用于治疗血管栓塞形成的微球的制作方法

专利名称：用于治疗血管栓塞形成的微球的制作方法
技术领域：
本发明提供了，例如微球，其包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。本发明还提供了制备微球的方法，所述微球包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。例如，本发明进一步提供了包含所述微球的组合物和使用所述微球和其组合物的方法。
背景技术：
使用治疗性血管闭塞(即栓塞形成)原位预防或治疗某些病理学病症。其可以利用导管施用，这使得有可能在成像控制下，将微粒闭塞试剂(即，栓子)定位于循环系统中。 其有许多医学应用，例如治疗肿瘤，包括例如子宫纤维瘤、血管畸形和出血病程。例如，血管闭塞可以抑制疼痛、限制外科手术介入的失血及随后的栓塞形成，或者甚至引起肿瘤坏死， 及避免进行手术。在血管畸形的情况下，血管闭塞能够使正常组织供血正常化，在外科手术中有帮助，且限制出血危险。在出血病程中，血管闭塞可引起流量减少，其促进动脉开口愈合。而且，根据待治疗的病理学病症，可以形成栓塞用于暂时性以及永久性目的。已经使用不同类型的栓子进行栓塞形成，例如液体试剂(例如，丙烯酸胶、凝胶或粘性悬浮液)以及微粒试剂(例如，混杂聚合物(miscellaneous polymers)、硬膜、海绵胶、 球、囊或螺旋物)，包括EmboSphere 三丙烯基明胶微球(BioSphere Medical, Rockland, ΜΑ)(参见，例如，美国专利号5，635，215和5，648，100)。在各种闭塞试剂中，已证实微球具有比其他固体栓子更好的栓子性质。然而，微球的性质和产率通常由于在生产方法中使用的材料和及其制备方法而变化。因此，仍然需要一种制备微球的方法，该方法具有例如较好的产率和较好的均勻性或纯度。另外，还需要具有例如在生产批次之间具有较好或更好的一致性的微球，其能够提供最佳的栓子效果。发明简述本发明提供的方法一般性地涉及微球和包含该微球的组合物。本发明还提供了微球的制备方法和使用方法。在一个方面，本发明提供了微球，其包含(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物， 和(b)交联的明胶。在某些实施方案中，所述微球在1H NMR谱中显示在约3. 5ppm至约4ppm 的第一个峰、约3ppm至约3. 5ppm的第二个峰和约Ippm至约1. 5ppm的第三个峰。在具体的实施方案中，(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0. 50至约0. 65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0. 55至约0. 75 (例如约0. 61至约0. 75)，或(iii)⑴和(ii)的组合。 在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元是超纯的单体单元，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体单元，和/或所述N，N-亚甲基二 -丙烯酰胺单体单元是超纯的单体。在另一个方面，本发明提供了微球，其包含(a)通过共聚N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体制备的共聚物，和(b)交联的明胶。在某些实施方案中，所述微球在屯NMR谱中显示在约3.5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3. 5ppm的第二个峰和约Ippm至约1. 5ppm的第三个峰。 在具体的实施方案中，(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0. 50至约0. 65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0. 55至约0. 75 (例如约0.61至约0. 75)，或(iii)⑴和(ii) 的组合。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是超纯的单体，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体，和/或所述N，N-亚甲基二 -丙烯酰胺单体是超纯的单体。在另一个方面，本发明提供了一种制备微球的方法，其包含(a)制备下述水溶液，该水溶液包含(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii) 二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体， (iii)N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和(iv)明胶，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是超纯的单体，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体和/或所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体；(b)在搅拌之前或搅拌同时，将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如油，例如矿物油，例如石蜡油)中；从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体单元；(c)交联明胶。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在交联明胶之前，对微球进行超声处理(例如超声粉碎)。