明胶样单元的用途
【专利摘要】本发明涉及明胶样单元的用途，提供了一类新型重组融合蛋白，其基本结构为｛GLK｝p-R-｛GLK｝q，其中R是有生物学功能的蛋白或多肽，GLK为重组明胶样蛋白(gelatin-like?protein，GLK)，具有(Gly-X-Y)n明胶结构特征的蛋白序列。与未融合有GLK片段的原始蛋白/多肽相比较，这类重组明胶样融合蛋白具有更高的亲水性，在体内具有更长的半衰期。本发明也包括编码该融合蛋白的核苷酸序列，含核苷酸序列的表达载体，转化有该类载体的宿主细胞以及制备本发明所涉及的融合蛋白的方法。此外，还包含含有该类融合蛋白的药用组合物以及用于治疗、预防或缓解疾病的方法。
【专利说明】明胶样单元的用途
[0001]本发明是申请号为200980103870.9的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及蛋白质领域，更具体地，涉及一类新型的、具有生物活性和更长半衰期的重组融合蛋白及其制备和应用。
【背景技术】
[0003]由于肾脏和肝脏以及降解等多种因素的作用，大部分临床应用的生物活性多肽/蛋白在体内经常快速的被清除，一般半衰期只有几分钟到几个小时。在治疗过程中，需要很大的量以及频繁的注射来获得保持有效的药物浓度，不仅给病人带来痛苦，而且因为血药浓度波动带来疗效下降，毒副作用增加。
[0004]目前已经有多种方法报道可以延长这些生物活性多肽/蛋白在体内的半衰期。如利用水溶性高分子聚合物(例如:聚乙二醇，葡聚糖等)来修饰生物活性多肽/蛋白，并已经成功应用，如PEG-ADA，PEG-1FNa等。修饰后可以提高体内半衰期，增加稳定性和溶解度，降低免疫原性等。但是不幸的是这些修饰方法仍然存在很多问题。首先，化学修饰蛋白质/多肽后一般均会使这些生物大分子的活性显著下降甚至完全消失(VeroneseFM, Biomaterials, 22:405-417, 2001)。其次，高分子化合物都是与蛋白质/多肽表面的氨基、巯基、咪唑基等基团反应，以共价键形式连接到蛋白质/多肽分子上。但是，由于蛋白质/多肽分子量巨大，结构复杂，因此其潜在的可与活性PEG反应的基团也是数目众多。在不同的位点结合PEG，其产物的稳定性，生物学活性等性质都是不同的。更甚者，大部分化学合成的高聚物，如PEG等不能被生物体降解。例如，已经发现当长期大剂量注射 PEG-干扰素(PEG-1FNa 2a)后会在肾脏中积累(Conover CD et al., ArtificialOrgans., 21:369-378, 1997 ；Bendele A et al., Toxicol Sc1.，42:152-157，1998)。从药物设计角度而言，没有这些积累的药物显然是更为安全的。另一方面，已经发现PEG修饰的蛋白能产生一种PEG抗体(被定义为多效半抗原)，从而影响药物的半衰期(CalicetiP&Veronese FM, Adv Drug Deliv Rev.，55:1261-1277，2003)。
[0005]正是因为这些技术问题，虽然通过化学修饰的方法来改善蛋白质/多肽体内药代特性的技术已经面世很久，但是真正能在临床中应用的产品极少。
[0006]也有通过与一些特定的载体蛋白融合来增加生物活性多肽/蛋白的体外稳定性或体内半衰期的方法。如通过与白蛋白，抗体Fc片段，转铁蛋白(转铁蛋白突变体及其片段)融合来延长生物活性多肽/蛋白的半衰期，如美国专利5，876，969和5，766，88及7，176，278所述。之所以与这些蛋白质融合后能延长半衰期，主要是这些蛋白质都可以通过FcRn受体介导的循环作用，来提高其自身在体内的稳定性从而延长半衰期。理想的作为融合蛋白载体的蛋白质应该具备如下特征:1.自身在体内具有较长的半衰期；2.不具有免疫原性；3.不具有任何与延长半衰期无关的生物学效应；4.不影响治疗蛋白的生物学活性。但是，目前已经公开的技术方案都无法全部满足以上要求。其存在的首要问题是免疫原性的增加，如Fc片段结构本身并不保守，具有多种序列结构，很容易产生免疫原性。另外，这些载体蛋白本身通常具有一些生物学效应，如抗体片段Fc具有结合补体，与Fc受体结合后导致的变态反应，调理吞噬，抗体依赖的细胞杀伤作用等广泛的生理功能；HSA本身具有许多正常的体内生理功能，参与许多物质的运输和代谢。这些生物学特性的存在，对于作为融合蛋白载体来说都是不利的。而且，这些载体蛋白质本身具有复杂的空间结构，与活性蛋白融合后都会因为空间位阻效应而使活性蛋白生物学活性显著下降(Baggio LL et al.，Diabetes.，53:2492-2500，2004;Huang YS et al., Eur J PharmBiopharm., 67:301 - 308, 2007)。
[0007]综上所述，现有改善活性蛋白体内半衰期的方案存在如下弊端:1.产物不均一，工艺要求复杂；2.修饰物不被生物体降解，会在体内蓄积；3.增加了免疫原性；4.导致蛋白生物学活性显著下降甚至完全丧失；5.有可能引入了本身不需要的生物学活性功能。无论化学修饰，还是通过蛋白融合来改变活性蛋白体内外半衰期的方案，都无法完全避免上述弊端。
