专利名称：三精氨酸胰岛素的制作方法
技术领域：
本发明属于临床医学领域，提供了用于糖尿病治疗的新的胰岛素形式。
目前，糖尿病的主要治疗方法涉及用中效和长效胰岛素制品进行治疗。设计这些制剂是为了控制病人整个夜间的葡萄糖水平，同时给许多病人提供每天注射一次的治疗。
所有这些制剂的共同特点在于，它们都是胰岛素的不溶性悬浮液。因此，注射剂量可能有很大变化，并且，在皮下注射之后，葡萄糖的控制可能受影响(Skyler，J.S.，MedicalClinicsofNorthAmerica，721337-1354，1988)。许多这种制剂还需要加入大量的鱼精蛋白以提供长时间作用，鱼精蛋白是一种鱼蛋白质，已经证明它能在一些病人体内引起抗体产生(Ellerhorst，J.A.等，TheAmericanJournaloftheMedicalSciences，299298-301，1987)。
随着重组DNA技术的出现，已经合成了大量能在制剂中完全保持可溶性的胰岛素类似物，它们比天然胰岛素有着更快或者更长的作用(Markussen，J.等，ProteinEngineering，1215-223，1987)。对于得到更为长效的胰岛素类似物而言，一个最有希望的方法是将它们配制成在低pH(pH3-4)条件下完全可溶的制剂。在皮下注射后，由于迅速调整到机体内环境的天然pH值(pH7.4)，使这些类似物沉淀或结晶。它们在pH7.4条件下缓慢地重新溶解，使作用时间达到所需的延长。
在上述方法中存在下面两个问题。首先，长期施用酸性很强的溶液会引起疼痛、皮肤坏死和腐肉形成(DeLuca，P.P.和Rapp，R.P.PharmaceuticsandPharmacyPractice;Banker，G.S.和Chalmers，R.K.编;238-278，1982，J.B.LippencottCo.，Philadelphia，PA)。从这一点考虑，更接近中性的溶液(pH6-7)显然更为理想。其次，因为胰岛素类似物对机体来说是非天然的，所以机体会将它们视为异己，产生针对这些胰岛素类似物的抗体，从而干扰病人的胰岛素疗法或引起其它问题(Patterson，R.等，AnnalsofAllergy，64459-462，1990)。尽可能减少这类蛋白质结构的变异可能会避免这一潜在的问题。
已有人描述了一种称为二精氨酸胰岛素的胰岛素类似物，它具有中效作用以及在pH4-5易于溶解的特点(Zeuzem，S.等，Diabetologia，3365-71，1990)。但是二精氨酸胰岛素缺乏本发明的优点之一，即在pH6附近可溶。本发明还显示出了优于二精氨酸胰岛素的长效作用特点。
除了前文提及的强酸性制剂的生理性问题外，天然胰岛素样分子在低pH条件下还存在另一个问题。在酸性条件下，A链第21位(A21)上的天冬酰胺残基非常易于发生脱酰胺作用和其它副反应，从而形成不希望有的二聚体和多聚体(Markussen，J.等，ProteinEngineering，2157-166，1988)。这些反应最好在低于pH4的条件下进行，而在大于pH5的条件下几乎不存在(引文同前)。因此，在进行人体治疗方面，最希望制备一种具有长效降血糖作用、低免疫原性且在高于pH6的条件下其制剂可溶的胰岛素样分子。
本发明是基于以下发现本文称作三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物的一些胰岛素类似物，具有附加了三个额外精氨酸残基的胰岛素天然结构，在动物模型中具有长效降血糖活性，并在pH达到6.1时仍能配制成溶液。
本发明涉及具有下式的化合物或其可药用无毒盐
其中X和Z选自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，Y选自His、Asp或Glu。最优选的化合物是那些在可变位置上含有天然存在的氨基酸的化合物，即其中的X是Asn，Y是His，Z是Asn。
