elaphusLinnaeus的四肢干燥筋，始载于《唐本草》。用于治疗肾虚手足无力、风湿关节痛、劳损、转筋等症。现有较多研究表明，摄取一定量的鹿筋胶原蛋白可预防和治疗类风湿性关节炎(孙晓迪，李银清，赵雨，等，鹿筋胶原对大鼠佐剂性关节炎的治疗作用[J]，中国中药杂志，2009，34(21):3135-3138)、骨质疏松等症。目前，很多关于胶原蛋白的提取工艺研究，尚未发现对鹿筋中胶原蛋白提取工艺研究的相关报道。
发明内容本发明的目的是提供一种鹿筋胶原蛋白的制备方法，其是将鹿筋采用盐酸浸提，水煮提取后离心得到明胶，再经胰蛋白酶酶解后离心，经0.2μm0.45μm滤膜过滤后，将所得滤液冻干即制备得到含量很高的胶原蛋白。本发明所述的鹿筋胶原蛋白粉的制备方法，其步骤如下1)取新鲜鹿筋去脂肪、皮、筋膜后，切成0.5Icm3的小块，用浓度为0.9%(g/100mL)的生理盐水反复清洗去除血清和脂肪，再用蒸馏水冲洗干净，置于_20°C冰箱中保存，含水率为；6368%；2)取上述处理好的鲜鹿筋，按料液比Ig5mlIg15ml的比例加入0.05%1.0%体积浓度的盐酸溶液，然后置于4°C冰箱中浸泡12h60h，鹿筋吸收酸水而发生酸膨胀，将膨胀好的鹿筋取出置于100°C沸水中，至鹿筋全部溶解，然后用夹有脱脂棉的纱布过滤，弃掉残渣；将滤出液于1200015000rpm/min条件下离心IOmin45min，弃掉沉淀得上清液，此上清液即为明胶溶液；3)向明胶溶液中加入NaOH,KOH、CaO或Na2CO3溶液调pH为6.57.5，1200015000rpm/min离心IOmin45min后，弃掉沉淀，保留上清液；4)取步骤3)的上请液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，用以对比酶解前后的分子量的大小，明胶溶液保留时间约为1012min；5)向步骤3)的上清液中加胰蛋白酶，酶与底物(底物指鲜鹿筋)比为Ig5000gIg50000g，置37°C恒温水浴箱中，酶解0.53h后立即升温至80100°C，保温1015min，使胰蛋白酶失活；上清液取出放置至室温，1200015000rpm/min条件下离心IOmin45min，弃掉沉淀，即得胶原蛋白溶液；6)取胶原蛋白溶液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，水解后胶原蛋白保留时间约为2022min；7)将步骤5)的胶原蛋白溶液加热浓缩，然后放置至室温，用0.2μm0.45μm滤膜过滤，将滤液冻干，即得胶原蛋白粉。8)采用Folin-酚试剂法测定胶原蛋白粉中胶原蛋白含量，胶原蛋白粉收率为62.5280.31%(以绝干重计)，胶原蛋白含量为50.1372.25%(质量百分比)。本发明制备的胶原蛋白具有的优点1、实验工艺简单易操作，实验结果稳定，可适用于工业大生产；2、本发明采用的是低浓度盐酸(0.05%1.0%)浸提，防止强酸使氨基酸结构破坏；3、本发明采用胰蛋白酶酶解，对比胃蛋白酶，酶解时间短，酶解条件温和，酶解程度高；4、本发明采用酸解后酶解的方法，可以确保胶原蛋白的肽链结构保持较为完整；5、胶原分子量大约为300000Da，不溶于冷水和热水，不能被蛋白酶利用，而水解得到的胶原蛋白分子量大部分在6500Da以下，可溶于冷水，且易降解，易被人体吸收利用；6、本发明得到的胶原蛋白产率高，含量高，不仅可用于食品，化妆品等，对其药理作用研究表明，其对于类风湿性关节炎及骨质疏松症有一定的预防和治疗作用。图1明胶溶液和胶原蛋白溶液的高效液相凝胶色谱图。其中，曲线A为明胶溶液高效液相凝胶色谱图；曲线8000酶解Ih后胶原蛋白溶液高效液相凝胶色谱图；曲线C为110000酶解3h后胶原蛋白溶液高效液相凝胶色谱图；曲线D为130000酶解3h后高效液相凝胶色谱图。鹿筋中的胶原具有完整的三螺旋结构，文献中报道分子量大约为三十万，不溶于热水，不能被蛋白酶酶解；酸膨胀后的鹿筋经加热水解成明胶，明胶的分子量大约为十几万，不易被人体消化吸收；经胰蛋白酶酶解得到的为胶原蛋白，分子量主要在6500Da以下，此时的胶原蛋白易降解，已被人体消化吸收。从高校液相凝胶色谱图中可以很容易的看出水解后的明胶和不同酶与底物比酶解得到的胶原蛋白分子量的变化，是一种检测蛋白水解程度的一种方法。采用美国AglientllOO高效液相，SKgelG2000SW(XL)凝胶柱测定。色谱条件流动相为0.IMNa2HPO4,0.IMNaH2PO4,0.IMNa2SO4,ρΗ6·6，流速为0.5ml/min。标准分子量15.48min,分子量75000Da；17.04min,分子量43000Da；18.93min,分子量29000Da；19.85min,分子量13700Da；21.23min,分子量6500Da。