[0008]为了避免白蛋白，Fc片段这些天然载体蛋白存在的弊端，也进行了人工构建氨基酸序列作为载体蛋白的尝试，如构建富含Gly，Glu的氨基酸聚合物，将其作为融合载体来延长蛋白药物半衰期，David ff.Leung等模仿化学合成的聚谷氨酸，人工合成聚谷氨酸序列用于作为融合载体来延长蛋白药物半衰期(US20080176288)，或者人工合成多聚甘氨酸序列作为融合载体，(Schlapschy M et al., Protein Eng Des Sel.，20:273-284，2007),也有完全人工设计，选取一些亲水性氨基酸，如Gly，Asp, Glu, Ser等人工构建氨基酸聚合物，将其作为融合载体来延长蛋白药物半衰期。但是这些完全重新设计的氨基酸聚合物作为融合载体实际效果很难预测，存在诸多问题。例如，1:人工设计的序列，虽然理论上含有很多亲水性氨基酸，但是鉴于蛋白质结构与功能之间关系的复杂性，现有技术上很难预测完全人工设计序列的空间结构(如二级结构，三级结构等)，因此其潜在的生物学功能和免疫原性是未知的；2人工设计重复序列不同于天然进化所产生的蛋白序列，特别是那些重复序列极高的片段，很难进行重组表达，实际表达量往往极低而无法实际应用。发明人曾按照David W.Leung等(US20080176288)提供的方法通过重组表达聚谷氨酸用于作为融合载体来延长蛋白药物，但是实际上按其所提供的方法，根本无法表达获得其所声称的序列。
[0009]因此，本领域迫切需要开发一种有效简便地改善蛋白质/多肽的体内外稳定性，且无或几乎无其他副作用的技术方案。
【发明内容】
[0010]本发明的目的就是提供一种有效简便地改善蛋白质/多肽的体内半衰期的方法，与现有技术相比较，该方法具有更多的优势。 [0011]在本发明的第一方面，提供了一种可用于延长蛋白体内半衰期的重组的明胶样单元，所述的明胶样单元是结构如下的多肽:
[0012](Gly-X-Y)n
[0013]式中，
[0014]Gly为甘氨酸残基；
[0015]X和Y分别为20种天然氨基酸除了 Cys之外的任意氨基酸残基；[0016]η 为 20-300;
[0017]并且，所述的明胶样单元具有以下特征:
[0018](a)所述明胶样单元中以下亲水性氨基酸Asn, Asp, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp,Arg的氨基酸百分比含量总和为40%至2/3 (66.7%)；
[0019](b)所述明胶样单元中，Pro和Hyp的数量之和与η的比值≥0.6 ；
[0020](c) Gly的数量之和与η的比值≥1.15 (更佳地≥1.05)；
[0021]附加条件是，所述的明胶单元不是天然的明胶蛋白。
[0022]在另一优选例中，所述的明胶样单元还具有以下特征:
[0023](d)等电点为3-7 (较佳地为3.2-6，更佳地为3.2-5.5)；
[0024](e)根据Kolaskar-Tongaonkar法计算平均抗原指数不高于0.98 ；
[0025](f)根据ProtParam公式计算，代表亲水性的GRAVY值小于-1.1 (较佳地小于-1.4，更佳地小于-1.5)。
[0026]在另一优选例中，所述的明胶样单元的序列来源于或衍生自明胶。例如，在X，Y位上进行取代，将部分或全部天然明胶中的疏水性氨基酸Ile，Leu，Met，Phe，Val等突变为亲水性氨基酸，优选的是突变为Ala, Asn, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg中任意一种和/或几种，使得GRAVY值小于-1.4。
[0027]在另一优选例中，所述的明胶样单元的分子量为10-100kDa。
[0028]在本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸，它编码第一方面中所述的明胶样单元。
[0029]在本发明的第三方面，提供了一种重组的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由生物活性多肽和第一方面中所述的明胶样单元融合而形成。
[0030]在另一优选例中，与不含所述明胶单元的生物活性多肽相比，所述融合蛋白在体内的半衰期至少延长1倍；更佳地，半衰期延长至少2、3、4、5、6、或10倍。
[0031]在另一优选例中，所述融合蛋白的表观分子量(分子筛测定法)与理论分子量之比≥1.25，更佳地≥1.5，最佳地≥2。
[0032]在另一优选例中，生物活性多肽的分子量为0.5-70Kda,更佳地为l_66Kda。
[0033]在另一优选例中，所述的明胶单元位于所述融合蛋白中的氨基端、羧基端、两端、或中间。
[0034]在另一优选例中，所述的融合蛋白为单体或多聚体形式。
[0035]在另一优选例中，所述融合蛋白是如式I所示的单体或其多聚体形式，
[0036](GLK)p-R- {GLK} q式 1
[0037]式中，
[0038]GLK表示如本发明第一方面中所述的明胶单元；
[0039]p和q独立地为0或1，且p和q不同时为0;