在一个实施方案中，经由进料环(feed ring)将该水溶液加入到液体有机相中。本发明还提供了通过这些方法制备的微球。在另一个方面，本发明提供了在个体中形成栓塞的方法，其包括向个体使用本发明提供的微球。在仍然另一个方面，本发明提供了控制或治疗个体中血管生成依赖性疾病的方法，其包括向个体施用本发明提供的微球。术语除非另有定义，所有本文使用的技术术语和科技术语具有与如本领域普通技术人员通常理解的相同含义。将所有的专利、申请、公布的申请及其它出版物的全部内容引入本文作为参考。如果对于本文的术语存在多个定义，除非另有说明，以本部分中的定义为准。术语“约”或“近似”指在给定值或范围的20%之内，例如在15%之内、在10%之内、在9%之内、在8%之内、在7%之内、在6%之内、在5%之内、在4%之内、在3%之内、在 2%之内、在之内、在0.5%之内或更低。在用于本文时，“施用/给药”指通过注射或以其它手段将存在于体外的物质(例如本发明提供的微粒或微球)物理递送至患者体内的行为，例如但不限于通过肺(例如吸入)、粘膜(例如鼻内)、真皮内、静脉内、动脉内、胆道内、眼内、骨内、肌内递送和/或本文描述的或本领域已知的任何其它物理递送方法递送。在具体的实施方案中，使用注射器和/ 或导管递送所述微球。当治疗或以其它方式控制疾病或其症状时，所述物质的给药典型地发生在疾病或其症状发病之后。当预防疾病或其疾病时，所述物质的给药典型地发生在疾病或其症状发病之前。在某些实施方案中，这样的给药使递送的微粒(例如，本发明提供的微球)接触靶区域(例如，血管、组织或器官)。术语“血管造影”指在身体各个部分(例如，肝、前列腺、子宫)进行血管成像，以便确定所述血管患病、狭窄、扩大或完全阻塞的一种X射线检查。在某些实施方案中，将导管穿入通向感兴趣身体区域的动脉之后，通过注射对照物质增亮该血管，拍摄血管造影照片(例如，X射线)。“超选择性血管造影”指使用较小导管的血管造影，该较小导管可以穿过较大导管进入供应小的组织或肿瘤区域的支链动脉。术语“动静脉畸形”、“AVM”、“血管畸形”指在动脉和静脉之间出现至少一个(最典型地，许多)异常交流，导致主要由血管构成的局部肿瘤样物质的一组疾病。这样的疾病可以是先天性的或获得性的。术语“良性前列腺肥大”指例如中年和老年男性的前列腺增大。如本文使用的“交联”、“交联的”、“交联性，，通常指通过一个或多个桥连接两种或多种增稳物(包括脂质、蛋白质、聚合物、糖类、表面活性剂增稳物)、生物活性治疗因子和/ 或生物活性剂。所述桥可以由一个或多个元素、基团或化合物组成，通常使来自第一种增稳物分子的原子结合来自第二种增稳物分子的原子。交联桥可涉及共价连接和(或)非共价连接。多种元素、基团和(或)化合物中的任何一种都可以形成交联物中的桥，增稳物可以是天然交联的或经由合成方法交联的。例如，交联可以天然存在于由肽链构成的物质中，所述肽链由胱氨酸残基上的二硫键相连接，二硫键例如存在于角蛋白、胰岛素和其它蛋白质中。可选地，交联可受到合适的化学修饰的影响，所述化学修饰例如，可通过暴露于热、高能辐射等引起化合物例如增稳物与可充当交联剂的化学物质相结合。实例包括，通过硫形成二硫键的交联、使用有机过氧化物的交联、利用高能辐射的不饱和物质交联、与二羟甲基甲氨酸酯交联等。在本发明提供的微球的某些实施方案中，明胶是交联的。如本文使用的术语“细胞粘附促进剂”指由于其存在于微球中或与微球结合而促进或增强微球粘附到细胞表面的任何物质。这些物质通常经由蛋白质和聚合物的共价键结合所述微球的蛋白质。如本文使用的“化学修饰”指在微球制备过程期间、或通过混合微球与多种试剂或组织、或使微球接触多种试剂或组织时，微球的化学性质和特征的变化，使得一旦注射到体内，所述微球具有除了栓塞形成之外，进行例如其它功能的能力。如本文使用的术语“有效量”指足够部分地或完全地闭塞血管(例如动脉或静脉) 的治疗剂(例如，本发明提供的微球或组合物)的量。这样的闭塞可以是暂时性的或永久性的。在某些实施方案中，有效量将进一步改善给定疾病和/或其相关症状的严重性和/ 或持续时间。在本发明提供的方法的某些实施方案中，将有效量的微球施用给患者。如本文使用的术语“形成栓塞”或“形成治疗性栓塞”指部分或全部闭塞充满了血液的血管，例如通过将栓子有意引入血管中来选择性闭塞血管。例如，形成栓塞使动脉或静脉闭塞，以矫正功能障碍(例如动静脉畸形)或堵塞或减缓血流(例如，流向实体瘤/癌症生长)。在某些实施方案中，栓塞形成是一种被动行为，在此意义上，没有活性分子被运送和 /或递送到栓子物质沉积的位点。在施用其它治疗剂的上下文中，如本文使用的术语“组合”指使用超过一种治疗剂。术语“组合”的使用并不限制向个体施用治疗剂的顺序。第一治疗剂可以在向个体施用第二治疗剂之前(例如1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12 小时、M小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、同时或之后(例如1分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周之后)给药，所
