专利名称：一种奥曲肽粗品的固相制备方法
技术领域：
本发明涉及医药多肽类原料药的化学合成，尤其涉及ー种奥曲肽粗品的固相制备方法。
背景技术：
奥曲肽(octrotide)，它是由8个氨基酸组成的多肽，主要药物作用有可抑制生长激素、促甲状腺激素、胃肠道和胰腺内分泌激素的病理性分泌过多；可选择性地减少门静脉及其侧枝循环血流量和压カ；降低食管胃底静脉的压カ；抑制胰高糖素的分泌和拮抗胰高糖素对内脏血管的扩张作用，而对全身血液动力学影响小；可抑制胆囊的排空，抑制 胆囊收缩素，促胰液素的分泌，減少胰酶的损伤作用；对0(1ぉ括约肌具有松弛作用，有利于胰液的排泄。可抑制胃酸-胃蛋白酶和胃泌素的分泌，可改善胃粘膜血液供给；可抑制胃肠蠕动。用于门脉高压所致的食管及胃底静脉破坏出血；应激性溃疡及消化性溃疡所致出血；预防和治疗急性胰腺炎及其并发症；治疗胰瘘和胃肠道瘘管，以及其他突眼性甲状腺肿、肢端肥大症、特发性假性肠梗阻。目前奥曲肽的合成方法有固相法和固液相法如专利US. pat. no. 49354031983报道了一种液相制备奥曲肽的方法，该方法采用两个片段，在液相中缩合，用三氟こ酸硼酸作为氧化剂环化支链肽。专利US6987167B2采用液相方法，采用Fmoc-Cys(AcM)-OH为某一原料，一步采用NaBH4方法脱除保护剂并环化，本步骤收率达80%以上。专利US6476186B1采用Fmoc-Thr (ol) (tBu) -2-CTC树脂为原料，固相合成八肽。专利200510029221. 2采用了固相合成法，用2_氯-三苯甲基树脂为原料，按照固相合成的方法一次连接保护氨基酸，获得保护八肽树脂，切割后，在PH7-11条件下用空气氧化，得到粗品。专利200510024502. 9采用固相合成方法，使用氯甲基树脂作载体，首先用氢化钠溶液及2-羟甲基-3，4_ ニ氢吡喃在ニ甲こ酰胺中室温与氯甲基树脂反应，得到3，4_ ニ氢吡喃羟甲基树脂(DHP HM Resin)，再在对甲苯磺酸吡啶盐作用下将芴甲氧羰基-(0-叔丁醚)苏氨醇(Fmoc-Thr (tBu)-ol)连到DHP HMResin上去，然后按照Fmoc/tBu固相多肽合成的方法将氨基酸逐个连上，最后用三氟醋酸水苯甲硫醚こニ硫醇的混合溶液将肽从树脂上切下，得到的粗品，粗品采用空气氧化法氧化形成硫硫键，经制备HPLC纯化冷冻得到奥曲肽。专利20051002874. I采用固相合成方法，包括步骤如下1)用固相合成法合成具有D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr氨基酸残基序列的直链八肽；2)氧化直链八肽，得到氧化型奥曲肽；3)将氧化型奥曲肽在醋酸盐溶液中经转盐和纯化后，得到醋酸奥曲肽。本发明的醋酸奥曲肽的制备方法中，全部采用DMF，H0BT/HBTU和DIEA进行接肽反应。可见现有技术中存在步骤繁琐，收率低，成本高等缺陷。
因此，本领域迫切需要提供一种有效、简便的固相合成奥曲肽粗品的制备方法。
发明内容
本发明g在提供一种固相合成奥曲肽粗品的制备方法。本发明提供了ー种奥曲肽粗品的固相制备方法，依次连接具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸，获得保护的八肽树脂，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得奥曲肽粗品，所述方法依次包括如下步骤(a)获得 Fmoc-Thr-树脂；(b)在上述的树脂中，加入脱保护剂进行处理后，将具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸、缩合剂和含有步骤(a)获得的树脂的溶液混合，进行接肽反应，然后再加入脱保护剂 处理，再将具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸、缩合剂和含有经过接肽反应获得的多肽树脂的溶液混合，进行接肽反应，如此重复，获得Fmoc或Boc-D-Phe1-Cys2 (Trt) -Phe3-D-Trp4 (Boc) -Lys5 (Boc) -Thr6 (tBu) -Cys7 (Trt) -Thr8-OL-树脂；所说的具有Fmoc保护基团的氨基酸，依次为(I) Fmoc-Thr-OL、(2)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(3)Fmoc-Thr(tBu)-OH> (4)Fmoc-Lys(Boc)-OH 或 Fmoc-Lys(Dde) -OH>(5)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH>(6)Fmoc-Phe-OH、(7)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(8) Fmoc 或 Boc-D-Phe-OH。