[0040]R为不含所述的明胶单元的、具有生物学功能的蛋白，且所述的R不是明胶蛋白；和
[0041]表示肽键。
[0042]在另一优选例中，所述融合蛋白内所有(Gly-X_Y)n片段包含的η总和大于20，小于 300。[0043]在另一优选例中，所述融合蛋白的分子量为20_500Kda。
[0044]在另一优选例中，所述的融合蛋白为多聚体，且式I中的各R和GLK可相同或不同。
[0045]在本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码第三方面中所述重组的融合蛋白。
[0046]在本发明的第五方面，提供了含有第四方面所述的多核苷酸的序列的表达载体。
[0047]在 本发明的第六方面，提供了一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有第五方面所述的表达载体、或者染色体中整合有第四方面所述的多核苷酸。
[0048]在本发明的第七方面，提供了一种制备所述的重组融合蛋白的方法，包括步骤:
[0049](1)培养第六方面所述的宿主细胞，从而表达所述的重组融合蛋白；和
[0050](2)分离出所述的重组融合蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0051]图1为重组明胶样融合蛋白几种典型基本结构。
[0052]图2为pPIC_GLK1164表达质粒的构建流程图。
[0053]图3为pPIC-GLK1164/G_CSF表达质粒的构建流程图。
[0054]图4为rGLK1164/G-CSF纯化过程中SDS-PAGE电泳(8%)分析，纯化最终产品为单一条带，表观分子量介于66KD-97KD之间。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker,泳道2.发酵液上清，3.SP柱洗脱峰，4.Q柱洗脱峰。
[0055]图5 为 SEC-HPLC 分析纯化的 rGLK1164/G_CSF，采用 TSK Gel G3000Swxl 柱，缓冲液为 50mM ΡΒ,Ο.25Μ NaCl, ρΗ7.0，检测波长为 214nm，流速为 0.8ml/min。
[0056]图6为反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析纯化的rGLK1164/G_CSF，RP-HPLC采用VYDAC protein C4TP5415柱，流动相A为:含0.1%TFA的水溶液，流动相B采用含0.1%TFA的9:1乙腈:水溶液，检测波长为214nm，流速为0.8ml/min。
[0057]图7为rGLK1164/G-CSF免疫印迹分析结果，所用一抗为抗G-CSF鼠多抗。
[0058]图8显示了利用rhG-CSF依赖株NSF60测定rGLK1164/G_CSF融合蛋白的体外生物学活性。
[0059]图9SEC-HPLC分析rhG-CSF和rGLK1164/G_CSF体外稳定性研究结果。
[0060]图10rGLK1164和rGLK1164/G_CSF小鼠连续注射后血清抗体检测结果。A为G-CSF包被，B为rGLK1164包被。
[0061]图 11 不同剂量 rGLK1164/G-CSF 融合蛋白，rhG_CSF，rHSA/G_CSF 和 rGLK1164 在正常成年SD大鼠体内的药效学研究结果。
[0062]图12不同剂量rGLK1164/G-CSF融合蛋白，rhG-CSF和rHSA/G-CSF在正常成年SD大鼠体内的药代动力学研究结果。
[0063]图13为pPIC_GLK1164/IFNa表达质粒的构建流程图。
[0064]图14为rGLK1164/IFN a纯化过程中SDS-PAGE电泳(8%)分析，纯化最终产品为单一条带，表观分子量约为85KD。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker，泳道2.发酵液上清，
3.Q柱洗脱峰。
[0065]图15rGLK1164/IFNa在猕猴体内药代动力学研究结果。[0066]图 16pPIC-Exendin-4/GLK1046 和 pPIC-Exendin_4/GLK1076 表达质粒的构建流程图。Exendin-4为艾塞那肽。
[0067]图17为rExendin-4/GLK1046纯化过程中SDS-PAGE电泳(10%)分析，表观分子量介于66KD-97KD之间。左起:泳道1.低分子量蛋白Marker，泳道2.发酵液上清，3.SP柱洗脱峰，4.Q柱洗脱峰。
[0068]图18利用稳定转染有GLP-1R的BHK细胞测定rExendin_4/GLK1046和rExendin-4/GLK1076融合蛋白的体外生物学活性。
[0069]图19rExendin_4/GLK1046和rExendin_4/GLK1076在正常成年称猴体内的药代动
力学研究结果。
[0070]图20pCEP4_EP0/GLK1074表达质粒的构建流程图。
[0071]图21不同剂量rEP0/GLK1074融合蛋白和rhEPO在正常BALB/c小鼠体内药效的药效学研究结果。