述个体例如患有或易患给定的疾病。任一种另外的治疗剂可以与其它另外的治疗剂以任何顺序施用。在某些实施方案中，本发明提供的微粒可以与一种或多种治疗剂(例如，目前用于预防、治疗、控制和/或改善给定疾病或其相关症状所施用的非微球治疗剂)组合给药。 可以与本发明提供的微粒组合给药的治疗剂的非限制性实例包括止痛剂、麻醉剂、抗生素或免疫调节剂或在 U- S. Pharmacopoeia-National Formulary (2009) U. S. Pharmacopoeia, 甸,括{|条订版，禾口 / 或 hysiciaN’ s Desk Reference (2009) 63rd ed.，Thomson Reuters 中列出的任何其它试剂。如本文使用的，术语“杂质”指以材料或化合物(例如单体或单体单元)的限制量存在的物质，其与所述物质或化合物的化学组成不同。杂质可以是天然存在的，或者在合成物质或化合物期间增加的或由合成物质或化合物引起的。如本文使用的“可注射的”指能够经由注射器、导管、针或其它方式注射或灌注液体介质中的微球的给药、递送或运送到体内。在某些实施方案中，本发明提供的微粒微粒是可注射的微粒。如本文使用的具有“低水混容性”的液体或溶液指在25°C下，具有约50%或更低、 约40%或更低、约35%或更低、约30%或更低、约25%或更低、约20%或更低、约15%或更低、约10%或更低、约5%或更低、约4%或更低、约3%或更低、约2%或更低、约或更低、约0.5%、约0. 或更低、或约0%水混容性的液体或溶液。在具体的实施方案中，所述液体或溶液在25°C下具有约5%或更低的水混容性。在另一个具体的实施方案中，所述液体或溶液在25°C下具有约或更低的水混容性。在某些实施方案中，所述液体或溶液是不可混溶性的。如本文使用的术语“控制”指个体从不能引起治愈疾病的治疗剂(例如，本发明提供的微球)得到的有益效果。在本发明提供的方法的某些实施方案中，向个体施用一种或多种治疗剂以“控制”给定的疾病或其一种或多种相关症状，从而防止所述疾病的进展或恶化。如本文使用的术语“微球”指能够制成多个不同尺寸的小体的聚合物或一种或多种聚合物的组合。如本文使用的微球可以是任何形状。在某些实施方案中，所述微球是基本上球形的。所述微球的这些结构通常可以是球形或球状体形，或者受限于想象的球形或球状体形。在某些实施方案中，本发明提供的微球的表面在放大至多1000倍，例如至多100 倍、至多10倍、0倍或它们的范围内似乎是光滑的。可以通过本领域已知的任何方法对所述微球灭菌，所述方法例如照射，例如Y照射或β照射。本发明提供的微球可以包括如本文描述和定义的其它物质。然而，应当理解术语“微球”代表为了便于解释本发明提供的组合物和方法而进行的描述，在某些实施方案中，本文描述的示例性的微球并不必须限于精确的球形(例如，其为微粒)。术语“单体”指可以化学键合其它单体以形成聚合物或共聚物的小分子。在本文中，单体的某些性质或特征也可以应用于相应单体单元，反之亦然。术语“单体单元”指在聚合物或共聚物中的单体。如本文使用的术语“药学可接受的”指联邦政府或州政府的管理机构批准的，或在美国药典、欧洲药典或用于动物、更特别地用于人类的其它通常公认的药典中列出的。
如本文使用的术语“预防”、“防止”指全部或部分抑制个体中给定的疾病；全部或部分抑制个体中给定疾病或其相关症状的发展或疾病进程的发病。如本文使用的术语“副作用”涵盖治疗剂的不需要的作用和不良作用。不需要的作用并不一定是不良的。来自治疗剂的副作用可以是有害的或不舒服的或危险的。副作用的实例包括，但不限于鼻炎、腹泻、咳嗽、肠胃炎、喘气、恶心、呕吐、食欲缺乏、腹绞痛、发热、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、消化不良、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉作用、疲劳、口干燥和食欲不振、给药部位的皮疹或肿胀、流行性感冒样症状例如发热、发冷疲劳、消化道问题和过敏性反应。患者经受的另外不想要的作用很多，其都是本领域已知的。许多描述在 PhysiciaN’ s Desk Reference ( H 58 ^, 2004)中。术语“超声处理”指施用声能(例如超声粉碎)搅拌样品(例如微球)中微粒的作用。如本文使用的“增稳物”或“增稳化合物”指能够提高本文描述的组合物、靶配体和/或其它生物活性治疗因子的稳定性的任何物质，其包括，例如混合物、悬浮液、乳剂、分散剂、囊泡等。术语“干细胞”指具有自我更新和产生分化后代的能力的细胞。在某些实施方案中，干细胞是间充质干细胞。术语“粘着”或“聚集”指其中一种物体或制品(例如微球)紧密地物理接触一种或多种物体或制品，且在没有外部力量下不能与其它物体或制品分离的状态(例如聚集成块或整体)。在某些实施方案中，粘着或聚集的微球指例如由于明胶或明胶替代品引起紧密地物理接触一种或多种微球的微球。术语“未粘着”、“没有粘着”、“未聚集”或“没有聚集” 指没有紧密地物理接触或粘附的状态。在某些实施方案中，未粘着、没有粘着、未聚集、没有聚集的微球指基本上没有或完全没有与其它微球紧密地物理接触的微球。可以例如通过在显微镜下观察粘着微球在总数中的百分数。如本文使用的术语“个体”和“患者”可互换地使用。如本文使用的个体是包括施用如本发明提供的微粒的哺乳动物，例如非灵长类(例如母牛、猪、马、猫、狗、大鼠、兔子等)或灵长类(例如猴子和人类)。在某些实施方案中，所述患者需要治疗或控制疾病或其症状。在具体的实施方案中，个体是人类。如本文使用的术语“基本上球形”或“通常为球形”指接近理想球形的形状，其由呈现的最低外表面区域的体积定义。特别地，如本文使用的“基本上球形”指当查看所述微粒的任一个横截面(例如在显微镜下)时，平均大直径和平均小直径之间的差异为小于20%、 小于15%、小于10%、小于5%或小于1%。在某些实施方案中，本发明提供的微球的表面在放大至多1000倍，例如至多100倍、至多10倍、0倍或其范围下似乎是光滑的。术语“治疗剂”或“治疗药物”可以在本文中可互换地使用，其指递送到生物体内导管以产生期望的、通常是有益的作用的任何治疗活性物质。如本文使用的术语“治疗”指可以在控制、治疗和/或改善给定疾病或其相关症状中使用的任何方案、方法和/或试剂。在某些实施方案中，术语“治疗”指生物学疗法、支持疗法和/或本领域技术人员例如医务人员已知用于控制或治疗给定的疾病或其相关症状的其它治疗。如本文使用的术语“治疗”指减少或改善疾病或其症状的发展、严重性和/或持续时间。如本文使用的术语“超纯的”指与没有用外来化合物或物质稀释或混合的化合物或物质(例如，单体或单体单元)相比，含有非常低水平杂质的化合物或物质(例如，单体或单体单元)的状态。在某些实施方案中，所述杂质是盐。在某些实施方案中，存在于化合物或物质中的杂质水平可以表示为(％)；例如，超纯的单体或超纯的单体单元可以含有小于1%、小于2%、小于3%、小于4%、小于5%、小于6%、小于7%、小于8%、小于9%、小于 10%、小于15%、小于20%、小于25%的杂质或其任何范围。在某些实施方案中，通过溴化试验(参见，例如实施例3和6)测定杂质的水平。在其它的实施方案中，通过HPLC(参见例如实施例2和5)测定杂质的水平。术语“子宫纤维瘤”或“平滑肌瘤”指由某些类型的子宫肌纤维和纤维结缔组织组成的非癌性肿瘤。附图简述