本发明还包括由人胰岛素原组成的断裂(64)胰岛素原三精氨酸类似物或其可药用盐，其中B链第3位残基(B3)和A链第21位残基(A21)选自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val;B链第10位残基(B10)选自His、Asp或Glu;C肽第64位残基(Lys-64)与C肽第65位残基(Arg65)之间的酰胺键(肽键)被打开。
在进一步的实施方案中，本发明包括由去掉了Lys-64的断裂(64)胰岛素原三精氨酸类似物组成的去(64)胰岛素原三精氨酸类似物或其可药用盐。最优选的化合物是在可变位置上含有天然存在的氨基酸的化合物，即其中的B3和A21残基是Asn，B10残基是His。
本发明的另外一个实施方案是制备人三精氨酸胰岛素的方法，该方法包括a)使人胰岛素原与胰蛋白酶和羧肽酶B接触，产生去(64)人胰岛素原;
b)分离去(64)人胰岛素原;
c)使去(64)人胰岛素原与胰蛋白酶接触;
d)分离三精氨酸胰岛素。
本发明另外一个实施方案是制备人三精氨酸胰岛素的方法，该方法包括a)在优先打开人胰岛素原Lys-64和Arg-65之间肽键的条件下，使人胰岛素原与赖氨酸内肽酶接触，产生断裂(64)人胰岛素原;
b)分离断裂(64)人胰岛素原;
c)使断裂(64)人胰岛素原与胰蛋白酶接触;
d)分离人三精氨酸胰岛素。
图1说明三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物的一级氨基酸顺序，并显示出三个二硫键。每一个残基下面的数字对应于该残基在顺序中从氨基末端算起的位置。B链第3位上的符号X代表20种天然存在的氨基酸中的任何一种。B链第10位上的符号Y代表His、Asp或Glu，A链羧基末端的符号Z代表20种天然存在的氨基酸中的任何一种。
图2显示人胰岛素原的一级氨基酸顺序。以黑色显示的残基表示天然人胰岛素，以白色显示的残基表示天然人胰岛素原的连接肽(C肽)。
为了本文表述方便起见，常见于天然存在蛋白质中的20种L-氨基酸用标准的三字母缩写形式表示(参见《CodeofFederalRegulations》第37卷第1.822节)。同样为了本文表述方便起见，一些术语按下列定义使用。
术语“三精氨酸胰岛素”定义为在B链的羧基末端含有两个额外精氨酸残基(如图1和图2所示的Arg-31和Arg-32)，在A链的氨基末端含有一个额外精氨酸残基(如图1所示的A链Arg-0或如图2所示的Arg-65)的人胰岛素。
术语“三精氨酸胰岛素类似物”定义为三精氨酸胰岛素中B3或A21位或这两个位置被20种天然存在氨基酸中的任意一种所置换，而B10位可以被His、Asp或Glu置换。
术语“胰岛素原三精氨酸类似物”指的是在B3、B10和A21位上含有与本发明一致的任何可能置换的人胰岛素原。
术语“断裂(64)胰岛素原”定义为Lys-64和Arg-65(A链Arg-O)间的肽键被打开(见图1和图2)的人胰岛素原。
术语“断裂(64)胰岛素原三精氨酸类似物”定义为在B3、B10或A21位上发生了与本发明一致的一个或更多个氨基酸置换的断裂(64)胰岛素原。
术语“去(64)胰岛素原”定义为去掉了Lys-64的断裂(64)胰岛素原(见图1和图2)。
术语“去(64)胰岛素原三精氨酸类似物”定义为在B3、B10或A21位上发生了与本发明一致的一个或更多个氨基酸置换的去(64)胰岛素原。
术语“可药用无毒酸加成盐”包括有机酸和无机酸加成盐，包括例如由下列酸制得的盐盐酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富马酸、氢溴酸、乙醇酸、柠檬酸、马来酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗坏血酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸、碳酸等，或诸如碳酸氢铵等盐类。酸加成盐最好是由盐酸、乙酸或碳酸制得的盐。可以通过常规方法制备上述任何一种盐。
术语“羧酸盐”包括例如锌盐、铵盐、碱金属盐(如钠盐、镁盐、钾盐和锂盐)等。优选的羧酸盐是锌盐和钠盐。