【具体实施方式】
[0072]本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次发现重组明胶样蛋白(gelatin like protein, GLK)及其突变体非常适合作为融合蛋白的融合载体。本发明人将明胶样单元作为融合载体，使其与活性蛋白融合后，可以显著延长生物活性多肽/蛋白在机体内的体内半衰期。在此基础上完成了本发明。
[0073]具体而言，试验表明，将明胶样单元与具有生物活性的蛋白融合表达后获得的重组明胶样融合蛋白，可以显著改善生物活性蛋白的体外稳定性，更重要的是可以明显降低融合蛋白在体内被清除的速度，改变活性蛋白在体内的药代分布，从而延长活性蛋白在体内的半衰期。
[0074]在描述本发明所涉及的蛋白质，核苷酸序列和各种方法学之前，可以理解的是本发明不局限于这些特定的方法，操作规程，细胞株，载体和试剂，因为这些是可以有所变动的。另外，在这里所使用的术语只是为了描述特定的实例，不是故意限定本发明的范围。除非特别限定，否则这里所有的技术以及使用的科学术语与本领域一般技术人员所理解的相同。本发明描述的只是一些优选的方法，设备和材料，其他一些方法和材料相似或相当于本发明中的一些描述，也可用于实践或测试本发明。
[0075]明胶样单元
[0076]如本文所用，术语“明胶样单元”、“明胶样蛋白”、或“GLK(gelatin-likeprotein) ”可互换使用。
[0077]天然明胶是来源于胶原的一类蛋白质，它是经胶原变性获得的产物，其基本结构有多个Gly-X-Y重复，结构通式为(Gly-X-Y)n，其中X和Y经常是脯氨酸和羟脯氨酸残基，而且，脯氨酸和羟脯氨酸残基的含量比例会影响其结构和熔点。X，Y位氨基酸组成的不同，会影响胶原的亲水性，等电点，二级结构，免疫原性等特性。
[0078]明胶可通过处理动物的骨头和毛皮而提取。然而，动物来源的明胶常常残存的具有侵染能力的病毒。此外，动物源性明胶施用于人还存在生物相容性的问题。
[0079]分子生物学技术发展使得利用基因重组技术获得基于人源明胶的生理特性稳定、均一性高的重组明胶成为可能。目前，已有较多关于人源的重组胶原或明胶在微生物、动物细胞或者植物中表达的报道(美国专利US.5，593，859;US.6，428，978;US.6，617，431 ；fferten MW et al.，Yeast, 15:1087-1096，1999)。利用胶原基因不同的片段可以获得具有不同生化特性的重组明胶，而众多的研究结果表明，毕赤酵母表达系统可以用来生产不同来源的具有独特生化特性的重组明胶或类明胶(Olsen D et al., Adv Drug DelivRev.，55:1547-1567，2003)。重组明胶同胶原水解获得的天然明胶一样具有稳定蛋白的作用，已被用来作为疫苗的稳定剂(US2006/0204511A1)。
[0080]在本发明中，明胶样单元指序列源自或衍生自天然明胶的且通过重组表达的多肽片段，也包含具有天然明胶扣^^^结构特征的经过突变的明胶样序列。
[0081]在本发明中，明胶样单元的长度或分子量没有特别限制。按长度计，每个明胶单元通常含60-1500个氨基酸残基，较佳地200-1000个氨基酸残基；按分子量计，每个明胶单元通常为6-150KDa，较佳地为20_80KDa。
[0082]重组明胶样融合蛋白
[0083]本发明涉及一类新型的重组明胶样融合蛋白，它由一个/数个来自于天然或人造的具有生物学功能的蛋白与明胶样单元组成，使其具有诊断/治疗/靶向作用。重组明胶样融合蛋白的基本结构是具有{GLK}p-R_ {GLK} q结构的单体或其多聚体形式。其中GLK表示明胶样单元；P和q为0或1，且p和q不同时为0 ;R为不含所述的明胶单元的、具有生物学功能的蛋白，且所述的P不是明胶蛋白；重组明胶样融合蛋白如果成为多聚体形式，则成为{GLKUp-Rf {GLK2}q- {GLK3}p-R2, {GLKl}p-R「{GLK2}q- {GLK3}p-R2_ {GLK4}q, {GLKl}p-Rr {GLK2} q- {GLK3}p_R2_ {GLK4}q- {GLK5}p-R「{GLK6 } q 等结构形式，其中Rh可以是相同的或不同的，GLK1至GLK6可以是相同的或不同的，但是至少包含一段GLK结构和一段具有生物学活性功能的蛋白/多肽单元(如&或R2)。图1显示了几种典型重组明胶样融合蛋白的结构。)
[0084]本发明是通过将一个或几个生物活性蛋白及其片段与一段或几段具有一定分子量的明胶样蛋白GLK (gelatin-like protein)融合表达来实现的。用于融合表达的GLK不具有免疫原性，在生理条件下具有极好的水溶性。根据本发明制备的重组明胶样融合蛋白，不仅体现出更好的体外稳定性和体内半衰期，而且与现有的蛋白质修饰或融合方案相比，其结构是均一的，而且出人意外地具有更高的生物学活性。并且，作为融合载体的GLK部分是生物相容的，具有无免疫原性，可被机体降解，不会在体内蓄积等优点。