采用美国AglientllOO高效液相，WondasilC18柱(4.6X150mm)测定。色谱条件流动相A:0.lmol/L醋酸钠缓冲溶液(取醋酸钠39.78g，加水至4850mL，用36%醋酸调至PH6.5)-乙腈(973)；流动相B:乙腈-水(41)。流速1.Oml/min；柱温35°C；检测波长:254nm；进样量20μL。表1鹿筋胶原蛋白中18氨基酸含量采用HPLC-C18柱测定胶原蛋白粉中氨基酸含量，从表1中得到鹿筋胶原蛋白中甘氨酸含量为31.796%，羟脯氨酸含量为7.042%，脯氨酸含量为14.561%，符合胶原蛋白中氨基酸含量特点。表1鹿筋胶原蛋白中的18氨基酸及含量(质量百分比)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具体实施例方式实施例11)取新鲜鹿筋去脂肪、皮、筋膜后，切成0.5Icm3的小块，用0.9%的生理盐水反复清洗去除血清和脂肪，再用蒸馏水冲洗干净，置-20°C冰箱中保存，含水率约为65%；2)取上述处理好的鲜鹿筋30g，按料液比Ig10ml，加入300ml、0.1%体积浓度的盐酸溶液置4°C冰箱中12h，使鹿筋吸收酸水而发生酸膨胀，12小时后取出鹿筋置于100°C沸水中，至鹿筋全部溶解，所用时间为75min，然后用夹有脱脂棉的纱布过滤，将滤液离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，保留上清液；3)向上清液中加入IM的NaOH溶液调pH至7.0，离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，保留上清液，即为明胶溶液；4)取步骤3)的明胶溶液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，明胶溶液保留时间约为12min，结果见图1中A；5)向步骤3)的明胶溶液中按酶与底物比IgSOOOg加胰蛋白酶0.0037g，置于37°C恒温水浴中酶解lh，lh后立即升温至80°C以上，保持lOmin，使胰蛋白酶失活。取出放置至室温，离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，上清液即为胶原蛋白溶液；6)取步骤5)中胶原蛋白溶液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，水解后胶原蛋白保留时间约为21min，结果见图1中B；7)将步骤5)胶原蛋白溶液浓缩至100ml，放置至室温，用0.45μm滤膜过滤，滤液冻干，即得胶原蛋白粉，收率为70.25%(以绝干重计)，胶原蛋白含量为62.47%(质量百分比)。实施例21)取新鲜鹿筋去脂肪、皮、筋膜后，切成0.5Icm3的小块，用0.9%的生理盐水反复清洗去除血清和脂肪，再用蒸馏水冲洗干净，置-20°C冰箱中保存，含水率约为65%；2)取上述处理好的鲜鹿筋30g，按料液比IgIOml加0.2%体积浓度的盐酸溶液置4°C冰箱中36h，使鹿筋吸收酸水而发生酸膨胀，36h后取出鹿筋置于100°C沸水中，至鹿筋全部溶解，所用时间为55min，然后用夹有脱脂棉的纱布过滤，将滤液离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，保留上清液；3)向步骤2)的上清液中加入IMNaOH溶液调pH至7.0，离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，保留上清液，即得明胶溶液；4)取步骤3)的明胶溶液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，明胶溶液保留时间约为12min，结果见图1中A；5)向步骤3)的明胶溶液中按酶与底物比IgIOOOOg加胰蛋白酶0.003g，置于37°C恒温水浴中酶解3h，3h后立即升温至80°C以上，保持lOmin，使胰蛋白酶失活。取出放置至室温，离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，上清液即为胶原蛋白溶液；6)取步骤5)中胶原蛋白溶液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，水解后胶原蛋白保留时间约为21min，结果见图1中C；7)将步骤5)胶原蛋白溶液浓缩至100ml，放置至室温，用0.45μm滤膜过滤，滤液冻干，即得胶原蛋白粉，收率为72.15%(以绝干重计)，胶原蛋白含量为63.36%(质量百分比)。