图1A-1B显示单体纯度的比较。图IA显示对于从BioS印ra获得的给定批次DEAE 单体(T209，U088和U089)，使用溴化反应(右柱，如制造商BioSepra提供的)和HPLC (左柱)观察到的纯度灵敏性差异。图IB显示对于两种不同批次的三丙烯醛(从BioSepra获得的R似6和R402)，使用溴化反应(右柱)或HPLC (左柱)观察到的纯度灵敏性差异，数据以假定获得的重结晶三丙烯醛(TA-R)的纯度为100%表示，并且将其与重结晶(TA)之前来自SAFC的三丙烯单体比较。图2A-2C显示超声粉碎减少粘着性微球。图像分析显示超声粉碎显著减少粘着性微球。用方法没有观察到微球破碎。图2A显示未交联的微球，超声粉碎开始时的微球(左图)和超声粉碎15分钟后的微球(右图)。超声粉碎使粘着性微球的百分数从约7%降低至约0.2%。图2B显示交联后的微球，在交联之前没有用超声粉碎的微球(左图)，或在交联之前用超声粉碎的微球(右图)。在超声粉碎步骤之后，进行过筛。超声粉碎使粘着性微球的百分数从约3%降低至接近约0%。图2C显示交联之前的微球，超声粉碎开始时的微球(左图)和超声粉碎2X 15min.之后的微球(右图)。超声粉碎使粘着性微球的百分数从约9. 2%降低至约1.6%。图3A-3C显示在明胶交联之前(图3A)和之后(图3B)接受超声粉碎的粘着性微球的百分数。在超声粉碎步骤之后进行过筛，将筛上的体积量的百分数显示在图3C中。图4A-4G显示起始原料和微球的高分辨魔角自旋(HR-MAS) —维(1 谱。图 4A-D显示三丙烯醛GA)、明胶GB) ,MBA (4C)和DEAE丙烯酰胺0D)的HR-MAS —维1H谱。 图4E-4G显示三丙烯醛GE)、MBA (4F)和DEAE丙烯酰胺0G)的1H核的属性。图5A-5J显示由不同来源的物质制备的微球的一维1H NMR谱。图5A-5D显示样品SAFC FMP 128和PALL FMP 130的NMR谱。图5A是NMR谱的叠加，显示由该图谱鉴定的相应主峰(标记为A、B和C)之间的类似性。图5B显示在9-5ppm区域的NMR谱。图5C显示在5-0ppm区域的NMR谱。图OT显示在3. 4_1. 2ppm区域的NMR谱。图5E-5J显示样品 SAFC FMP 128、PALL FMP 130、FM0903031-M1675 和 FM0903021-M1654 的匪R 谱。图 5E 显示NMR谱的比较。图5F显示2. 6-1.5ppm的NMR谱。图5G显示在3. 4_1. 2ppm区域的谱图。 图5H显示在9-5ppm区域的NMR谱。图51显示所述谱图的叠加(图51)。图5J显示拆解重叠峰后的NMR谱。
图6显示示例性进料环处理的示意图。图7显示用于匪R分析的HR-MAS转子。详细说明在某些实施方案中，本发明提供的微球是对器官、组织和细胞无毒的，生物相容的，且利用其促进的细胞生长而粘附到植入部位的各种细胞和组织。另外，在某些实施方案中，这些微球是非吸收的和非生物降解的，因此，其是稳定的、持久性的，并且一旦植入期望的部位，将保持其一般形状和位置。在进一步的实施方案中，所述微球在悬浮液中也是稳定的，其允许微球或其它固体基质配制和贮存在悬浮液中，和用不同的液体注射。A.用于栓塞形成的微球在一个方面，本发明提供了微球，其包含(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物， 和(b)交联的明胶或明胶替代物。在另一个方面，本发明提供了微球，其包含(a)通过共聚 N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体制备的共聚物，和(b)交联的明胶或明胶替代物。在具体的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体(或单体单元)中的一个、两个或所有三个都是超纯的单体(或单体单元)。在某些实施方案中，所述微球在1H NMR谱中显示出第一个峰(例如，约3. 5ppm至约4ppm)、第二个峰(例如，约3ppm 至约3. 5ppm)和第三个峰(例如，约Ippm至约1. 5ppm)。在具体的实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比为约0. 50至约0. 65，和/或第三个峰与第一个峰的积分比为约0. 55至约0. 75 (例如，约0. 61至约0. 75)。在一个实施方案中，所述微球包含(a)包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、 二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物，和(b) 交联的明胶，其中所述微球在屮NMR谱中显示出约3. 5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm 至约3. 5ppm的第二个峰和约Ippm至约1. 5ppm的第三个峰；并且其中(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0. 50至约0. 65，(ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0. 55至约 0.75(例如，约0.61至约0.75)，或(iii) (i)和(ii)的组合。