本发明涉及微生物发酵生产方法，具体涉及利用双鞭甲藻菌株发酵生产含二十二碳六稀酸的混合油脂。
背景技术：
二十二碳六烯酸(cis-4,7,10，13,16，19-docosahexaenoicacid，DHA)是一种极其重要的ω-3系列的长链多不饱和脂肪酸，具有促进婴幼儿大脑发育、保护视力、预防和治疗心血管疾病和提高机体免疫能力等重要生理功能。目前DHA的商业来源主要是鱼油和微藻。国内鱼油的年产量约4万吨，经精炼提纯DHA含量达30％的鱼油，其价格在4-5万元/吨，进口鱼油为8万元/吨，而DHA微藻油价格为15-20万美元/吨。近几年由于国内鱼油质量不能满足保健品原料的需求以及鱼油资源大量衰减，国内鱼油的进口量明显上升，进而导致市售价格也相继走高，因此寻找微生物来源的DHA就显得日益迫切。而微藻DHA的市场份额在逐年快速上升，有取代鱼油DHA的趋势。但是由于DHA生产技术相对落后，规模小，因此提高DHA生产技术及品质，进军DHA微藻市场前景广阔。公开号为CN1986822A的专利公开了一种用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸的方法，其所公开的产量为海藻细胞中二十二碳六烯酸含量在30％-50％，获得的海藻细胞为20-40g/L，油脂含量为20-50％，DHA生产率为3.5g/(L·d)。公开号为CN101538592A的专利公开了一种用寇氏隐甲藻工业化发酵生产二十二碳六烯酸的方法，其所公开的最高产量为微藻细胞生物量51g/L，油脂含量为72％，DHA含量为55.3％，EPA含量为0.2％，DHA生产率为4.6g/(L·d)，这也是目前报道的采用寇氏隐甲藻生产DHA的最高生产水平。虽然其DHA生产率较之前的研究有了较大提高，但对于利用微藻进行工业化生产二十二碳六烯酸，大大降低其生产成本，提高单位产量，使微生物发酵产DHA的方法能够得到大力推广和普及使用还是远远不够的。公开号为CN102391955A的专利公开了一种双鞭甲藻的诱变筛选方法，其采用紫外+LiCl、硫酸二乙酯类对双鞭甲藻进行复合诱变，从而获得性能较优良的菌株，但这种诱变的长期遗传稳定性不高，菌株产DHA的产量不稳定，不适合工业化生产，同时，通过诱变的菌株的基因组可预测性不高，其产品产量均发生变化，这对后期的纯化提出了更高的技术要求，不适用于规模化的生产。
技术实现要素：
本发明所要解决的问题是提供一种用双鞭甲藻(Crypthecodiniumcohnii)为菌种，工业化发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，该方法能够低成本、大量生产绿色环保的高品质DHA油脂。本发明提供的技术方案是：用双鞭甲藻发酵生产DHA的方法，包括以双鞭甲藻为菌种，采用包括碳源、氮源和无机盐的培养基，通过溶氧调控策略发酵制得二十二碳六烯酸油脂(DHA)，具体如下：1)将双鞭甲藻菌株接入装有350mL培养基的2L摇瓶，在22-32℃的摇床中以180rpm的转速，培养20-30h；2)按照0.4-1％的接种量将摇瓶的菌种接入装有1m3培养基的2m3一级种子发酵罐中，培养温度22-32℃，通气量1-2vvm，压力0.02-0.05MPa，培养25-35h；3)按照1-3％的接种量将一级种子罐的菌种接入装有8m3培养基的15m3二级种子发酵罐中，培养温度22-32℃，通气量1-2vvm，压力0.02-0.05MPa，培养15-25h；4)按照1-3％的接种量将二级种子罐的菌种接入装有40m3培养基的100m3发酵罐中，培养温度22-32℃，压力0.02-0.05MPa，通气量1-2vvm，通过溶氧调控策略将DO控制在50％，整个发酵过程流加40％的氨水控制pH在6.0-7.0，过程中葡萄糖浓度维持在1-5g/L，流加碳源发酵培养60-80h，终止发酵，放罐，测定发酵液中细胞干重达70-110g/L，油脂含量达40-60％，DHA占总油脂含量为45-55％，DHA生产率最高可达8.7g/(L·d)。所述的菌种为双鞭甲藻为(Crypthecodiniumcohnii，ATCC30556)斜面保藏菌株。发酵培养基碳源中添加20％处理后的甘油。发酵过程中溶氧转速耦联控制DO在50％。一级种子、二级种子、发酵培养基中碳源包括葡萄糖、玉米浆粉、糖蜜、甘油和葡萄糖浆中的一种或多种，添加量为60g/L；氮源包括硫酸铵、大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、硝酸钠、谷氨酸钠中的一种或多种，添加量为5g/L。