本发明涉及许多人胰岛素类似物及从胰岛素原和胰岛素原三精氨酸类似物制备人胰岛素类似物的方法。属于本发明范围内的化合物的一般结构如图1如示，其氨基酸顺序列于1-4号顺序中。本发明的化合物包括其可药用的无毒酸加成盐及其可药用的无毒羧酸盐。
使本发明的化合物具有若干意想不到的有益性质的一个基本特征是存在三个额外的精氨酸残基。其中二个残基见于B链的羧基末端(Arg-31和Arg-32，如图1和图2所示)，第三个额外的精氨酸残基位于A链的氨基末端(A链Arg-0，如图1所示;或Arg-65，如图2所示)。这三个精氨酸残基存在于天然人胰岛素原的结构中，但不存在于天然存在的人胰岛素中(参见图2)。
已知胰岛素B链的第3位(B3)可以用其它天然存在氨基酸置换，而对胰岛素结构无不利影响，也不消除其生物活性。因此，该位置上的任何天然存在的氨基酸都是与本发明一致的。但是，为了减少产生免疫原性的可能性，优选Asn，因为天然胰岛素中该位置上是Asn。
上述情况对A链的羧基末端残基(A21)也是适合的。因此，A21位上的任何天然存在的氨基酸都是与本发明一致的。但是，为了减少产生免疫原性的可能性，优选Asn，因为天然胰岛素中A21位上是Asn。
第三个可以发生氨基酸置换的位点是B链的第10位(B10)。已有文献报道在B10位含有Glu或Asp的胰岛素类似物，并证明其效力增强(Burke，G.T.等，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，173982-937，1990)。因此，可认为在本发明中Glu、Asp和His可占据B10位。然而，为了减少产生免疫原性的可能性，优选His，因为在天然胰岛素中B10位上是His。
如同天然人胰岛素一样，为了形成合适的回级结构，三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物需要三个二硫键。有两个二硫键连接A链和B链(A7-B7和A20-B19)，在A链中形成一个链内二硫键(A6-A11)，如图1所示。
利用公知的蛋白质化学原理和重组DNA方法，可以经多种途径制备三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物。下面简要列举合成三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物的几个基本途径。所列途径并非穷举，因为基本方案的许多其它改变都是可能的。
1)如实施例1所述，用胰蛋白酶和羧肽酶B处理人胰岛素原。
2)如实施例2所述，用在赖氨酸处切割的内肽酶在人胰岛素原的Lys-64和Arg-65残基之间进行选择性切割，随后用胰蛋白酶温和地切割优选的Arg-32-Glu-33肽键。
3)通过重组DNA技术合成A链Arg-0和B链Arg-31、32，然后再通过已知的二硫键化学法使其组合。这类二硫键化学法的细节参见美国专利4，421，685，该专利并入本文作为参考。
4)用化学法合成A链Arg-0和B链Arg-31、32，然后再通过已知的二硫键化学法使其组合。
5)用重组DNA技术制备由肽顺序B链-Arg-31-Arg-32-Arg-33-A链组成的单链小型胰岛素原分子。二硫键形成之后，用胰蛋白酶样酶类选择性地或在某种程度上优先地切割Arg32和Arg33之间的肽键，生成三精氨酸胰岛素。
6)结构为X-B链-Arg-Arg-Y-Arg-A链的小型胰岛素原分子，其中X和Y可以是Arg或Lys以外的任何天然存在的氨基酸。该小型胰岛素原由重组DNA技术制得，并以正确的二硫键排列进行适当的折叠。预计胰蛋白酶对该单链肽的切割首先发生于Arg-Y之间，接着通过Edman法分别从B链和A链的氨基末端去掉X和Y，生成三精氨酸胰岛素。
对每一种上述方案都可以进行多种多样的小改动。最显著的改动是在B3、B10和A21位上发生所有可能的氨基酸置换。
例如，可以改动方法1，用化学方法或重组方法首先合成一种人胰岛素原三精氨酸类似物。通过对所说三个位置中每一位置上所有可能的氨基酸置换进行混合和配对，可产生近1200种不同的胰岛素原三精氨酸类似物，用方法1即可从中制备三精氨酸胰岛素类似物。