在另一个实施方案中，所述微球包含(a)通过共聚N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和 N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体制备的共聚物，和(b)交联的明胶；其中所述微球在屮NMR 谱中显示出约3. 5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3. 5ppm的第二个峰和约Ippm至约1. 5ppm的第三个峰；并且其中(i)第二个峰与第一个峰的积分比为约0. 50至约0. 65， (ii)第三个峰与第一个峰的积分比为约0. 55至约0. 75 (例如，约0. 61至约0. 75)，或(iii) (i)和(ii)的组合。在某些实施方案中，第一个峰在约3.77ppm，第二个峰在约3.2ppm，第三个峰在约1.3ppm，或其组合。在其它的实施方案中，第二个峰与第一个峰的积分比为约 0. 574，或者其中第三个峰与第一个峰的积分比为约0. 625。在某些实施方案中，当记录1H NMR谱(例如，在400MHz)时，所述微球在25°C下和/或在氘代溶剂中。在一些实施方案中，一个或多个所述单体(或单体单元)是超纯的单体(或单体单元)。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和/或N，N-亚甲基二 -丙烯酰胺单体各自是超纯的单体。在具体的实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体包含少于9%的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体包含少于2%的杂质(例如，如通过HPLC(参见，例如实施例2和5)或溴化试验(参见，例如实施例3和6)测定)。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体各自是超纯的单体。在一个实施方案中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体是超纯的单体，而所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在另一个实施方案中，所述 N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体各自是超纯的单体，而所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在某些实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体各自是超纯的单体，而所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在一个实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体，而所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述N，N-亚甲基二丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在另一个实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和所述 N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体各自是超纯的单体，而所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺不是超纯的单体。在一个实施方案中，所述N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体，而所述 N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体不是超纯的单体。在另一个实施方案中，所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体，当所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体不是。在仍然另一个实施方案中，所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺和二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体都是超纯的单体。在进一步的实施方案中，当认为必需时，可以通过引入例如但不限于烃链和/或亲水性电离化学基团改变这些单体的疏水性或离子特性，所述化学基团可以例如用于促进微球的药物-负载特性(例如，共聚物和药物之间的离子相互作用)。例如，在某些实施方案中，修饰所述单体或聚合物以增加酸性官能团(例如，向单体混合物加成丙烯酸钠或乙烯磺酸钠)，其可以例如与给定药物(例如，多柔比星或其它蒽环类)的胺官能团相互作用。在一个具体的实施方案中，所述单体是用磺酸酯基团修饰的。 在某些实施方案中，所述单体的含水量为约5%至约0%，例如小于等于约5%、小于等于约 4%、小于等于约3%、小于等于约2%或小于等于约1%。含水量可以使用本领域已知的方法例如NMR分析来测定。在一些实施方案中，所述明胶是交联的，例如交联到所述微球的共聚物或在其之内。在其它的实施方案中，所述明胶不是交联的。如本文使用的明胶可以来自任何来源。示例性的来源包括，但不限于从牛、猪和马的骨、结缔组织、器官和一些肠提取的胶原。在一个具体的实施方案中，所述明胶是猪明胶。在具体的实施方案中，所述明胶是药物和/或食品级明胶，其可以从市售供应商例如PB Leiner (Vilvoorde, Belgium)获得。