实施例31)取新鲜鹿筋去脂肪、皮、筋膜后，切成0.5-lcm3的小块，用0.9%的生理盐水反复清洗去除血清和脂肪，再用蒸馏水冲洗干净，置_20°C冰箱中保存，含水率约为65%；2)取上述处理好的鲜鹿筋30g，按料液比Ig15ml加0.8%体积浓度的盐酸溶液置4°C冰箱中60h，使鹿筋吸收酸水而发生酸膨胀，60h后取出鹿筋置于100°C沸水中，至鹿筋全部溶解，所用时间为32min，然后用夹有脱脂棉的纱布过滤，将滤液离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，保留上清液；3)向步骤2)明胶溶液中加入IMKOH溶液调pH至7.0，离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，保留上清液，即得明胶溶液；4)取步骤3)的明胶溶液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，明胶溶液保留时间约为12min，结果见图1中A；5)向步骤3)的明胶溶液中按酶与底物比Ig30000g加胰蛋白酶，置于37°C恒温水浴中酶解3h，3h后立即升温至80°C以上，保持lOmin，使胰蛋白酶失活。取出放置至室温，离心(12000rpm/min、30min)，弃掉沉淀，上清液即为胶原蛋白溶液；6)取步骤5)的胶原蛋白溶液200μ1，0.45μm滤膜过滤，取20μ1滤液进样，记录高效液相凝胶色谱图，水解后胶原蛋白保留时间约为21min，结果见图1中D；7)将步骤5)的胶原蛋白溶液浓缩至100ml，放置至室温，用0.45μm滤膜过滤，滤液冻干，即得胶原蛋白粉，收率为78.56%(以绝干重计)，胶原蛋白含量为68.47%(质量百分比)。权利要求一种鹿筋胶原蛋白的制备方法，其步骤如下1)取新鲜鹿筋去脂肪、皮、筋膜后，切成0.5～1cm3的小块，用浓度为0.9％的生理盐水反复清洗去除血清和脂肪，再用蒸馏水冲洗干净，置于-20℃冰箱中保存，含水率为63～68％；2)取上述处理好的鲜鹿筋，加入盐酸溶液，然后置于4℃冰箱中浸泡12h～60h，鹿筋吸收酸水而发生酸膨胀，将膨胀好的鹿筋取出置于100℃沸水中，至鹿筋全部溶解，然后用夹有脱脂棉的纱布过滤，弃掉残渣；将滤出液离心后弃掉沉淀得上清液，此上清液即为明胶溶液；3)调节反应体系的pH为6.5～7.5，离心后弃掉沉淀，保留上清液；4)向步骤3)的上清液中加胰蛋白酶，然后置于37℃恒温水浴箱中，酶解0.5～3h后立即升温至80～100℃，保温10～15min，使胰蛋白酶失活；上清液取出放置至室温，离心后弃掉沉淀，即得胶原蛋白溶液；5)将步骤4)的胶原蛋白溶液加热浓缩，然后放置至室温，用0.2μm～0.45μm滤膜过滤，将滤液冻干，即得胶原蛋白粉。2.如权利要求1所述的鹿筋胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤2)中是按料液比Ig5mlIg15ml的比例在鲜鹿筋中加入盐酸溶液。3.如权利要求1所述的鹿筋胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤2)中加入盐酸溶液的体积浓度为0.05%1.0%。4.如权利要求1所述的鹿筋胶原蛋白的制备方法，其特征在于是在1200015000rpm/min条件下离心IOmin45min。5.如权利要求1所述的鹿筋胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤3)中是向明胶溶液中加入NaOH、KOH、CaO或Na2CO3溶液调节反应体系的pH为6.57.5。6.如权利要求1所述的鹿筋胶原蛋白的制备方法，其特征在于步骤4)中胰蛋白酶与鲜鹿筋的用量比为Ig5000gIg50000g。全文摘要本发明属于胶原蛋白提取
技术领域：
，涉及采用盐酸水解和胰蛋白酶酶解的提取纯化工艺制备鹿筋胶原蛋白的方法。其是将鹿筋去脂肪，皮，筋膜后，切成0.5～1cm3的小块，然后用生理盐水反复清洗去除血清和脂肪，再用蒸馏水冲洗干净后，按料液比1g∶5m/～1g∶15ml的比例加入0.05％～1.0％体积浓度的盐酸浸泡12h～60h，然后将鹿筋置于100℃沸水中至鹿筋全部溶解，离心，上清用碱性溶液调至中性，加入胰蛋白酶酶解后离心，酶与底物比为1g∶5000g～1g∶50000g，上清液浓缩后0.2～0.45um滤膜过滤，滤液真空冻干，得到胶原蛋白粉。本发明工艺简单易操作，实验结果稳定，可适用于工业大生产。文档编号C07K1/12GK101805775SQ20101014357公开日2010年8月18日申请日期2010年4月12日优先权日2010年4月12日发明者张鹤,徐云凤,惠歌,赵雨申请人:赵雨