作为另外一个例子，可如下改动方法1，首先制备具有前导顺序的编码B链的DNA化合物。在翻译之后，可通过酶解切下所得的肽前导顺序，并如上所述完成该方法。该方法的其它变化包括加上产生可切割肽的尾随顺序，生成三精氨酸胰岛素或三精氨酸胰岛素类似物。
分子生物学的现有技术已提供了以任何给定的氨基酸置换蛋白质顺序中的另一种氨基酸的方法。利用公知技术，如位点特异性突变，可以随意改变编码胰岛素原的DNA顺序，产生所选择的氨基酸置换。因此，现有技术使技术人员能制备出胰岛素原三精氨酸类似物。所以，方法1可用于制备含有任何一个或更多个包括于本发明中的氨基酸置换的三精氨酸胰岛素类似物。
还可以用另一种方法完成在三个可变位置上的所需氨基酸置换。肽合成化学的现有技术提供的方法，例如Merrifield技术，可用于从单个氨基酸合成至少32个残基的肽。因此，利用上述的方法3，可以合成在可变位置上含有任何可能的氨基酸置换的胰岛素A链和B链。
用于制备三精氨酸胰岛素和三精氨酸胰岛素类似物的方法和中间体，是本发明进一步的实施方案。通过乙酰化胰蛋白酶和羧肽酶B的作用，实施例1所述的方法产生了作为中间体的去(64)胰岛素原，但发现去(64)胰岛素原本身就具有降血糖活性。实施例1所述的方法也可以从相应的胰岛素原三精氨酸类似物起始而生成去(64)胰岛素原三精氨酸类似物中间体。
实施例2所述的方法通过用赖氨酸内肽酶处理人胰岛素原而产生断裂(64)胰岛素原中间体。该方法也可以从相应的胰岛素原三精氨酸类似物起始而产生断裂(64)胰岛素原三精氨酸类似物中间体。同样也发现断裂(64)胰岛素原本身就具有降血糖活性。
赖氨酸内肽酶C是有着广泛商业来源的赖氨酸内肽酶，例如，它可来自Lysobacterenzymogenes(Boehringer-Mannheim;Indianapolis，IN)、铜绿假单胞菌(Promega;Madison，WI)和AchromobacterLyticus(WakoPureChemical;Dallas，TX)。它特异切割赖氨酸残基的羧基末端。为了从胰岛素原产生高产率的断裂(64)胰岛素原，有必要在切割Lys-29位羧基末端之前优先切割Lys-64位的羧基末端。在这方面，发现来自铜绿假单胞菌的赖氨酸内肽酶C是优选的来源，得自Lysobacterenzymogenes的酶是最优选的来源。
下面的实施例用于理解本发明及如何实施本发明。这些实施例仅用于说明目的而决不是对本发明进行限制。
实施例1通过去(64)人胰岛素原中间体制备三精氨酸胰岛素用猪羧肽酶B(Promega;Madison，WI)和乙酰化牛胰蛋白酶(其制法参见EuropeanJ.Biochem.，2215-223，1967)处理在大肠杆菌中制得的重组人胰岛素原，其中，酶和底物溶于20mM甘氨酸缓冲液中(pH8)，其重量比分别是约1∶1000和1∶20，000。反应在8℃进行约27小时，加入1倍体积的7M尿素终止反应。然后将所得的溶液上样到预先用7M尿素、10mM Tris(三羟甲基氨基甲烷，Sigma;st.Louis，MO)、1mM连四硫酸钾(pH8.1)平衡过的Q-Sepharose Fast FlowTM树脂柱上。用含有25mM氯化钠的相同缓冲液洗柱，然后用25-65mM氯化钠在平衡缓冲液中的线性梯度进行洗脱。收集各流出级份，并在收集之后立即用冰醋酸滴定至约pH4.0。
合并经分析性HPLC测定含有去(64)胰岛素原的级分，并用AmiconS1Y3螺旋缠绕式滤筒(Amicon;Danvers，MA)进行浓缩。用1M醋酸(约pH2.5)在约5℃对保留物进行透滤。用等体积的水稀释所得的溶液，再通过0.2μm的滤器过滤，并真空冷冻干燥至干。
在室温下，将2.91g去(64)人胰岛素原溶解于含0.02M CaCl2并用1N HCl调至pH8的291ml 0.05M Tris缓冲液中。然后将该溶液冷却至5℃。加入约364μl溶于水中的猪胰蛋白酶(1mg/ml)(Sigma;st.Louis，MO)，使酶底物重量比为1∶8000。混合后，将溶液贮存于5℃。