在另ー优选例中，连接7位残基的Fmoc-Cys (Trt) -OH前进行的脱保护处理次数是连接其它氨基酸残基前的1-2倍。在另ー优选例中，连接7位或2位残基的Fmoc-Cys(Trt)-OH时，缩合剂包括HOBt和 DIC0在另ー优选例中，1-5倍量的Fmoc-Cys (Trt)-OH, 1-5倍量的HOBt, 1-5倍量的DIC试剂，溶解在4-8ml/g树脂的DMF溶剂中的混合溶液，在0 — 40°C反应30-60分钟后，再次加入1-5倍量的DIC试剂，在15 — 30°C反应3-10个小时。在另ー优选例中，依次连接6至3位残基的Fmoc-Thr (tBu)-0H、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-D-Trp (Boc)-OH 和 Fmoc-Phe-OH 时，或连接 I 位残基的 Fmoc 或Boc-D-Phe-OH 时，缩合剂包括 HOBt、DIEA 和 HBTU。在另ー优选例中，1-5倍量的Fmoc或Boc保护氨基酸，1_5倍量的HOBt，1-5倍量的DIEA试剂，溶解在4-8ml/g树脂的DMF溶剂中，然后再加入1_5倍量的HBTU，15 一 30°C反应3-10个小时。在另ー优选例中，所述步骤(a)为1-5倍量的Fmoc-Thr, 1-5倍量的四叔丁基硝酸铵，1-5倍量的无水吡啶，溶解在4-8ml/g树脂的无水DCM溶剂中；加入到装有固相合成树月旨(替代率0. 3-1. OmmoI/g)的反应釜中，15_30°C反应3-5小时。在另ー优选例中，所述步骤(a)为1-5倍量的Fmoc-Cys (Trt)-Thr-Ol, 1_5倍量的四叔丁基硝酸铵，1-5倍量的无水吡啶，溶解在4-8ml/g树脂的无水DCM溶剂中；加入到装有固相合成树脂(替代率0. 3-1. OmmoI/g)的反应釜中，15_30°C反应3_5小吋。在另ー优选例中，所述固相合成树脂选自三苯甲基氯树脂，4-甲基三苯甲基氯树脂或氨基-2-氯三苯甲基树脂；更佳地，所述固相合成树脂是2-CTC树脂。据此，本发明提供了一种有效、简便的固相合成奥曲肽粗品的制备方法。
图I显示了实施例I制备获得的奥曲肽粗品I的质谱图。图2显示了实施例I制备获得的奥曲肽粗品I的高效液相色谱图。图3显示了实施例2制备获得的奥曲肽粗品2的质谱图。
图4显示了实施例2制备获得的奥曲肽粗品2的高效液相色谱图。图5显示了实施例3制备获得的奥曲肽粗品3的质谱图。图6显示了实施例3制备获得的奥曲肽粗品3的高效液相色谱图。
具体实施例方式发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现采用Fmoc-Thr-01为原料直接合成第一个氨基酸，或采用ニ肽进行树脂装载，減少了采用苏氨酸为原料的还原过程，或保护苏氨酸的去保护基的过程，步骤简単，收率提高。另外，如果对个别氨基酸采用特殊的合成方法，減少了単一合成方法对个别氨基酸产生过多副反应的影响。I.具体地,7#Cys的合成延长脱保护的时间，避免Fmoc脱去不完全,造成最终粗品序列少ー个Cys。2#Cys的合成采用DIC作为缩合剂，可以避免Cys缩合过程中消旋。本发明中所使用的缩写或英文全称的含义列于下表
Fmoc 9荷甲氧裁基 DMFN，N-二甲基甲酰胺
DCMニ氯甲烷
HOBtI 一羟基苯并三唑
IffiTU 苯并三唑四甲基脲四氟硼酸^
DICN，N' -ニ异丙基碳ニ亚胺
DIEA ニ异丙基乙胺 TFA三氟乙酸
Boc叔丁氧羰基
tBu叔]基，-C(CH3)权利要求
1.一种奥曲肽粗品的固相制备方法，依次连接具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸，获得保护的八肽树脂，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得奥曲肽粗品，其特征在于，依次包括如下步骤 (a)获得Fmoc-Thr-树脂； (b)在上述的树脂中，加入脱保护剂进行处理后，将具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸、缩合剂和含有步骤(a)获得的树脂的溶液混合，进行接肽反应，然后再加入脱保护剂处理，再将具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸、缩合剂和含有经过接肽反应获得的多肽树脂的溶液混合，进行接肽反应，如此重复，获得Fmoc或Boc-D-Phe1-Cys2 (Trt) -Phe3-D-Trp4 (Boc) -Lys5 (Boc) -Thr6 (tBu) -Cys7 (Trt) -Thr8-OL-树脂； 所说的具有Fmoc保护基团的氨基酸，依次为(1)Fmoc-Thr-OL、(2)Fmoc-Cys(Trt)-OH或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(3)Fmoc-Thr(tBu)-OH>(4)Fmoc-Lys(Boc)-OH 或 Fmoc-Lys(Dde) -OH>(5)Fmoc-D-Trp(Boc)-OH>(6)Fmoc-Phe-OH、(7)Fmoc-Cys(Trt)-OH 或 Fmoc-Cys(Acm)-OH>(8)Fmoc或 Boc-D-Phe-OH。