[0085]在这里，“重组明胶样融合蛋白”指具有基本结构为{GLK}p-R_ {GLK} q的融合蛋白，蛋白/多肽R与(Gly-X-Y)n2间是直接通过肽键连接的。进一步的，R与GLK之间还可以通过间隔物相连。术语“间隔物”指一个或多个分子，例如氨基酸，核酸或化学分子，例如聚乙二醇(PEG)，即可以插入一个或多个组分结构域。间隔物可以用于提供需要组分之间的目标位点，以方便操作，也可以是为了利于保持活性蛋白的空间结构，或者活性蛋白与靶分子的相互作用。最适用于本发明的间隔物是短的连接肽，如一些富含Gly，Ser的短连接肽，如(GlyGlyGlyGlySer)n，n介于1-10之间；连接肽也可以采用其他目前已在广泛应用的连接妝，如 Darning Shan 所提及的妝段(Shan D et al., J Immunol., 162:6589-6595, 1999)。当然，GLK本身也可以作为一段连接肽使用。可以容易理解的是，蛋白/多肽部分还可以重复出现，从而充当一个间隔物的作用，形成如RfRfGLK，RrRrGLK-R^ GLK-& - R1；RrGLK-R2-R2,RrRrGLK-R^^`等结构。图1提供的仅是一些重组明胶样融合蛋白的典型结构，但是根据本发明的精神，并不仅限于图1的结构。
[0086]重组明胶样融合蛋白中包含的GLK是具有(Gly-X_Y)n明胶结构特征的高度重复蛋白序列，其序列可以是完全或者部分来源于天然明胶，也可以是天然明胶部分序列片段的简单重复，也可以是经过优化的具有Gly-X-Y特征的人工序列。由于不同种属间明胶序列的同源性差异较小，GLK的序列来源可以是非人源性的明胶序列，也可以是来源于人源性的明胶序列，如 David Olsen (Olsen D et al., Adv Drug Deliv Rev., 55:1547-1567, 2003)文中所提及的α1(Ι)胶原的序列片段；GLK序列可以完全是与天然序列一致的，也可以是选取其中一段天然序列，然后通过简单重复来达到本发明所需要的大小。可以选用的GLK序列来源是极其广泛的，不管是天然来源序列或者人工合成来源的具有(Gly-X_Y)n特征的明胶样序列，如US5801045，US6150081，US6428978，W001/34646A2等所涉及的明胶片段。只要是没有免疫原性，在<40°C时水相中可溶的序列均可用于重组明胶样融合蛋白的制备。[0087]进一步的，为了更好的达到本发明的效果，
【发明者】还根据如下原则在天然明胶Gly-X-Y重复单元基础上重新设计了一类重组明胶样序列:
[0088]1.尽量选取天然明胶序列中出现频率高的Gly-X-Y重复单元，如Gly-Pro-Hyp,Gly-Pro-Ala, Gly-Ala-Hyp, Gly-Glu-Lys, Gly-Pro-Lys, Gly-Glu-Hyp, Gly-Ser-Hyp, Gly-Gln-Hyp, Gly-Glu-Arg和Gly-Pro-Arg等单元将其重新组合；
[0089]2.尽量选取富含亲水性氨基酸的Gly-X-Y重复单元将其重新组合，优选的X，Y是亲水性氨基酸，更优选的，是Ala, Asn, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg中任意一种和/或几种；
[0090]3.重新设计的GLK序列中尽量不含已知的具有免疫原性的序列。根据现有公开的技术文件已经表明有免疫原性的位点，如H.Hori等报导的Ile-Pro-Gly-Glu-Phe-Gly-Leu-Pro-Gly-Pro(Hori H et al., J.Allergy Clin Immunol., 110:652-657, 2002)；
[0091]4.重新设计的GLK序列中尽量不含已知的蛋白酶作用位点的序列，如信号肽酶KEX-2位点等这类目前已知的蛋白酶作用位点。
[0092]5.重新设计的重组明胶样序列经Kolaskar-Tongaonkar法计算，平均抗原指数(Average antigenic propensity)不高于 0.98
[0093]改构后的人工序列富含亲水性氨基酸，其典型序列包括但并不限于SEQ ID N0:2,19，21 等。
[0094]重组明胶样融合蛋白{GLK}p-R_ {GLK}q中，GLK的基本结构Gly_X_Y重复单元数目(η)的大小，也就是GLK的分子量范围是可变的。为了达到本发明的目的，首先重组明胶样融合蛋白必须具有合适的分子量大小，以保证不被肾脏过滤清除。重组明胶样融合蛋白分子量是由蛋白/多肽部分R和GLK共同决定的，对于一种特定的活性重组明胶样融合蛋白，活性蛋白质R的分子量是确定的，而且数目也是确定的话，重组明胶样融合蛋白分子量是由GLK的大小和数目决定的。当蛋白/多肽R部分分子量较小的时候(如〈20KD)，为了避免重组明胶样融合蛋白被肾小球滤过，GLK的分子量应该至少在15-70KD之间，更大的分子量并不一定有利于延长重组明胶样融合蛋白在机体内的半衰期，反而不利于重组表达，而且容易被蛋白酶降解，意外的免疫原性也难以控制，因此合适的GLK分子量介于6-150KD之间，更优的是介于20-80KD之间。当R部分本来就比较大，或者可以形成二聚或多聚体，则GLK分子量范围可以进一步放宽，可以是介于lkDa-150KDa之间，例如约1000-2000Da，约2-20kDa之间，约 20_50kDa 之间，约 50_100kDa之间，约 100_150kDa 之间，约 150_200kDa 之间。