在第二个方面，本发明提供了微球，其是通过包括如下步骤的方法制备的(a)制备包含(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，(ii) 二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)N， N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和(iv)明胶的水溶液，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和/或N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体是超纯的单体；(b) 将该水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相(例如油，例如矿物油，例如石蜡油)中； 从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二 -丙烯酰胺单体单元；(c)任选地超声处理该微球(例如，超声粉碎)；和(d)交联明胶。该方法的实施方案描述在下述部分C中。本发明提供的微球可以具有任何形状。在具体的实施方案中，这些微球的形状是基本上球形的。在某些实施方案中，所述微球是均勻的形状。在某些实施方案中，将提供的微球调整至某一大小范围。这样的调整可以使用本领域已知的方法获得，所述方法例如使用合适大小筛孔的进行一轮或多轮过筛。在某些实施方案中，本发明提供的微球的直径为约1 μ m至2000 μ m，例如约10 μ m 至 1000 μ m、约 40 μ m 至约 120 μ m、约 100 μ m 至约 300 μ m、约 300 μ m 至约 500 μ m、约 500 μ m 至约700 μ m、约700 μ m至约900 μ m或约900 μ m至约1200微米。这些直径可以使得通过多种途径经由导管、针(例如18标准规格或更小的针)、管等将所述微球递送到靶血管、组织或器官，所述途径包括血管、导管内、经食道、表皮下、皮下、粘膜下、经支气管或间质。在某些实施方案中，所述微球可以经由巨噬细胞或免疫系统或淋巴系统的其它成分消除。在某些实施方案中，所述微球具有均勻的大小。在某些实施方案中，所述微球具有均勻的大小，其中个体微球之间的直径差异为约O μ m至约100 μ m、约0 μ m至约50 μ m、或约0 μ m至约25 μ m,例如100 μ m以下、约50 μ m以下、约25mm以下、约IOmm以下、或约5 μ m 以下。在某些实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过68%具有的直径为平均直径的士20%、平均直径的士 10%、平均直径的士 15%、平均直径的士 10%、平均直径的士9%、平均直径的士8%、平均直径的士7%、平均直径的士6%、平均直径的士5%、平均直径的士4%、平均直径的士 3%、平均直径的士 2%或平均直径的士 1%、或其任何范围。 在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过70%具有的直径为平均直径的士20%、平均直径的士 10%、平均直径的士 15%、平均直径的士 10%、平均直径的士9%、 平均直径的士8%、平均直径的士7%、平均直径的士6%、平均直径的士5%、平均直径的士4%、平均直径的士 3%、平均直径的士 2%或平均直径的士 1%、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过75%具有的直径为平均直径的士20%、 平均直径的士 10%、平均直径的士 15%、平均直径的士 10%、平均直径的士9%、平均直径的士8%、平均直径的士7%、平均直径的士6%、平均直径的士5%、平均直径的士4%、平均直径的士3%、平均直径的士2%或平均直径的士 1%、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过80%具有的直径为平均直径的士20%、平均直径的士 10%、平均直径的士 15%、平均直径的士 10%、平均直径的士9%、平均直径的士8%、 平均直径的士 、平均直径的士6%、平均直径的士 5%、平均直径的士4%、平均直径的士3%、平均直径的士2%或平均直径的士 1%、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过85%具有的直径为平均直径的士20%、平均直径的士 10%、 平均直径的士 15%、平均直径的士 10%、平均直径的士9%、平均直径的士8%、平均直径的士7%、平均直径的士6%、平均直径的士5%、平均直径的士4%、平均直径的士3%、平均直径的士2%或平均直径的士 1%、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过90%具有的直径为平均直径的士20%、平均直径的士 10%、平均直径的士 15%、平均直径的士 10%、平均直径的士9%、平均直径的士8%、平均直径的士7%、平均直径的士6%、平均直径的士5%、平均直径的士4%、平均直径的士3%、平均直径的士2% 或平均直径的士 1 %、或其任何范围。在一个实施方案中，所述微球以如下群体存在，其中超过95%具有的直径为平均直径的士20%、平均直径的士 10%、平均直径的士 15%、平均直径的士 10%、平均直径的士9%、平均直径的士8%、平均直径的士7%、平均直径的士6%、平均直径的士 5%、平均直径的士 4%、平均直径的士 3%、平均直径的士 2%或平均直径的士 1%、或其任何范围。在一些实施方案中，小于1%、小于0.9%、小于0.8%、小于0.7%、小于0.6%、小于0.5%、小于0.4%、小于0.3%或少于0.2%、小于0. 