4.5小时后，加入10ml 1N HCl停止反应。将整个透明溶液泵至5.5×30cm C-18 VydacTMHPLC柱中。水洗后，用在0.5%三氟乙酸(TFA)缓冲液中的22.5-42.5%乙腈梯度，以2.5ml/分的流速洗脱蛋白质24小时。用276nm处的光吸收监测流出液。以20ml为一级分进行收集，借助HPLC，用C-8ZorbaxTM柱以在0.1M磷酸二氢钠缓冲液(pH2.1)中的乙腈梯度对若干级份进行分析性检测。
合并含有级分(116-128)的三精氨酸胰岛素，冰冻干燥后得到0.94g产物，HPLC纯度为87%。该产物的结构通过氨基酸组成、N-末端顺序分析及快原子轰击质谱(FAB-MS)加以证实。
实施例2通过断裂(64)人胰岛素原中间体制备三精氨酸胰岛素将800mg人胰岛素原溶解于含有25mM Tris和1mM EDTA的80ml缓冲液(pH7.7)中。用同样的缓冲液将铜绿假单胞菌赖氨酸内肽酶C(Promega;Madison，WI)制成0.1mg/ml，并取200μl加至胰岛素原溶液中，使得酶底物重量比为1∶40，000。反应液充分混匀后于37℃下保温9.5小时。加入1N HCl将溶液酸化至pH3.0，然后加到用0.5%TFA平衡过的5.5×30cm VydacTMC-18制备性HPLC柱上。用0-40%乙腈在TFA缓冲液中的梯度洗脱纯化的蛋白质20小时。合并相应于断裂(64)胰岛素原的级份，冰冻干燥后得到237mg产物，该产物的本质通过氨基酸分析、FAB-MS和N末端顺序分析加以证实。
用25mM Tris、1mM EDTA缓冲液(pH7.7)将一部分断裂(64)胰岛素原制成1mg/ml，并用相同的缓冲液将牛胰蛋白酶(Sigma;St.Louis，MO)制成0.1mg/ml。向700μl断裂(64)胰岛素原中加入7μl胰蛋白酶溶液，使酶底物重量比为1∶1，000。在室温下搅拌反应物30分钟。然后在4.6×250mm ZorbaxTMC-8柱上以乙腈在0.1M磷酸钠缓冲液(pH2.1)中的短梯度对反应产物进行HPLC分析。分析结果表明，基本上所有的断裂(64)胰岛素原都被消化，主要产物是三精氨酸胰岛素。
实施例3制备Asp(A21)-三精氨酸胰岛素类似物将如实施例1制备的三精氨酸胰岛素(40mg)溶解于4ml 0.01NHCl中，并在室温下保存12天。然后将溶液在37℃下再保温16天。用制备性HPLC纯化最终溶液中的主要成分。将5份溶液(每份0.5-1.0ml)注入预先用含有26%乙腈的0.1M硫酸钠缓冲液(pH2.3)平衡过的21.5×250mm ZorbaxTMC-8HPLC柱中。用26-30%乙腈在硫酸钠缓冲液中的梯度洗脱样品的各成份。将这5次操作所得的含主要成份的流出液级份混合，用等体积的水稀释，并在C-18Sep-PakTM滤筒(Millipore;Bedford，MA)上脱盐。洗脱纯化的肽，在50%乙腈和50%TFA(0.5%)缓冲液中浓缩，并冰冻干燥。通过对单个A链和B链的氨基酸分析、FAB-MS和HPLC分析，证实纯化产物的结构。分析性HPLC表明，Asp(A21)-三精氨酸胰岛素类似物的纯度为95%。
实施例4三精氨酸胰岛素的生物活性用0.05M乙酸钠缓冲液制备2-4ml三精氨酸胰岛素溶液(40U/ml)，使最终蛋白质浓度为约2.0mg/ml。制备不同含锌量(0-2.4mg/ml)(氯化锌形式)的溶液。用冰醋酸溶解每一种溶液至最终pH值范围为pH4-6。根据相对于人胰岛素估算的70%的生物效力(胰岛素受体结合作用)和人胰岛素的标准化数值28.85U/mg，在测试溶液的制备中使用下列公式。
2mg/ml×28.85U/mg蛋白×70%效力＝40U/ml用于实验的新西兰白兔绝大多数为雌性，体重均为2.7-4Kg，年龄0.5-4岁，在施用样品之前禁食16小时。分别用下列溶液(40U/ml)以0.2U/Kg的剂量给10只兔作颈背部皮下注射三精氨酸胰岛素、Asp(A21)-三精氨酸胰岛素类似物、断裂(64)胰岛素原(pH7.35)、去(64)胰岛素原(pH7.46)、二精氨酸胰岛素(制备方法参见Zeuzem等，Diabetologia，3365-71，1990)、Humulin LTM(中效人胰岛素，伊来利利公司;Indianapolis，IN)或Humulin UTM(长效人胰岛素，伊来利利公司;Indianapolis，IN)。