[0095]重组明胶样融合蛋白的分子量没有特别限定，通常为20_500KDa，较佳地为25-300KDa。
[0096]生物活性蛋白/多肽
[0097]“生物活性蛋白/多肽”指的是蛋白质，抗体，多肽及其片段和变异体，具有一种或者多种药理学和/或生物学活性，或靶向引导，多聚化等功能。它们可以是天然就存在的，也可以是人工构建的。“生物活性蛋白/多肽”包括酶，酶抑制剂，抗原，抗体，激素，凝血因子，干扰素，细胞因子，生长因子，分化因子，骨组织生长有关的因子，与骨质因子吸收相关的因子，趋化因子(chemotactic factors),细胞运动因子(cell motility factors),移动因子(migration factors),静止因子(cytostatic factors),杀(细)菌因子，抗真菌因子，血浆黏附分子，间质黏附分子和细胞外基质，受体配基及其片段等。
[0098]本发明所涉及的生物学活性蛋白/多肽，更特指表现出“治疗活性”的蛋白/多肽，或者“治疗上有活性”的蛋白/多肽，这种蛋白/多肽拥有一种或者更多已知的生物和/或治疗活性。这些活性与一种或更多种在这里描述的，或者其他已知的治疗蛋白相关。作为一个非限制性例子，“治疗蛋白”是指一种对于治疗，预防或者改善疾病，状况，或者机能絮乱有用的蛋白。作为一个非限制性例子，“治疗蛋白”可以是一种特异性的结合到特定细胞类型(正常(例如淋巴细胞)或者异常(例如癌细胞))并且用于将化合物(药物，或者细胞毒性剂)特异性定位于该细胞类型的蛋白。
[0099]在另外的非限制性例子中，“治疗蛋白”是指有生物活性的蛋白，特别是一种对于治疗，防止和改善疾病有用的生物活性蛋白。非限制性的治疗蛋白包括拥有以下生物活性的蛋白:如增加血管新生，抑`制血管新生，调节造血功能，促进神经发育，提高免疫反应，抑制免疫反应等。
[0100]正如上述提及中的一样，“治疗活性”或者“活性”可以指在人类、非人哺乳动物或其他种属生物体中，得到与理想的治疗结果一致的效果的活性。治疗活性可以在体内或者体外测量。
[0101]本发明中与重组明胶样融合蛋白的治疗性蛋白部分相应的治疗性蛋白，包括，但并不限于:VEGF受体，TNF受体，HER-2/神经膜受体，人ErbB3受体分泌形态异构体，转化生长因子bill型受体胞外区，转化生长因子b II型受体胞外区，IL-1受体，IL-4受体，尿激酶，β -葡糖脑苷脂酶，精氨酸脱亚胺酶，Arginase, herstatin,表皮生长因子，FGF-1,纤维原细胞生长因子_2，普通纤维细胞生长因子，神经生长因子，血小板来源生长因子，VEGF-1，IL-1, IL-2, IL-3，IL-4, IL-6，IL-8, IL-10, IL-11, IL-12，IL-18，IL-21，IL-24，IL-1RA, RANKL, RANK, 0PG, LEPTIN，干扰素 α，干扰素 β，干扰素 Υ，干扰素 Ω，TGF- β，TGF- β -1，TGF- β -3，TNF α，心房钠尿多肽，Β型钠尿肽，促性腺激素，人黄体生成素，促卵泡激素，人生长激素，ΕΡ0, G-CSF，GM-CSF，ΤΡ0, M-CSF，SCF，VEGF, ΕΡ0 模拟肽，ΤΡ0 模拟肽，FLT3配体，Αρο2配体，骨细胞抑止因子，BMP-2，BMP-7, GLP-1及其类似物，Exendin_3，Exendin-4,胰岛素及其类似物，GIP,胰高血糖素，内皮抑制素(endostatin)，plasminogenkringleldomain, plasminogen kringle5domain, angiostatin 等。治疗性蛋白也还可以是抗体及其片段，单链抗体scFv等。这些蛋白以及编码这些蛋白的核酸序列都是大家熟知的，并且在如 Chemical Abstracts Services Databases (例如 CAS Registry)，GenBank 和GenSeq这样的公共数据库中可以找到。对于本专业人员来说，根据本发明的精神，容易理解的是现有已经发现的绝大部分生物活性蛋白都适用于本发明。当然，同样应理解的是，在此发明以后新发现的具有生物学活性的蛋白/多肽，也同样适用于本发明。
[0102]本发明中重组明胶样融合蛋白中的生物活性蛋白，可以是非糖基化的，也可以是糖基化的，例如部分细胞因子，细胞表面蛋白和分泌性蛋白，经常会被修饰，如结合一个或多个的寡糖基团。糖基化一般有两种主要类型:0-连接的寡糖糖基化，连接位点在丝氨酸或苏氨酸残基上；N-连接的寡糖糖基化，连接位点在Asn-X-Ser/Thr序列的天冬酰胺酸残基位点上，在此，X可以是除了脯氨酸以外的任何氨基酸。
[0103]糖基化异构体可以通过去除或者引入糖基化位点获得，比如替换或者去除氨基酸残基，象用谷氨酸代替天冬酰胺酸那样，或者在不产生这种糖基化蛋白的宿主细胞中表达非糖基化重组蛋白，例如在大肠杆菌或者糖基化缺陷的酵母中表达。
[0104]作用机制