或0% (或其范围)的微球群体在所述微球给定的扩展范围(例如，士50μπκ 士 100 μ m、士 150 μ m、士200 μ m、士250 μ m 或士300 μ m)之外。作为一个示例性的实例，如果调整后的微球群体的直径为500 μ m至 700 μ m (范围)，则扩展范围可以为例如士 100 μ m,例如其中99 %的微球具有的大小范围为400 μ m到800 ym,l%的微球的大小范围在扩展范围之外。在另一个示例性的实施方案中，所述范围为500μπι至700μπι，标准范围为600 μ m，其中80 %的群体具有标准范围的士 100 μ m( SP，扩展范围500μπι至700μπι)、99%的群体具有标准范围的士200 μ m(艮口， 扩展范围400 μ m至800 μ m)，0. 5 %至1 %的群体大于800 μ m,其余0 %至0. 5 %具有小于 400 μ m的群体(总共100% )。在某些实施方案中，所述标准范围为约50μπι至2000μπι， 例如 80 μ m、100 μ m、200 μ m、300 μ m、400 μ m、500 μ m、600 μ m、700 μ m、800 μ m、900 μ m、 1000 μ m、1100 μ m、1150 μ m、1200 μ m、1300 μ m、1400 μm、1500 μm、1600 μm、1700 μm、 1800 μ m、1900 μ m、2000 μ m 或其任何范围。所述微球在悬浮液中是稳定的，其允许微球或其它固体基质配制和贮存在悬浮液中，用不同的液体注射。更特别地，所述微球的亲水性性质允许将其置于悬浮液中，特别地， 其为无菌非致热或无热原可注射溶液的形式，而避免形成聚集体或粘附到贮存容器和植入装置例如导管、注射器、针等的壁。本发明提供的微球可以被例如通过注射植入到身体的各个部位。用于本发明提供的组合物和方法的聚合材料对组织和细胞无毒，并且是生物相容的，即通常不会引起炎症。 当植入期望的部位时，所述微球可以保持其一般形状和位置。本发明提供的微球是可压缩的，在具体的实施方案中，其可以经由18标准规格或更小的针注射。在某些实施方案中，所述微球是经由18标准规格或更小的针可注射的，且不能被免疫系统或淋巴系统清除，或减少被消除。在某些实施方案中，用促进细胞粘附的试剂涂布所述聚合物。在某些实施方案中，所述微球除了包含明胶或明胶替代物之外，还包含细胞粘附促进剂。可以使用本领域熟知的各种类型的细胞粘附促进剂。在某些实施方案中，所述细胞粘附促进剂选自胶原、明胶、羧甲基(CM)葡聚糖、DEAE葡聚糖、葡糖胺聚糖、纤连蛋白、 凝集素、聚阳离子(例如聚赖氨酸、壳聚糖)、任何其它天然的或合成的生物学细胞粘附试剂或其任意组合。在某些实施方案中，通过使粘合剂成网状增加微球的稳定性。在明胶的情况下，例如，帮助形成网状的试剂可以选自在明胶胺上反应的双官能团化学试剂(例如， 戊二醛、甲醛、乙二醛等)。在某些实施方案中，所述细胞粘附促进剂在微球或其它固体基材中的存在量为沉降的微球的约0. lg/ml至lg/ml。在某些实施方案中，由于例如进一步包含标记试剂，所述微球在光下和在体内是可见的。在某些实施方案中，所述微球可以在其合成之后进行标记。这可以通过例如接枝荧光标记物衍生物(包括，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明异硫氰酸盐(RITC)等)来进行。在某些实施方案中，可以通过用标记物化学偶合所述单体获得可检测的单体，所述标记物可以为使得所述微球能够直接显色的化学染料，例如Cikicron Blue或ftOcion Red HE-3B，磁共振成像试剂(铒、钆或磁铁矿)；造影剂，例如钡或碘盐，包括例如(丙烯酰氨基-3-丙酰胺基)-3-三碘-2，4，6-苯甲酸。在钡或磁铁矿盐的情况下，其可以直接以粉末形式引入初始单体溶液中。在一些实施方案中，造影剂是不透射线的造影剂，例如非离子造影剂。在某些实施方案中，在注射到患者之前、期间和/或之后，将造影剂与所述微球混合。 在一个具体的实施方案中，向患者施用造影剂(例如，非离子造影剂)和本发明提供的微球的组合物。可以通过亲和层析中熟知的化学偶合方法将细胞粘附促进剂或标记试剂引入到微球上。该引入也可以通过扩散到构成微球的凝胶网络之内，然后通过沉淀或化学交联将扩散的分子俘获在合适的位置来实现。在某些实施方案中，活细胞(例如干细胞)连接所述微球，在其中或其上与周围组织连接形成细胞层，其可以增强珠粒的长期稳定性。1. N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体N-三羟甲基甲基丙烯酰胺也可以被称为三丙烯醛，N- [1,3- 二羟基-2-(羟甲基) 丙-2-基]丙-2-烯酰胺；TRIS-丙烯酰胺；N-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺；N-丙烯醛基三(羟甲基)氨基甲烷；或N-丙烯酰基-三(羟甲基)氨基甲烷。在某些实施方案中， N-三羟甲基甲基丙烯酰胺定义为具有CAS登记号13880-05-2，分子式C7H13NO4,分子量约 175. 2克/摩尔，结构
权利要求
1.微球，其包含(a)共聚物，其包含N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元，和(b)交联的明胶，其中所述微球在1H NMR谱中显示在约3. 5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约 3. 5ppm的第二个峰和约Ippm至约1. 5ppm的第三个峰；并且其中(i)所述第二个峰与所述第一个峰的积分比为约0.50至约0. 65，(ii)所述第三个峰与所述第一个峰的积分比为约0.61至约0. 75，或(iii)⑴和( )的组合。
2.权利要求1的微球，其中所述第一个峰在约3.77ppm、所述第二个峰在约3. 2ppm、所述第三个峰在约1. 3ppm，或其组合。