在不同时间从兔耳缘静脉抽取100μl血，与900μl抗凝剂(EDTA-氟化钠)混合，并分析葡萄糖含量。将葡萄糖值标准化以反映在注射样品之前测得的原始血糖的百分比。结果如表1所示。
表1原始血糖的百分比n=10注射样品后的时间(小时)加锌量胰岛素mg/ml1246Humulin L058.248.090.696.2Humulin U053.455.385.392.5三精氨酸胰岛素051.156.086.995.3Asp(A21)-三精氨酸胰岛素067.484.294.889.8去(64)人胰岛素原063.170.590.690.0断裂(64)人胰岛素原061.783.894.894.1二精氨酸胰岛素060.685.498.199.8
表1(续)原始血糖的百分比n=10注射样品后的时间加锌量胰岛素mg/ml1246三精氨酸胰岛素0.01443.350.390.594.9三精氨酸胰岛素0.0551.457.788.295.1三精氨酸胰岛素0.1461.652.176.196.5三精氨酸胰岛素0.3376.267.788.591.9三精氨酸胰岛素0.571.865.088.486.9三精氨酸胰岛素1.483.771.175.391.4三精氨酸胰岛素2.479.271.174.570.1Asp(A21)-三精氨酸胰岛素2.484.270.384.491.9二精氨酸胰岛素2.476.373.495.596.7实施例5根据276nm波长处的光密度(O.D.)比较三精氨酸胰岛素和二精氨酸胰岛素的百分溶解度。用2mM硼酸盐-柠檬酸盐-甘氨酸缓冲液(pH9.5)配制1mg/ml的三精氨酸胰岛素溶液(如实施例1制备)或二精氨酸胰岛素溶液(制备方法参见Zeuzem等，Diabetologia，3365-71，1990)。滴加5NHCl或者5NNaOH，将取自每个溶液的样品调至不同的pH值，并用数字式pH计测量。然后将每个样品于约10，000rpm离心30分钟。然后移出上清液，用分光光度计测量每个样品在276nm处的O.D.值。用0.98作为1mg/ml溶液的预期O.D.值，由O.D.值计算浓度。用离心后的浓度除以原始浓度计算出可溶物的百分比。结果如表2所示。
表2二精氨酸胰岛素三精氨酸胰岛素pH可溶物百分比pH可溶物百分比3.4695.2--4.0882.9--4.5173.04.9487.45.5619.05.5653.85.938.15.9225.36.4710.16.5610.57.0222.26.999.17.5444.47.5310.78.06102.08.0521.2
这些数据表明，三精氨酸胰岛素在所希望的配制pH(pH5-6)下具有较高的溶解度，但在皮下注射后的生理pH(pH7.4)下溶解度较低。因此，三精氨酸胰岛素可以在比二精氨酸胰岛素更高、更优选的pH下配制。所以，预计三精氨酸胰岛素在皮下注射后的溶解度特性能使其作用时间比二精氨酸胰岛素素更长。
顺序表1.概况(i)申请人:Hoffmann,James A.
Lambooy,Peter K.
(ii)发明名称:三精氨酸胰岛素(iii)顺序数:4(iV)通信地址:
(A)地址:伊来利利公司(B)街道:利利总部(C)城市:印第安那波利斯(D)州:印第安那(E)国家:美国(F)邮政编码:46285(V)计算机可读形式:
(A)介质类型:Floppy盘(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS(D)软件:PatentIn Release#1.0,Version 1.25(Vi)本申请资料:
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类:
(Viii)专利代理人情况(A)姓名:Boone Ph. D.,David E.