[0105]多肽/蛋白质在体内迅速被清除的机制是多样的，包括肾小球过滤，受体介导内吞，蛋白酶作用，淋巴系统清除，肝脏清除等多种机制。活性蛋白与IgG的Fc片段或白蛋白融合后之所以可以保持较长的半衰期，是因为体内存在特殊的FcRn介导的循环作用保护。
[0106]将明胶序列与活性蛋白融合表达后延长活性蛋白半衰期的确切机制尚未清楚。到目前为止尚未发现有类似的受体起作用。GLK序列本身不会与FcRn结合。本发明人将人血清包被酶标板，加入GLK/G-CSF融合蛋白(同时以G-CSF作为阴性对照)，保温孵育洗涤后用生物素标记的G-CSF (Abeam pic.)抗体结合，经HRP显色证明GLK融合蛋白并没有与血清中的任何组分有结合作用，因此排除了这种“GLK融合蛋白与血清中某些组分相互结合”的可能性。另外，可以肯定的是并不是纯粹因为融合后增加了分子量而导致半衰期的延长，现有的研究已经发现，纯粹的增大融合蛋白分子量并不一定能延长其体内半衰期，如Carlos A.(Buscaglia CA et al.，Blood.，93:2025-2032，1999)研究发现分子量大的 TSac蛋白(76KD)体内半衰期(约几小时)远小于比它分子量小的GST-Ag36 (60KD)(约30小时)。实施例7的数据也显示，同样的活性多肽，选用不同序列，但是分子量接近的明胶样单元作为融合载体，最终获得的融合蛋白却具有不同的半衰期。
[0107]应理解，本发明的保护范围并不受作用机理的限制。本发明人提供以下机理是为了便于更好地理解本发明。融合后重组明胶样融合蛋白能增加活性蛋白在体内外稳定性和半衰期的可能原因有:
[0108](l)GLK的Gly-X-Y结构中Y位Pro (Hyp)的大量存在，使其在生理环境中保持了一种松散的结构，从而形成了一道屏障保护了活性蛋白不被体内蛋白酶降解。
[0109](2)GLK结构中富含亲水性氨基酸，因此有很大的水合分子半径，也避免了其在肾脏过滤排出。理论分子量约为55KD的rGLK1164/G-CSF融合蛋白，用分子筛分析其表观分子量约为154KD (表观分子量:理论分子量=2.8)。
[0110](3)融合蛋白中GLK特别的带电性质导致了重组明胶样融合蛋白在体内更长时间的驻留。本发明的GLK具有较低的等电点，在正常生理条件下带负电荷。很多血浆蛋白大多带负电荷且具有运输功能，带有负电荷的重组明胶样融合蛋白减少了与这些血浆蛋白相互结合的可能性，因此可以在血浆中存留更长的时间。[0111](4)血管壁上内皮细胞表面覆盖的多糖-蛋白质复合物(glycocalyx)的存在降低了重组明胶样融合蛋白的清除率。血管壁上的多糖-蛋白质控制着血管内与周围基质间的物质运输(Simionescu M, Simionescu N,Annu.Rev.Physiol.,48:279-293, 1986) ? 多糖-蛋白质复合物在正常生理状态下带负电荷，而重组明胶样融合蛋白也带负电荷，由于同种电荷的排斥，也减少了重组明胶样融合蛋白与glycocalyx的相互作用，从而减少了重组明胶样融合蛋白从血管向组织中的渗透。
[0112]重组明胶样融合蛋白的制备
[0113]本发明的融合蛋白可用固相技术通过直接合成肽而加以生产，也可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。在优选方案中，本发明的融合蛋白用重 组方法来制备。
[0114]重组方法来制备明胶融合蛋白涉及在原核宿主，真核宿主，植物或者动物中表达编码重组目标明胶融合蛋白核苷酸，以及获得重组明胶样融合蛋白的过程。任何可以表达重组蛋白的系统，包括原核，真核，转基因动植物系统，都可应用于本发明。例如，美国专利US6548653所提及的所有用于表达融合蛋白的方法,都适合于本专利。
[0115]更详细的说，通过重组方法来获得目标重组明胶样融合蛋白，首先需要获得编码所需重组明胶样融合蛋白的核苷酸，编码目标核苷酸序列可用多种不同的常规方法制备。此外，为了得到上述序列的衍生或变异序列，可以对核苷酸序列进行修饰或改动，例如通过基因工程技术。
[0116]更优选地，在本发明的过程中，核苷酸序列是包含有转录起始区(启动子序列)的表达框的一部分，在宿主细胞中，此转录起始区控制核苷酸序列的表达，并编码本发明中的多肽。此区域可来自在所用的宿主菌中高度表达的，组成型或调控型基因的启动区。例如对于酵母，可以是甲醇氧化酶(Α0Χ)，磷酸甘油酸酯激酶(PGK)以及类似基因的启动子。表达框也可以包括在所使用的宿主菌中有功能的转录终止区，紧密的连接在编码本发明中多肽的核苷酸序列下游。
[0117]在优选的方案中，编码本发明中多肽的核苷酸序列之前带有一段信号肽序列，用于引导新生的多肽在其宿主中进入分泌途径。
[0118]除了表达框，一个或几个可用于筛选重组宿主菌的标签(Tag)都可以加入，例如酵母S.cerevisiae的URA3基因，pichia酵母中G418抗性基因，或其他任何选择性标签。表达框和筛选标记形成的单位可被直接引入到宿主细胞中，或者预先插入到功能性自我复制的表达载体中。可选用的表达载体来源是极其广泛的，包括但并不限于:Kluyveromyces酵母常用的表达质粒pKDl ;Saccharomyces属酵母优选的2 μ质粒；pichia系统常用的pPIC9, pPIC9K, pPICZa 表达质粒等。