3.权利要求1或2的微球，其中所述第二个峰与所述第一个峰的积分比为约0.574，或者其中所述第三个峰与所述第一个峰的积分比为约0. 625。
4.权利要求1至3中任一项的微球，其中当记录1HNMR谱时，所述微球在25°C下和/ 或在氘代溶剂中。
5.权利要求1至4中任一项的微球，其中在400MHz记录1H匪R谱。
6.权利要求1至5中任一项的微球，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体和N，N-亚甲基二 -丙烯酰胺单体中的一种、两种或三种是超纯的单体单元。
7.权利要求1至6中任一项的微球，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元包含小于9%的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元包含小于2%的杂质。
8.权利要求1至7中任一项的微球，其中所述微球的直径为约1μ m至约2000 μ m、约 40 μ m 120 μ m、@ 100 μ m 300 μ m、^ 300 μ m 500 μ m、^ 500 μ m 700 μ m、 ^ 700 μ m 900 μ m、g^J 900 μ m 1200 μ m。
9.一种制备微球的方法，其包括(a)制备包含下述成分的水溶液(i)N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体，( ) 二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体，(iii)N，N-亚甲基二-丙烯酰胺单体，和(iv)明胶，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体是超纯的单体；(b)在搅拌之前或搅拌同时，将所述水溶液加入到具有低水混容性的液体有机相中； 从而得到包含下述共聚物的微球，该共聚物含有N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺和N，N-亚甲基二 -丙烯酰胺单体单元；(c)任选地对该微球进行超声粉碎；和(d)交联明胶。
10.权利要求9的方法，其中经由进料环将所述水溶液加入到所述液体有机相中。
11.权利要求9或10的方法，其中所述N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元包含小于9%的杂质，和/或所述二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元包含小于2%的杂质。
12.权利要求9至11中任一项的方法，其中所述微球是超纯的微球。
13.权利要求12的方法，其中(i)所述超纯的微球包小于等于约10%、小于等于约 9 %、小于等于约8 %、小于等于约7 %、小于等于约6 %、小于等于约5 %、小于等于约4%、小于等于约3%、小于等于约2%或小于等于约的杂质，(ii)所述超纯的微球包含大于等于90%、大于等于91%、大于等于92%、大于等于93%、大于等于94%、大于等于95%、大于等于96%、大于等于97%、大于等于98%或大于等于99%重量的N-三羟甲基甲基丙烯酰胺、二乙基氨基乙基丙烯酰胺、N，N-亚甲基二-丙烯酰胺和明胶，或(iii) (i)和(ii)的组合。
14.权利要求9至13中任一项的方法，其中所述超声粉碎是在超声波浴中进行的。
15.权利要求9至14中任一项的方法，其中所述方法不包括过筛所述微球。
16.通过权利要求9至15中任一项的方法制备的微球。
17.权利要求16的微球，其中所述微球在1HNMR谱中显示在约3. 5ppm至约4ppm的第一个峰、约3ppm至约3. 5ppm的第二个峰和约Ippm至约1. 5ppm的第三个峰；和其中(i.)所述第二个峰与所述第一个峰的积分比为约0. 50至约0. 65，(ii.)所述第三个峰与所述第一个峰的积分比为约0. 61至约0. 75，或(iii.)其组合。
18.权利要求16或17的方法，其中所述微球是大小均勻的。
19.权利要求16至18中任一项的微球，其中所述微球的直径为约1μ m至约2000 μ m、 约 40 μ m 至约 120 μ m、约 100 μ m 至约 300 μ m、约 300 μ m 至约 500 μ m、约 500 μ m 至约 700 μ m、^J 700 μ m 900 μ m ^^ 900 μ m 1200 μ m。
20.权利要求16至19中任一项的微球，其中小于的微球是聚集的微球。
21.一种在个体中形成栓塞的方法，其包括向所述个体施用权利要求1至8或16至20 中任一项的微球。
22.—种控制或治疗个体中血管生成依赖性疾病的方法，其包括向该个体施用权利要求1至8或16至20中任一项的微球。
23.权利要求22的方法，其中所述血管生成依赖性疾病是动静脉畸形、子宫纤维瘤或良性前列腺肥大。
24.权利要求23的方法，其中所述血管生成依赖性疾病是癌症或肿瘤。
25.权利要求M的方法，其中所述癌症或肿瘤是肝癌或前列腺癌或肿瘤。
全文摘要
本发明提供了，例如微球，其包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。本发明还提供了制备微球的方法，所述微球包含明胶或明胶替代物和N-三羟甲基甲基丙烯酰胺单体单元、二乙基氨基乙基丙烯酰胺单体单元和N，N-亚甲基-二丙烯酰胺单体单元的共聚物。例如，本发明进一步提供了包含所述微球的组合物及所述微球和组合物的使用方法。
文档编号C08L33/24GK102232098SQ201180000296
公开日2011年11月2日 申请日期2011年1月26日 优先权日2010年1月27日
发明者皮埃尔·马里恩, 芭芭拉·德·吉奥阿尼斯, 菲力浦·雷博, 詹姆斯·克罗姆 申请人:生物领域医疗公司