(B)登记号:27,857(C)案号:X-8164(iX)电讯资料(A)电话:317-276-1664(B)传真:317-276-12942.1号顺序资料:
(i)顺序特征:
(A)长度:32个氨基酸(B)类型:氨基酸(C)成链性:单链(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:蛋白质(iX)特征:
(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:7..8
(D)其它资料:/标记=Cross-Linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素B链)的Cys7以二硫键与三精氨酸胰岛素A链的Cys8连接。"(iX)特征(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:19..20(D)其它资料:/标记=Cros-linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素B链)的Cys19以二硫键与三精氨酸胰岛素A链的Cys21连接。"(Xi)顺序描述:1号顺序:
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu151015Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr202530Arg Arg(2)2号顺序资料:
(i)顺序特征:
(A)长度:32个氨基酸(B)类型:氨基酸(C)成链性:单链(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:蛋白质(iX)特征:
(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:7..8(D)其它资料:/标记=Cross-Linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素B链)的Cys7以二硫键与三精氨酸胰岛素A链的Cys8连接。"(iX)特征:
(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:19..20(D)其它资料:/标记=Cross-Linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素B链)的Cys19以二硫键与三精氨酸胰岛素A链的Cys21连接。"(Xi)顺序描述:2号顺序:
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu151015Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr202530Arg Arg(2)3号顺序资料:
(i)顺序特征:
(A)长度:32个氨基酸(B)类型:氨基酸(C)成链性:单链(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:蛋白质(iX)特征:
(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:7..8(D)其它资料:/标记=Cross-linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素B链)的Cys7以二硫键与三精氨酸胰岛素A链的Cys8连接。"(iX)特征:
(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:19..20(D)其它资料:/标记=Cross-Linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素B链)的Cys19以二硫键与三精氨酸胰岛素A链的Cys21连接。"(Xi)顺序描述:3号顺序:
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Glu Leu Val Glu Ala Leu151015Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr202530Arg Arg(2)4号顺序资料:
(i)顺序特征:
(A)长度:22个氨基酸(B)类型:氨基酸
(C)成链性:单链(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:蛋白质(iX)特征:
(A)名称/关键词:Disulfide-bond(B)位置:7..12(iX)特征:
(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:8..9(D)其它资料:/标记=Cross-Linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素A链)的Cys8以二硫键与三精氨酸胰岛素B链的Cys7连接。"(iX)特征:
(A)名称/关键词:Cross-links(B)位置:21..22(D)其它资料:/标记=Cross-linkage/注="该顺序(三精氨酸胰岛素A链)的Cys21以二硫键与三精氨酸胰岛素B链的Cys19连接。"(Xi)顺序描述:4号顺序:
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr151015Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20
权利要求
1.一种制备下式的三精氨酸胰岛素类似物的方法
其中，X和Z选自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、He、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，Y选自His、Asp或Glu，其中所说化合物由方法(A)或(B)制备(A)i)用胰蛋白酶和羧肽酶B与人胰岛素原三精氨酸类似物接触，生成去(64)人胰岛素原三精氨酸类似物；ii)分离去(64)人胰岛素原三精氨酸类似物；iii)用胰蛋白酶与去(64)人胰岛素原三精氨酸类似物接触；iv)分离三精氨酸胰岛素类似物；(B)i)在优先断裂人胰岛素原三精氨酸类似物Lys-64和Arg-65间肽键的条件下，用赖氨酸内肽酶与人胰岛素原三精氨酸类似物接触，生成断裂(64)人胰岛素原三精氨酸类似物；ii)分离断裂(64)人胰岛素原三精氨酸类似物；iii)用胰蛋白酶与断裂(64)人胰岛素原三精氨酸类似物接触；iv)分离人三精氨酸胰岛素类似物。
2.根据权利要求1的制备三精氨酸胰岛素的方法，其中人胰岛素原三精氨酸类似物是人胰岛素原;去(64)人胰岛素原三精氨酸类似物是去(64)人胰岛素原;断裂(64)人胰岛素原三精氨酸类似物是断裂(64)人胰岛素原;人三精氨酸胰岛素类似物是人三精氨酸胰岛素。
3.一种制备药物制剂的方法，该方法包括，将三精氨酸胰岛素类似物、三精氨酸胰岛素、去(64)人胰岛素原三精氨酸类似物、去(64)人胰岛素原、断裂(64)人胰岛素原三精氨酸类似物、或断裂(64)人胰岛素原，与一种或更多种可药用载体、稀释剂或赋形剂混合。
全文摘要
本发明涉及人胰岛素类似物(三精氨酸胰岛素)，包括两种制备三精氨酸胰岛素的酶方法。这些化合物在pH达6.1时仍可配制成可溶性制剂，并具有长效降血糖活性。三精氨酸胰岛素具有天然人胰岛素的基本结构加上三个额外的精氨酸残基。其中的二个额外精氨酸残基串联位于胰岛素B链的羧基末端，第三个精氨酸残基位于胰岛素A链的氨基末端。在B3、B10和A21位上具有某些氨基酸置换的三精氨酸胰岛素类似物也包括在本发明内。
文档编号C07K14/575GK1072723SQ92113309
公开日1993年6月2日 申请日期1992年11月25日 优先权日1991年11月26日
发明者J·A·霍夫曼, P·K·兰布伊 申请人:伊莱利利公司