发酵培养基中添加的微量元素包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、赖氨酸、维生素B1、微生物B6、微生物B12中的一种或多种，当为其中一种时，添加量为0.001-0.01％；当为其中多种时，任意一种组分的添加量为0.001-0.005％。一级种子、二级种子、发酵培养基中添加的无机盐包括硫酸镁1.5g/L、氯化钾2g/L、氯化钠13g/L、氯化钙1.0g/L、磷酸二氢钾1.5g/L、磷酸氢二钾1.0g/L。。本发明应用溶氧调控策略来控制双鞭甲藻发酵从而生产DHA，所得DHA油脂产量高、纯度高，本发明的工艺技术指标均明显优于现有的工艺技术指标，有利于DHA的大规模工业化生产，同时，甘油为原料的添加也降低了DHA的生产成本，大大提高了DHA发酵生产的市场竞争力。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明作详细说明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1.30L发酵罐双鞭甲藻发酵生产DHA将新鲜的双鞭甲藻斜面菌种接入装有350mL培养基的2L摇瓶中培养48h，摇床转速180rpm，制备DHA种子液，菌体密度为8g/L。在30L发酵罐中，按3％的接种量将DHA种子液接入已消毒灭菌的培养基中，接后体积20L，罐压0.02MPa，初始搅拌转速120rpm，通气量1vvm，通过溶氧转速耦联将DO控制在50％左右，整个发酵过程流加40％的氨水控制pH在6.8左右，过程中流加碳源控制葡萄糖浓度在1-5g/L，培养68h后终止发酵，放罐。测定发酵液中细胞干重达84g/L，油脂含量达50％，DHA含量为46％，DHA生产率高达6.8g/(L·d)。以下表1为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果：表130L发酵罐发酵后所得混合油脂脂肪酸组成实施例2.100L发酵罐双鞭甲藻发酵生产DHA将新鲜的双鞭甲藻斜面菌种接入装有350mL培养基的2L摇瓶中培养48h，摇床转速180rpm，制备DHA种子液，菌体密度为7g/L。在100L发酵罐中，按3％的接种量将DHA种子液接入已消毒灭菌的培养基中，接后体积50L，罐压0.02MPa，初始搅拌转速120rpm，通气量1vvm，通过溶氧转速耦联将DO控制在50％左右，整个发酵过程流加40％的氨水控制pH在6.8左右，过程中流加碳源控制葡萄糖浓度在1-5g/L，发酵培养72h后终止发酵，放罐。测定发酵液中细胞干重达91g/L，油脂含量达50％，DHA占总油脂含量为49％，DHA生产率高达7.4g/(L·d)。以下表2为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果：表2100L发酵罐发酵后所得混合油脂脂肪酸组成实施例3.100m3发酵罐双鞭甲藻发酵生产DHA对双鞭甲藻进行工业化扩大培养，过程如下：将新鲜的双鞭甲藻斜面菌种接入装有350mL培养基的2L摇瓶中，28℃摇床培养48h，摇床转速180rpm，制备DHA种子液，菌体密度为9g/L。在一级种子罐中，按照0.4％的接种量将摇瓶中的DHA种子液接入已消毒灭菌的一级种子罐培养基中，通气量1vvm，压力0.02MPa，搅拌转速20Hz，培养30h，测定发酵液中细胞干重为5g/L。在二级种子罐中，按照3％的接种量将一级种子接入已消毒灭菌的二级种子罐培养基中，压力0.02MPa，搅拌转速25Hz，通气量1vvm，培养25h，测定发酵液中细胞干重为10g/L。在发酵罐中按照3％的接种量将二级种子接入已消毒灭菌的发酵罐培养基中，压力0.03MPa，搅拌转速30Hz，通气量1vvm，通过溶氧转速耦联将DO控制在50％左右，整个发酵过程流加40％的氨水控制pH在6.8左右，过程中流加碳源控制葡萄糖浓度在1-5g/L，发酵培养72h后终止发酵，放罐。测定发酵液中细胞干重达97g/L，油脂含量达54％，DHA占总油脂含量为50％，EPA含量低至0.1％，DHA生产率高达8.7g/(L·d)。以下表3为发酵后所得混合油脂脂肪酸组成气相分析结果：表3100m3发酵罐发酵后所得混合油脂脂肪酸组成以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。