2.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，连接7位残基的Fmoc-Cys(Trt) -OH前进行的脱保护处理次数是连接其它氨基酸残基前的1-2倍。
3.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，连接7位或2位残基的Fmoc-Cys (Trt) -OH 时，缩合剂包括 HOBt 和 DIC。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，1-5倍量的Fmoc-Cys(Trt) -OH, 1-5倍量的HOBt，1-5倍量的DIC试剂，溶解在4-8ml/g树脂的DMF溶剂中的混合溶液，在O — 40°C反应30-60分钟后，再次加入1-5倍量的DIC试剂，在15 — 30°C反应3_10个小时。
5.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，依次连接6至3位残基的Fmoc-Thr (tBu) -OH> Fmoc-Lys (Boc) -OH> Fmoc-D-Trp (Boc) -OH 和 Fmoc-Phe-ΟΗ 时，或连接 I位残基的Fmoc或Boc-D-Phe-OH时，缩合剂包括HOBt、DIEA和HBTU。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，1-5倍量的Fmoc或Boc保护氨基酸，1-5倍量的HOBt，1-5倍量的DIEA试剂，溶解在4_8ml/g树脂的DMF溶剂中，然后再加入1_5倍量的HBTU，15 - 30°C反应3-10个小时。
7.如权利要求I所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)为1-5倍量的Fmoc-Thr, 1-5倍量的四叔丁基硝酸铵，1_5倍量的无水吡啶，溶解在4_8ml/g树脂的无水DCM溶剂中；加入到装有固相合成树脂(替代率O. 3-1. Ommol/g)的反应釜中，15_30°C反应3-5小时。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)为1-5倍量的Fmoc-Cys (Trt) -Thr-Ol, 1-5倍量的四叔丁基硝酸铵，1-5倍量的无水吡啶，溶解在4_8ml/g树脂的无水DCM溶剂中；加入到装有固相合成树脂(替代率O. 3-1. Ommol/g)的反应釜中，15-30°C反应3-5小时。
9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于，所述固相合成树脂选自三苯甲基氯树脂，4-甲基三苯甲基氯树脂或氨基-2-氯三苯甲基树脂。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述固相合成树脂是2-CTC树脂。
全文摘要
本发明公开了一种奥曲肽粗品的固相制备方法。所述方法依次连接具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸，获得保护的八肽树脂，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得奥曲肽粗品，依次包括如下步骤(a)获得Fmoc-Thr-树脂；(b)在上述的树脂中，加入脱保护剂进行处理后，将具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸、缩合剂和含有步骤(a)获得的树脂的溶液混合，进行接肽反应，然后再加入脱保护剂处理，再将具有Fmoc或Boc保护基团的氨基酸、缩合剂和含有经过接肽反应获得的多肽树脂的溶液混合，进行接肽反应，如此重复，获得Fmoc或Boc-D-Phe1-Cys2(Trt)-Phe3-D-Trp4(Boc)-Lys5(Boc)-Thr6(tBu)-Cys7(Trt)-Thr8-OL-树脂。
文档编号C07K7/06GK102850438SQ201210352668
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者白俊才, 张若平, 张国庆 申请人:上海昂博生物技术有限公司