从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的方法、肽和检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的方法、肽和检测试剂盒。为此，根据本发明，使用了至少两种肽单元，其中至少一种肽单元包括非来源于丝聚蛋白(原)，纤维蛋白，纤维蛋白原，波形纤维蛋白，细胞角蛋白1和细胞角蛋白9的部分，并且所述肽单元包括XG基序，以及一种肽单元包括XnonG基序，其中X为瓜氨酸或其类似物，而nonG为除甘氨酸之外的氨基酸。
【专利说明】从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的方法、肽和检测试剂盒
[0001]本申请是申请日为2002年12月11日、发明名称为“从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的方法、肽和检测试剂盒”的中国发明专利申请N0.02824647.0的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种通过使用包含瓜氨酸残基或其类似物的肽来从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的方法。
【背景技术】
[0003]该方法由国际专利申请PCT / NL97 / 00624已知。该文献中描述了来源于丝聚蛋白的，包含瓜氨酸或其类似物的肽用于从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的应用。因此，所用的肽适于诊断应用，并且与当时采用的方法相比，使更可靠的检测成为可能。更特别的，该方法能降低假阳性率，也就是具有更高的特异性。此外，其敏感性也相对较高。一种被称为cfcl的肽，被36%的来自患有类风湿性关节炎的患者的血清识别。该肽的环状变异体表现出被更好地识别(63% )。
[0004]前言所述的方法还由国际专利申请PCT / FROO / 01857已知。该文献中描述了来源于纤维蛋白或纤维蛋白原的，包含瓜氨酸或其类似物的肽用于从患有类风湿性关节炎的患者中检测自身抗体的应用。
[0005]PCT / EP98 / 07714中描述了来源于丝聚蛋白(原)的合成肽在诊断类风湿性关节炎中的应用。该申请中还记载了来源于人波形纤维蛋白，细胞角蛋白1，细胞角蛋白9以及其他中间纤丝蛋白的合成`肽。
[0006]然而，上述提到的方法仍只能从全部类风湿性关节炎患者中检测出有限数目的患者。因此，强烈需要一种可实现敏感性增加而同时保持实质上相等或甚至提高的特异性的方法。
【发明内容】
[0007]为了达到该目的，本发明提供了一种如前言所述的方法，该方法的特征在于所述的自身抗体与含有XG基序的妝单兀和含有XnonG基序的妝单兀接触，其中X为瓜氣酸残基或其类似物，G为甘氨酸，而nonG为除甘氨酸以外的氨基酸。
[0008]下述实验显示，获自患有类风湿性关节炎的患者的血清中含有两种不同的抗体群。其中一群抗体与诸如上文提到的已出版文献中公开的XG肽单元反应。该群抗体可通过已公开的XG肽单元部分地检测到，当采用本发明所述的肽单元时，则能检测到更大部分的该群抗体。另一群抗体与XnonG肽单元反应。直到目前为止，在已出版的文献中还没有观察到这群抗体。如下文更详细的记载,来自于患有类风湿性关节炎患者的大多数血清都含有这两群抗体。因此，这些血清可以通过包括XG或XnonG肽单元的诊断测试来检测。然而看来似乎相当大一部分患有类风湿性关节炎的患者的血清只含有两群抗体中的一种。因此，采用上述已出版公开的文献中描述的诊断测试，无法检测或仅能检测极小一部分的仅含有对XnonG肽单元的抗体的血清。如今,如果诊断测试中包括XnonG肽单元,则可以检测大部分的这类血清。因而本发明所述的改进诊断方法包括至少一种XG和一种XnonG肽。因此与已出版公开文献中记载的测试相比，本发明所述的诊断测试可达到20%更为敏感。