[0119]在构建了上述重组表达质粒以后，可以根据常见的分子生物学文献，如《分子克隆实验指南》第三版(Sambrook J, Russell DW, Molecular cloning:A laboratorymanual.3rd edition, New York:Cold Spring Harkbor Laboratory Press, 2001)或商业公司提供的常规技术，将重组质粒引入到所选的宿主细胞中，并筛选成功整合有重组质粒的宿主菌细胞。可以实用任何可将外源DNA引入到细胞中的常规方法，如转化，电转化，接合等。任何可以表达重组蛋白的系统，包括原核，真核，转基因动植物系统，都可应用于本发明。[0120]在转化细胞筛选后，表达上述融合蛋白的细菌或细胞会被接种培养。融合蛋白的收获会在连续培养过程的细胞生长阶段，也可以是在生长末期的培养阶段，视宿主细胞的表达特性而定。融合蛋白可以表达在宿主菌内部，如绝大部分原核表达系统，也可以分泌在培养基中，如酵母、动物细胞表达系统，一般都是胞外分泌的。通过相应的离心，破菌，超滤，沉淀，层析等多种方法的组合，可以获得高度纯化的重组明胶样蛋白或重组明胶样样-活性蛋白融合蛋白。纯化后的融合蛋白可用于结构鉴定，体内外生物学活性测定，或者药物代谢动力学等用途。
[0121]由于表达载体和宿主菌的差异，通过有些真核系统表达的重组明胶样蛋白结构中的Ρι.ο可能会被部分或者全部转化为Hyp，但是这个变化并不影响本发明的实施效果。虽然酵母中一般不存在脯氨酰-4-羟化酶(P4H)，但通过某些特殊的手段，在酵母系统中也可以实现Pro部分或者全部转化为Hyp,例如，Vuorela(Vuorela et al., EMBOJ.，16:6702-6712，1997)及Vaughan (Vaughan et al., DNA cell Biol.，17: 511-518，1998)的研究结果表明，在酿酒酵母或毕赤酵母中共同表达明胶和脯氨酰-4-羟化酶(P4H)基因可以获得羟基化的明胶。
[0122]重组明胶样融合蛋白的性质
[0123](a)理化性质
[0124]本发明的融合蛋白中的所述明胶样单元(Gly-X_Y)n具有以下部分或全部理化特性:
[0125](1)亲水性氨基酸 Asn, Asp, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg 的氨基酸百分比含量较高，总和为40%至2/3 (66.7%)；
[0126](2) Pro和Hyp的数量之和与η的比值≥0.6 ；
[0127](3) Gly的数量之和与η的比值≤1.15 (更佳地≤1.05)；
[0128](4)等电点为3-7 (较佳地为3.2-6,更佳地为3.2-5.5)；
[0129](5)根据Kolaskar-Tongaonkar法计算平均抗原指数不高于0.98 ；
[0130](6)根据ProtParam公式计算，代表亲水性的GRAVY值小于-1.1 (较佳地小于-1.4，更佳地小于-1.5)。
[0131]表1.实施例1-12中涉及的部分明胶单元的特性
[0132]
【权利要求】
1.明胶样单元的用途，用于作为融合载体，延长生物活性多肽在机体内的体内半衰期；其中，所述的明胶样单元是结构如下的多肽:(Gly-X-Y)n式中，Gly为甘氨酸残基；X和Y分别为20种天然氨基酸除了 Cys之外的任意氨基酸残基，以及Hyp ；n为 20-300 ；并且，所述的明胶样单元具有以下特征:(a)所述明胶样单元中以下亲水性氨基酸Asn,Asp, Gin, Glu, Lys, Pro, Ser, Hyp, Arg的氨基酸百分比含量总和为40%至2/3 ；(b)所述明胶样单元中，Pro和Hyp的数量之和与n的比值≥0.6 ；(c)Gly的数量之和与n的比值≤1.15 ；且，根据ProtParam公式计算，代表亲水性的GRAVY值小于-1.5 ；附加条件是，所述的明胶样单元不是天然的明胶蛋白。
2.如权利要求1所述的明胶样单元，其特征在于，所述的明胶样单元还具有以下特征:(d)等电点为3-7；(e)根据Kolaskar-Tongaonkar法计算平均抗原指数不高于0.98。
3.如权利要求1所述的明胶样单元，其特征在于，所述的明胶样单元的分子量为10-100kDa。
4.如权利要求1所述的明胶样单元，其特征在于，所述的明胶样单元的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或所述的明胶样单元的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
【文档编号】C07K14/00GK103641896SQ201310524308
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2009年11月19日 优先权日:2009年11月19日
【发明者】黄岩山, 周林福, 陈智 申请人:浙江大学