[0009]当所述的具有XnonG基序的肽单元包括一非来源于天然蛋白如人类丝聚蛋白(原)，纤维蛋白，或纤维蛋白原，以及相关的蛋白波形纤维蛋白，及细胞角蛋白I和细胞角蛋白9，或其他相关的中间纤丝蛋白的部分时，可以获得特别好的结果。
[0010]令人惊奇的是，结果显示，当将该非来源于天然蛋白的XnonG肽与本发明所述的XG肽组合时，可得到一更加改进的诊断方法。更特别的，这种肽单元组合在本发明所述的方法中的应用提供了一种敏感性非常高，且保持优异的特异性的诊断方法。由于上述提到的公开文献仍然是基于下述观念，即来自于RA患者的自身抗体与来源于天然存在的蛋白，例如丝聚蛋白(原)，纤维蛋白，纤维蛋白原，波形纤维蛋白，细胞角蛋白I或细胞角蛋白9的肽特别好地发生反应，因此这就更让人惊讶了。例如，PCT / EP98 / 07714中记载了一种丝聚蛋白来源的XnonG肽(IPG1249)。它与3.3%的SLE患者血清交叉反应，且与丝聚蛋白有82%的同源性。
[0011]当所述的具有XnonG基序的肽单元包含一种三肽时，则可获得较好的结果，其中三肽的中间氨基酸为瓜氨酸或其类似物，其优选选自ΧΧΚ，ΧΧΥ, KXI, MXR, RXY, WXK, MXH,VXK, NXR, WXS, RXff, YXM, IXX, XXF, RXH, TXV, PXH, AXF, FXR, YXF, LXM, LXY, YXP, HXS 和 PXW。
[0012]优选的，nonG为选自H，I，W，S，R，K，Y，M，F，V，P，Cit或其类似物的氨基酸。如下述实验所示，这类XnonG肽单元非常有效。
[0013]包括XG基序的肽单元，可来源于或不来源于丝聚蛋白(原)，纤维蛋白，纤维蛋白原，波形纤维蛋白，细胞角蛋白I或细胞角蛋白9，并且有效地是由PCT / NL97 / 00624中已知的Cf Cl。
[0014]在本文的上下文中，术语氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，和具有D-构型或L-构型的氨基酸。
[0015]在本申请中，非天然氨基酸应理解为该类的氨基酸存在于反-倒位肽，反向肽，其中侧链位于肽骨架的酰胺氮原子上的肽，和其中肽骨架上的CO被2，3或优选单一 -CH2-基团所替代的肽(假肽)中。
[0016]氨基酸还可被修饰。例如，羧酸基团可以被酯化或可被转化为酰胺，同时氨基基团可被烷基化，例如，甲基化。可选的，肽上的功能基团可以提供有保护基团或标记(例如荧光或放射性标记)。肽中的氨基基团和羧酸基团可以以通过使用酸或碱而形成的盐的形式存在。如果采用合成肽，则很容易制备可以使用的本发明范围内的所有种类的变异体。例如，芳族侧链基团，如来源于苯丙氨酸和酪氨酸，可被一个或多个卤素原子卤化。肽模拟(peptidomimetic)和有机模拟(organomimetic)的实施方案也落在本发明的范围内，及其在本发明所述方法中的应用。还可采用其类似物来代替Cit残基，例如那些在图1中列出的氨基酸形式的类似物。这种类似物及其制备方法为本领域的普通技术人员所公知。例如，Sonke et al.在 Stereoselective Biocatalysis (2000), pp.23-58 中有记载，以及在Greene !Protective groups in Organic synthesis(Wiley, New Yorkl999)中。[0017]依照有利的实施方案，所述的瓜氨酸类似物的侧链具有如下通式(I):
[0018]
【权利要求】
1.根据如下通式的肽序列:
(A1-A2-A3-A4-A5)-Cit-(A6)-(A7-A8-A9-A10-A1I)， 其中， a.A1-A2-A3-A4-A5 为选自如下组的氨基酸序列:RHGRQ, IRCitYK, HGRQCit,GRQCitCit, FQMCitH, CitffRGM, ARFQM, QCitYKff, KPYTV, RNLRL, RRRCitY, RFKSN, RGKSN,RffVSQ, MKPRY, KSFVff, YSFVff, FQMRH, RNMNR, RMGRP，及其同源序列；和其中 b.A6表示除甘氨酸以外的氨基酸；和其中 c.A7-A8-A9-A10-A11表示选自如下组的氨基酸序列:KYIIY, TNRKF，KWCitKI，CitRAVI, RCitGHS, CitGRSR, CitYIIY, CitRLIR, IERKR, FMRKP, FMRRP, ERNHA, AVITA, TPNRW,TYNRff, RTPTR, RIVVV, HARPR, RGMCitR, IRFPV，及其同源序列。
2.根据如下通式的肽序列:
(Β1-Β2-Β3-Β4-Β5-Β6) -Cit-(Β7)-(Β8-Β9-Β10-Β11) 其中， a.B1-B2-B3-B4-B5-B6 为选自如下组的氨基酸序列:INCitRAS，ICitKRLY,KCitCitYNI， RLYFICit, IR QGAR, CitERCitVQ, CitHQRIT, RICitRVCit, GRNQRY, RCitRQHP,CitCitRCitVA, RPKQHV, RKCitGCitR, RCitCitRNT, RCitQCitFT, QLVYLQ, QYNRFK-CitLRHIR,PRCitCitCitK,RCitQVRY, GRCitHAH,ARHVIR,RCitGHMF,GRNIRV,QIFYLCit,RQGPIA,GVYLVR,NCitCitRRV, KCitRLCitY, GRRCitCitL, RMPHCitH，及其同源序列；和其中 b.B7表示除甘氨酸以外的氨基酸；和其中 c.B8-B9-B10-B11 表示选自如下组的氨基酸序列:CitHRR，CitIRR, FRRN, AQTT, GYPK,RPPQ, GCitRK, PIPR, YTIH, RIKA, CitRVR, TRRP，TIRP，IKCitR, RNVV, CitRRY, CitRPR,TRCitCit, CitCitGR, LCitRCit, RVRCit, VPRT, YCitFR, ARCitCit, RQCitR, HIRR, CitMMR,CitRICit, VRKS, PCitCitR, CitRRK，及其同源序列。
3.根据权利要求1或2的肽序列，其特征在于A6或B7选自CU，H，I，K，R，S，W，Y，M，F，V 和 P。
4.根据权利要求1-3的肽序列，其选自如下的组:
5.根据如下通式的肽序列: (C1-C2)-(C3-C4-C5)-Cit-G_C6-(C7-C8-C9—C10) (IV) 其中
a.C1-C2 为 HQ, GF, EG 或 GV ;和其中 b.C3-C4-C5表示3个氨基酸，其中至少I个为碱性，芳族，或V ;和其中 c.C6等于碱性或芳族氨基酸，或等于A，G，E，P，V，S或Cit或其类似物；且其中 d.C7-C8-C9-C10 为 SRAA，SCitAA, RPLD, RVVE 或 PGLD，或其类似物。
6.含有如下通式的肽序列:(D1-D2-D3-D4-D5-D6)， 其中:
a.Dl 是 K，R 或 W，
b.D2 是 R 或 W，
c.D3 是 R，
d.D4 是 Cit， e.D5是G，和
f.D6 是 R，W 或 K。
7.根据权利要求1-6的肽序列，其中所述的肽是环状的。
8.多肽,其含有至少一个根据权利要求1-7的肽序列。
9.根据权利要求8的多肽，其含有至少一个根据权利要求1或2的肽序列和至少一个根据权利要求5或6的肽序列。
10.根据权利要求8或9的多肽，其中所述多肽是环状的。
11.用于测定来自患有类风湿性关节炎的患者的自身抗体的存在的离体诊断试剂盒，其含有根据权利要求ι-?ο的肽或多肽。
12.根据权利要求11的诊断试剂盒，其是ELISA试剂盒。
【文档编号】C07K14/47GK103524603SQ201310482892
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2002年12月11日 优先权日:2001年12月11日
【发明者】W·J·W·范文卢伊, J·W·德里夫休特, M·A·M·范伯克尔, G·J·M·普卢伊恩 申请人:技术科学基金会